Summary
骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular ユニット」の包括的な生体外の調査。
Abstract
(筋微小血管内皮細胞、MMEC) 骨格筋毛細血管の内皮細胞が血流や水分、栄養素、感染に対する免疫応答の交換を規制する骨格筋の間の障壁を構築します。免疫細胞の移動を制御することによってエージェント。これらの関数を MMEC 形成機能「myovascular ユニット」(MVU) さら細胞の種類、線維芽細胞、血管、骨格筋細胞などと。その結果、MMEC したがって、MVU の機能不全は様々 な myopathies に貢献します。しかし、MMEC の健康および病気の制御機構の理解が不十分なまま、その解明 myopathies より特定の処置の前に。分離と、MVU のコンテキストでプライマリ MMEC 関数の詳細な調査は可能性がありますこれらのプロセスのよりよい理解を促進します。
この記事は、浄化と文化保守手順などを含む機械と酵素の解離によって骨格筋のプライマリ マウス MMEC を分離するプロトコルを提供します。
Introduction
酸素、基板、その他の必要な分子血流を介して細胞や臓器を納入します。このインターチェンジは、毛細血管、最小の容器で行われます。毛細血管は、その整合性のまま血管内と間質性スペース間筋恒常性の正常な調節の前提条件内部内皮細胞 (EC) レイヤーによって形成されます。可溶性因子や細胞の選択的な移行を確保するため、EC はタイトで相互接続された単分子膜と単接合1を構成します。栄養素や代謝産物のための障壁としての役割のほか、EC は白血球炎症のプロセスの募集を調節します。炎症や組織の損傷は、EC の表面と白血球の添付ファイルとターゲット組織2に移住を促進するケモカインの製造接着分子のアップレギュレーションにつながります。その結果、EC 批判的に病原体または組織の修復に対する防御など炎症性プロセスの調節に関与しています。
EC の機能不全は直接血管疾患、慢性腎機能障害、静脈血栓症深刻な病原体感染症に関連付けられています。さらに、EC 事実上常に糖尿病や多発性硬化症3など臓器特異免疫に関与しています。血流や臓器間バリア機能したがって、異なる種類の細胞の協調的相互作用によって制御されます。骨格筋血管内皮細胞 (MMEC) 一緒に筋細胞、線維芽細胞と血管形成機能ユニット、「myovascular ユニット」(MVU).したがって、機能不全、MVU は筋疾患の病態に重要な役割を果たす可能性があります。しかし、これらの機構のより深い理解は依然行方不明、現在 myopathies の新しい、緊急に必要な治療標的の同定を排除します。
複雑な生理学的および病態生理学的メカニズムを調べるためには、動物モデルがよく使用されます。ただし、体外モデルは、さまざまな交絡因子を除外することによって関心の対象に焦点を当てることの利点を提供します。プロセスを調査するには、体外必要だ純粋な実行可能な一次電池を分離します。細胞株と対照をなしてトランスジェニック動物由来初代培養細胞は体外遺伝の修正の結果を調査する有効にします。
ここでは、プライマリ マウス MMEC を分離する方法は、機械と酵素の解離を磁気活性化細胞の浄化のための技術 (MCS) の並べ替え順を使用して説明します。この目的のため特定の表面マーカーに対して磁気ビーズを使用します。血小板内皮細胞接着分子-1 (PECAM1、CD31) EC の発現は、この型のセルを豊かに使用することができます。高い細胞純度を保証するには、造血起源の細胞は (PTPRC, CD45) 型受容体蛋白のチロシン脱燐酸化酵素 C の負の淘汰によって除外されます。さらに、品質管理、栽培プライマリ マウス MMEC、潜在的なアプリケーションの制限事項と注意事項が掲載されています。
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Protocol
すべての動物実験は自治体によって承認され、ドイツの動物福祉法 (84-02.05.20.13.097) に従って実施します。
1. 動物実験に関する総論
- それぞれの施設の動物ケアのガイドラインに従ってすべてのマウスの実験を行い、委員会を使用します。
- 実験動物科学連合 (FELASA) のための連合などの国際ガイドラインによると標準化された条件下でマウスを維持します。
注:一般的に年齢、性別、遺伝的背景の独立したマウスのこの分離方法を使用できます。十分な細胞数を得るためには、4-10 週古い男性が好ましい、年齢や性別と生物学的特性が異なるため。
2. ソリューション、メディアおよびコーティングの準備
- 200 μ L と 2.2 mL Dulbecco´s 変更イーグル培地 (DMEM) を混合することによって消化ソリューション (DS) を準備コラゲナーゼ当期と 45 μ デソキシリボ核酸 (DNase)。
- 50 ml の FCS DMEM (約 10%)、0.25 mL 塩基性繊維芽細胞増殖因子 bFGF (20 μ g/mL; 約 0.05%) の 450 mL を混合することにより血管内皮細胞用培地 (ECM) の 500 mL を準備します。5 mL ペニシリン-ストレプトマイシン (約 1%)。ガラス管の中の生殖不能のろ過を実行 (フィルター孔の直径: 0.2 μ m)。その後 4 ° C でソリューションを格納します。
-
下記のとおり細胞培養皿をコートします。
- 新鮮単離のプライマリ マウス MEC カバーの耕作のためよくセル 6 ウェルあたり 1 mL の全体の表面のゼラチン ベース速度コーティング液培養プレート (材料の表を参照してください) の部屋で 3-5 分の製造元の指示に従って温度 (RT)。
- 吸引し、コーティング液を破棄します。2 mL 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.1 から 7.5 2 連続洗浄ステップでの各ウェルを洗浄します。
- 吸引し、PBS を破棄します。ECM の 1 mL 量と井戸を埋めます。
3. プライマリ マウス筋微小血管内皮細胞 (MMEC) の分離
- 4-12 週間大人 1 人を安楽死させる頚部転位、麻酔なしで古い、男性マウス。目的は、すぐに動物を迅速かつ痛みのない死を提供するために脳から脊髄を分離することです。
- 四肢を切断します。
- 手術シャープ/鈍 (最先端 42 mm、ストレート) を使用して、シャープ/シャープ (最先端 23 mm、ストレート) シザー、ストレート (鋸歯状、2 mm x 1.25 mm x 12 cm) とカーブ (鋸歯状、1.3 mm x 1 mm x 13 cm) 鉗子。
- 70% エタノールですべての手術器具を消毒します。
- その背中に動物の位置、足 70% エタノールを湿らせた。シャープ/鈍外科はさみと股関節で切断することによって脚全体を断ちます。閉鎖細胞培養ディッシュ (35 mm × 10 mm) に四肢を配置します。
注:さあ今から滅菌層流フードの下ですべての手順を実行、滅菌器具を使用します。
- 筋肉組織を分離 (毛様体筋大腿四頭筋または両方の足から下腿三頭筋を優先的に使用)。
- シャープ シャープはさみとカーブタイプ鉗子を使用してヒップからつま先先端に開いている皮膚をカットします。ストレート ピンセットでつま先や足蹠を保持します。腰につま先からカーブタイプ鉗子で皮をはがします。
- 膝の腱を切断することによって毛様体筋大腿四頭筋を隔離し、股関節を大腿骨に沿って筋を断ちます。下腿三頭筋を分離するには、アキレス腱を切断します。以下、膝窩に脛骨に沿ってカットし、筋肉を削除します。
注:大型船 (A. 反射、 A. 前脛骨筋、後脛骨 A.、 A. fibularis) が分離された筋肉で表示されている場合は、血管内皮細胞による汚染を避けるために船を削除します。 - 大型船を削除するには、カーブタイプ鉗子を含まない大血管の筋肉の一部を押し船の横に切ってください。このプロトコルでは、1 g または大腿四頭筋、下腿三頭筋の両方に等しい以下の筋肉組織を推奨します。
- 2,445 μ DS (ステップ 2.1) から細胞培養ディッシュ (35 mm × 10 mm) を追加し、重量を決定します。
- 2445 μ DS を含むこの細胞培養皿にすべての筋肉の部分を転送し、重量を決定します。両方の測定値の差は、1 g を超えないようにする必要があります筋肉組織の乾燥重量を提供します。
- シャープ シャープはさみを使用して小さな断片 (2 mm 角、約 100 枚) に全体の筋組織をカットします。
- 筋肉組織を切り離して考えます。
注:このステップが約 120 分かかります。- 37 ° c (5% CO2インキュベーター) 1.5 h. ストア筋/DS サスペンションは、懸濁液 1 mL インスリン注射器を使用して約 5 分間、20 分ごとに慎重に混ぜます。
- 懸濁液を 50 mL のチューブに配置 70 μ m ナイロン セル ストレーナーに転送し、流れを収集します。DMEM の ml の 8 セル ストレーナーを洗浄し、流れを収集します。
- 20 ° C で 300 x gで 10 分間の細胞のストレーナー、遠心懸濁液を破棄します。上清を慎重に取り外します。
注意:ペレットは失いやすい。 - アンモニウム塩化カリウム (ACK) lysing バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します (材料のテーブルを囲む参照) 赤の血液細胞の換散のためインキュベートする 30 の右追加 9 mL DMEM で s + 10% と 15 mL t 反応と移動セル中断を停止する FCS宇部。
- CD45 を使い果たす+セル CD45 ビーズ メーカーの指示に従います。CD45 のすべての次の手順の+枯渇 MCS バッファーを使用 (材料のテーブルを囲まれているを参照してください)。
注:この手順は、約 60 分。- カウント部屋ノイバウアー細胞を使用して細胞の数を決定する (g 筋肉組織ごと約 5 x 10 の6セルを期待)。
- 4 ° C で 10 分間 300 × gで遠心分離機を懸濁液上清を完全に脱ぐし、90 μ L MCS バッファー (10 の7セルごとまたはそれ以下) で細胞ペレットを再懸濁します。CD45 ビーズ (10 の7セルごとまたはそれ以下) の 10 μ L を追加します。
- 細胞懸濁液を混合し、4 ~ 8 ° C で冷蔵庫の中に 15 分間インキュベート
- (10 の7セルごとまたはそれ以下) 1 mL MCS バッファーを追加します。300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心上清を完全に削除して 500 μ L MCS バッファー内の細胞を再懸濁します。
- 磁気細胞分離用 8 mL のタンク容量と最大 2 x 109の合計セルの容量大きな磁気列 (LMC) を使用します。区切り文字の磁場で、LMC を配置します。
- 3 mL の MCS のバッファーで、LMC の貯水池にすすいでください。洗浄した後、流れを収集する列の下の 15 mL の円錐管を配置します。列にセル全体の懸濁液 (500 μ L) を適用し、通すそれ完全に流れ。
- 貯水池に 3 mL の MCS のバッファーを追加することによって、列を 3 回洗浄し、洗浄の次のステップを実行する前に column´s 貯水池は空まで待ちます。
- 分離手順についてはさらに渡す列ラベルのセルを使用して収集 (、CD45 を表す分数- )。標識細胞 (、CD45 を表す+分画) に蓄積された列を破棄することができます。
- CD31 を蓄積+細胞次の CD31 ビーズ製造元の指示。CD31 のすべての次の手順の+蓄積 MCS バッファーを使用します。
注:この手順は、約 60 分。- 商工会議所を数えるノイバウアー セルを使用してセル数を決定する (期待する g 筋あたり約 4 x 106セル)。
- 遠心分離機は、4 ° C で 300 x gで 10 分間のステップ 3.5 からラベルのない細胞懸濁液を取得されました。
- 上清を完全に削除します。90 μ L MCS バッファーでペレットを再懸濁します、CD31 ビーズ (10 の7の合計セルごとまたはそれ以下) の 10 μ L を追加します。全体の懸濁液を混合し、4 ~ 8 ° C で冷蔵庫の中に 15 分間インキュベート
- 4 ° C で 10 分間 300 x gで 1 mL MCS バッファーと遠心分離機を追加します。上澄みを取るし、500 μ L MCS バッファーの細胞を再懸濁します。
- 磁気細胞分離用 3.5 mL のタンク容量と最大 2 x 108の合計セルの容量媒体磁気列 (MMC) を使用します。
- 区切り文字の磁場に MMC を置きます。MCS バッファーの 500 μ L で MMC をすすいでください。洗浄した後、流れを収集する列の下の 15 mL の円錐管を配置します。
- 列にセル全体の懸濁液 (500 μ L) を適用し、通すそれ完全に流れ。
- MCS バッファーの 500 μ L を追加することによって、列を 3 回洗浄し、洗浄の次のステップを実行する前に、列の貯水池が空まで待ちます。ラベル付けされていないセルの列を渡すことを表す、CD45- CD31-分数。品質管理強化のため保存します。
- 列区切り記号から削除して適切なコレクション チューブ (15 mL チューブ) の上に置きます。ピペット 2 mL MCS バッファー列に。しっかりと列にプランジャーを押すことにより磁気標識細胞をすぐにフラッシュします。この CD45- CD31+分数を表します豊かなプライマリ マウス EC
- 20 ° C で 350 x gで 5 分間遠心分離細胞懸濁液上清を完全に除去し、1 mL の ECM に (期待約 0.6 × 10 g 筋あたり6細胞) 細胞を再懸濁します (手順 2.2 を参照)。(ステップ 2.3) からコーティングの 6 ウェル培養プレートのよく、単一細胞 (0.5 〜 0.7 x 106細胞) を転送 ECM の 1 mL を含みます。
- 栽培、滅菌のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でセルを孵化させなさい。2、3 日おき、ECM を更新します。
4. プライマリ マウス MMEC 浄化
-
CD31 の 2 番目のサイクルを実行+蓄積、製造元の指示に従って (CD31 ビーズ マウス プロトコル; ステップ 3.6 を参照してください。)。
- (7 日間) の後で通常 80-90% の合流点では、セル/トリプシン EDTA 溶液をデタッチします。このため、連続洗浄の 2 つのステップで、2 mL 滅菌 pbs 各ウェルをすすいでください。6 ウェルあたり 800 μ L トリプシン/EDTA 溶液を使用し、1200 μ 10 %fcs の最小値を含む DMEM を使用して 37 ° C、5% CO2 3-5 分停止酵素活性の滅菌インキュベーターで孵化させなさい。
- 20 ° C で 350 x gで 5 分間細胞懸濁液を遠心分離します。
- 純度 (CD31 ビーズ manufacturer´s 指示に従って; 3.6 参照) を増加する 2 番目 CD31 MCS 手順実行します。
- 明るいフィールドを介して細胞合流または標準的な位相差顕微鏡を使用して観察、
20 倍の倍率と 0.35 レンズの開口数。図 1を参照してください。
注:セルをそれぞれ実験用または文化に継が保管できます。低い通路で速やかに実験用セルを使用します。通過した後セルを使用することは控える
8-10。
5. 品質管理
- 2 番目の CD31 MCS ステップ後のプライマリ マウス MMEC フローサイトメトリーを実行します。
- 1 mL の流れ cytometry (FC) バッファーを追加して FACS チューブを準備 (材料のテーブルを囲まれているを参照してください)。
- (14 日) の後で通常 100% の合流点では、セル/トリプシン EDTA 溶液をデタッチします。このため、連続洗浄の 2 つのステップで、2 mL 滅菌 pbs 各ウェルをすすいでください。6 ウェルあたり 800 μ L トリプシン/EDTA 溶液を使用し、1200 μ L を使用して, 3 – 5 分停止酵素活性の滅菌のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 10% の FCS を含む DMEM。
- · ノイバウアー商工会議所細胞数および準備の FACS チューブに 1 x 10 の5セルの最小値を追加を使用してセル数を決定します。
- 4 ° C で 300 x gで 10 分間遠心分離細胞懸濁液上清を除去し 1 mL FC バッファー内セルを再、4 ° C で 300 x gで 10 分間遠心分離して 2 つの洗濯の手順します。
- 抗マウス CD31 FITC 抗体 (1: 100) と抗マウス CD45 PE (1: 100) FC バッファーを追加することによって染色ミックスを準備します。
- FACS チューブでミックスを染色の 100 μ l 細胞を再懸濁します。4 ° C で 30 分間インキュベートします。FC バッファーの 1 つの mL を追加します。4 ° C で 300 × gで 5 分間遠心分離細胞懸濁液慎重に上清を除去し、FC バッファーの 200 μ L で細胞を再懸濁します。
- ゲートの戦略に従う流れの cytometer でメジャーのセルを図に示します。2 A。
- また 2 番目の CD31 MCS ステップ後プライマリ マウス MMEC の免疫蛍光染色を行います。
- コート、coverslips。
- 24 well プレートのウェルにガラス基板ラウンド滅菌 13 mm 径を転送します。スピード コーティング ソリューション ウェルあたりの 300 μ L を追加することによって coverslip をコートします。室温 (RT) で 3-5 分間インキュベートします。
- 吸引し、コーティング液を破棄します。2 連続洗浄ステップで 2 mL 滅菌 PBS の各ウェルを洗浄します。吸引し、PBS を破棄します。
- 種子 1 x 105 1 mL ECM、コート上で細胞し、細胞が 99% 合流まで滅菌のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。
- 固定および免疫組織染色法を実行します。
- 5.2.1.3 から培養細胞の ECM のメディアを削除します。
- まあ、4 ° C で 10 分間あたり 7.4 の pH を 300 μ L 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加することによって培養細胞を修正します。
注意:PFA は毒性があり注意して処理する必要があります。 - ウェルあたり 1 mL の PBS を追加することによって 3 の洗浄手順を実行し、室温 5 分後に上清を除去
- ブロッキング ソリューション含む 5 %bsa、PBS で 0.2% トリトン X と 1% ヤギ血清を準備します。
- 各ウェルにブロッキング液の 300 μ L を追加し、室温 1 時間インキュベート
- 上澄みを除去し、5 %bsa、PBS で 1% ヤギ血清中抗 PECAM 1 (CD31) 抗体 (レバレッジ) ウェルあたり 200 μ L を追加し、, 4 ° C で一晩。
- ウェルあたり 1 mL の PBS を追加および削除して手順を洗浄、培養上清中の各ステップで常温 5 分後 3 を実行します。
- 1 %bsa と PBS Cy3 標識抗ラット IgG 抗体 (1: 500) を含む二次抗体溶液を準備します。二次抗体の解決の井戸あたり 300 μ L を追加し、暗闇の中で RT で 1 時間インキュベートします。
- ウェルあたり 1 mL の PBS を追加および削除して手順を洗浄、培養上清中の各ステップで常温 5 分後 3 を実行します。
- ピンセットで慎重に丸いガラス coverslips を取り出し、顕微鏡スライド上に転送。細胞層の媒体含む DAPI をマウントの適切な量を追加し、慎重につけてカバー ガラス (囲まれた材料の表を参照してください)。
- 蛍光光源 (120 W) を搭載した適切な蛍光顕微鏡で細胞を観察し、2 つのフィルター セット: 励起/蛍光フィルター セット 550/25 nm と 605/70 nm 波長 Cy3 540/562 nm を検出します。
- 励起/蛍光波長 365/50 の設定 2 番目のフィルターを使用して nm と 445/50 nm DAPI 350/440 nm を検出します。40 倍の倍率を使用し、Cy3 の検出のため 30 さんの取得期間が DAPI の 14.5 mW/cm2の 80% の強度が 60 ms の取得期間が 67.5 mW/cm2の 80% を使用します。
- コート、coverslips。
- 量的な PCR を実行します。
- MRNA の隔離。
- チオシアン酸-フェノール (AGTP)、酸のための試薬を使用して mRNA を分離する標準的な手順に従います。CD45 の細胞 106 × 0.5 の最小値を使用して- CD31- (3.6.8 のステップを参照)、CD45- CD31+ (3.6.9 の手順を参照してください). 分数と栽培されているプライマリ マウス MMEC (4.1.3)
- 20 ° C で 300 x gで 10 分間遠心分離細胞懸濁液上清を完全に脱ぐ。2 mL の反応管に AGTP 試薬および転送細胞懸濁液 500 μ L に細胞ペレットを再懸濁します。右で 5 分間インキュベートします。
- 100 μ L のクロロホルムを加え室温 3 分間 15 s. 加温のため積極的に振る
- 4 ° C で 12,000 × gで 15 分遠心懸濁液
- 上水相 (RNA を含む) 慎重に離陸し、反作用の管を 1.5 mL に転送します。イソプロパノールの 250 μ L を追加し、室温 10 分間インキュベート
- 4 ° C で 10 分間、12,000 × gで遠心分離のステップを実行します。
- 上澄みを取るし、慎重に 75% エタノール 1 mL を加えます。7,500 × gで 4 ° C で 5 分間遠心します。
注:ペレットは、失いやすいです。 - 上清を完全に削除します。5-10 分のための空気の乾燥ペレットをしましょう。
注:エタノールが削除する必要がありますあまり乾燥しません。 - 30 μ L ジエチルピロカーボネート処理に水を含むと 55 ° C で 10 分間の熱でペレットを溶解します。
注:RNA 濃度・純度は、分光光度計で測定できます。
- CDNA 合成 (逆転写 PCR) を実行します。
- マスター ミックスを含む準備: 10 μ L の PCR バッファー (5 x)、2, 5 μ L desoxyribonucleosid-三リン酸 (dNTP (10 mM))、単一座礁させたプライマーの混合物をランダム 0.5 μ L (0.2 μ g/μ L)、RNase 阻害剤の 1 μ L (40 U/μ L、0.4 逆転写酵素 (200 U/μ L) と 5.6 μdiethylpyrocarbonat 処理水 (囲まれたを参照してください材料表)。
- 0.2 mL PCR チューブおよび全体の 20 μ L マスター ミックスを追加で 30 μ L ジエチルピロカーボネート処理水 500 ng の RNA を希釈します。
- 次の手順を実行する PCR サーマルサイクラーを使用: 4 ° C の 25 ° C、30 分 50 ° C、5 分 85 ° C 10 分押し
- MRNA の隔離。
- 量的な PCR (qPCR) を実行します。
注:重複またはトリプリケートの qPCR のサンプルを実行します。 - 2 つの異なる蛍光色素でプライマーを使用します。495 の吸収とプライマー nm と 517 の放出興味の遺伝子の nm。
- 衛星細胞マーカー遺伝子発現の検出、対ボックス タンパク質 7 のためのプライマー (Pax7) と M-カドヘリン (Cdh15) を使用 (材料のテーブルを囲まれているを参照してください)。
- 血管内皮細胞マーカー遺伝子発現の検出用プライマー クローディン-5 (Cld5)、オクルディン (Ocln) と精巣毛細血管 1 (Tjp1またはZO1) を使用 (囲まれたを参照してください材料表)。
- 18 歳の参照の遺伝子として rRNA、538 の吸収とプライマーを使用して nm と 554 nm 波長の放出。
- それぞれのプライマーで興味の各遺伝子の qPCR マスター ミックスを準備します。マスター ミックスが含まれています: 10µl qPCR バッファー (2 x) 興味 (10 μ M)、18 歳のプライマーの 1 μ L の遺伝子のプライマーの 1 μ L rRNA とヌクレアーゼ フリー水 4 μ。
- 96 ウェル反応板の単一の井戸に、マスター ミックスの 16 μ L を追加します。まあ、マスター ミックスを含むあたり (5.3.2 のステップから取得) cDNA の 4 μ L を追加します。
- 次の手順を実行するリアルタイム PCR サーマルサイクラーを使用: 1 分 10 分 40 サイクルでサイクリング ステージ 95 ° C 15 s と 60 ° C の 50 ° C 2 分および 95 ° C のステージを開催します。
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Representative Results
分離、プライマリ マウス MMEC と残留後 1 日他のセル コングロマリットを形成し、培養皿 (図 1 a 1 日目) の下部に付着します。7 日から平らで細長い細胞が観察できます。しかし、他、大抵回転楕円体セルの汚染はまだ目に見える (図 1 aの 7 日目)。したがって、CD31 正の選択を介してMCS は必要の別のサイクル。以下、プライマリ マウス MMEC は約 80-90% の密度に増殖します。合流時に彼らは通常縦一直線に並べられた細胞 (図 1 aの 14 日目) の非重複化単分子膜を形成します。接触阻害による合流点に増殖を停止します。約 14 日後 5-10 x 10 の5セルのすることができますさらに捜査のため使用します。
修正可能性色素 (死んだ細胞の染色) に FVD780 を用いたフローサイトメトリーによる品質管理 PECAM1 (CD31) と PTPRC (CD45、造血の起源の細胞のマーカーとして) は生存率と約 70% のセルに至るまで純度の両方の値を示した直後に分離 (図 2 a)。別 CD31 正の選択を介して後培われる細胞 MCS、95% まで各 (図 2 b) に至るまでの生存率は同様に純度の値を満たすことを示した。
選択の精度を評価するには、手順は、セルを取得さらに調べた筋衛星細胞マーカー遺伝子ペア ボックス タンパク質 7 の遺伝子発現 (Pax7) と M-カドヘリン (Cdh15) mRNA レベルで定量的 PCR (qPCR) による。プライマリ マウス MMEC (pmMMEC) と差別化されたプライマリ マウス筋細胞 (pmMC) は、それぞれ正と負の制御として使用されました。マウスの筋肉細胞は購入された商業的。案の定、CD45 のみ- CD31-の一部として、pmMC 表現Pax7 Cdh15、一方 CD45- CD31+プライマリ マウス MMEC (図 2) これらのマーカーは陰性であったと。
EC は、骨格筋エクスプレス タイト結合蛋白質4、5の筋内膜の毛細血管から派生します。QPCR、後 2 番目の CD31 MCS クローディン-5 (Cld5)、オクルディン (Ocln) と精巣毛細血管の 1 番 (Tjp1またはZO1) 合流プライマリ マウス MMEC の式を使用して、ステップを評価しました。PmMC はコントロール (図 2 D) として使用されました。プライマリ マウス MMEC pmMC のみ表示Tjp1の発現は低下に対しCld5 Ocln Tjp1、高レベルを示した。さらに、品質管理として染色蛍光抗体法は表面の内皮細胞特異的マーカー PECAM1 プライマリ マウス MMEC (図 2 e) の発現を確認しました。
図 1: プライマリ マウス MMEC の形態。(A) 1 に 14 の頃から位相差顕微鏡による培養プライマリ マウス MMEC の代表的なイメージ。d1 = d7 日 1 日 7、d14 を = = 14 日。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プライマリ マウス MMEC の品質管理。フローサイトメトリーによる解析プライマリ マウス MMEC 分離 (A) の直後に、15 日の (B) (I) の FSC/SSC、(II) FVD780 (IIIa) CD45、(IIIb) CD31 を使用するための戦略をゲート (破線アイソタイプ コントロールを =)。(C) 式Pax7の M 型カドヘリン (Cdh15) で CD45 レベル- CD31-、CD45- CD31+ MCS 分離を同様プライマリ マウス MMEC (pmMMEC)、プライマリ マウス筋細胞 (pmMC 後分数).表現のレベルは、n.d. ΔCt値 (サンプル - 18S rRNA)、として表示されます = 断固としたではないです。(D) 式タイト結合蛋白質クローディン 5 (Cldn5)、オクルディン (Ocln) または精巣毛細血管-1 (Tjp1またはZO 1) pmMMEC と ΔCtの値として示されている pmMC のレベル。(E) 蛍光抗体法 (赤) 栽培のプライマリ マウス MMEC 24 h 2 番目 CD31 の肯定的な選択の後で PECAM1 のために汚れます。核染色 DAPI を含む (ブルー) メディアをマウント。アンチ-PECAM1/DAPI、右 = 左: 負の制御/DAPI。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
微小血管内皮細胞は、すべての組織にバリア機能と関連臓器3疾患における機能不全成果を提供します。また、微小血管の EC の器官特定研究は新しい治療戦略の道を開く可能性があります。したがって、生理学的および病態生理学的条件下での微小血管の EC 機能のより深い理解は、偉大な科学的な関心です。白血球/血管内皮細胞の相互作用の変調はナタリズマブ、リンパ球の接着を防ぐ抗体の多発性硬化症患者を治療するために正常に使用し、それにより輪廻6。しかし、まだ炎症のサブタイプを含めて様々 な myopathies まま日付に不十分な治療のみ。したがって、骨格筋の血管内皮細胞では特に EC 性質の解明は、ミオパチーや新規治療法で結果に利用可能な治療を展開する助けることができます。
不死化血管内皮細胞 (といえども) は設立されいくつかの生体外モデルを使用します。これらの細胞は、不死化と増殖の速いためプライマリ血管 EC に比べていくつかの利点を提供しています。さらに、初代培養細胞は老衰を経るまたは失うといくつかの時間または通路の後、形態や生理機能を変更できます。ただし、といえどもにのみいくつかの血管内皮細胞の特性を維持し、ことはできません似て異なる臓器負担の主な血管 EC の様々 なノートでは、ほとんどの骨格筋から派生しています。日には、1 つのパブリケーションのみは TSM15 5という人間の骨格の微小血管内皮細胞ラインをについて説明します。対照的に、マウス血管 EC はこれまで記載されていません。最後に、トランスジェニック動物から初代培養細胞は、遺伝の修正の培養を研究する機会を提供します。ただし、一次電池文化はまた特定の落とし穴を保持します。まず、不要細胞の混入は、実験結果の妥当性の干渉することができます。したがって、いくつかの選択手順の正確さと単離細胞の高純度を保証されなければなりません。筋肉組織の解離後細胞を懸濁液では、赤血球や免疫細胞、衛星細胞、血管、線維芽細胞、血管内皮細胞7などの単核細胞を含まれています。したがって、CD31 MCS のステップの後の細胞画分は、専ら筋衛星細胞で発現するタンパク質を調べた。予想される CD45 として- CD31-率と主な筋肉細胞は、一方Pax 7とCdh15式を示した CD45- CD31+栽培プライマリ マウス MMEC が 2 番目の CD31 後これらのマーカーは陰性であったとMCS のステップ。さらに分離や培養細胞の品質管理は必然的に信頼性が高く、再現性のある実験を保証します。プライマリ マウス MMEC の品質管理のためのいくつかの方法があります: 顕微鏡形態学的性質、ほかフローサイトメトリー、PCR、蛍光抗体法染色の特徴的な EC マーカー (CD31、Sca 1) を使用できます。約 70% の生存率を検出できる新鮮単離プライマリ マウス MMEC の純度評価約 60-70% であっただけ。これらの細胞の顕微鏡観察は部分的に汚染細胞ペリサイト EC に接続されている線維芽細胞などで構成されたセル コングロマリットを示しています7 日後、主に平らで細長い細胞と回転楕円体の細胞を観察できます。しかし、2 つの CD31 MCS 通路は高い生存率と純度につながった。ピューロマイシンを含むメディアに失敗しましたの純度を増加する方法マウスに効果的でありながらプライマリ マウス MMEC で脳血管の EC 8。
微小血管 EC が得られるので毛細血管からタイト結合蛋白質を表現、 Cld5、 Oclnおよび筋肉細胞と比較してプライマリ マウス MMEC でTjp1の遺伝子発現を調べた。期待どおりにすべてのタイトな接合分子がプライマリ マウス MMEC で検出されました。比較では、 Cld5およびOcln発現とは決定できないに対し、筋細胞はTjp1、低発現のみを示した。類似の発現パターンを全くマウス骨格筋以前示した。ここでは、遺伝子、タンパク質レベルの式は、 Tjp1ではなく、 9・ オクルディン検出でした。さらに内皮の抵抗などの機能を測定すること。
ここに記述されたプロトコルはマウスの筋肉組織から血管の EC の分離のみを備えています。しかし、例えばラット血管 EC 副睾丸脂肪パッドに由来するため同様のプロトコルの出版された様々 な他種に転送可能性があります。ここでは、CD31 正の選択を介してMCS 密度勾配遠心法10が先行しました。同様のアプローチは、ラット大腿動脈11から大血管障害 EC 分離に成功しました。心臓と肺組織の微小血管の EC を分離する最近公開されたメソッドは、並べ替え12磁気細胞の抗原として CD31 と endoglin (CD105) を使用します。ただし、EC の純度さらに増やせませんでした追加 CD105 磁気ビードの分離を使用しています。別の可能性を特定し、プライマリ マウス MMEC を浄化は多色蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えです。Sca-1+、CD31 の異なる人口+、CD34薄暗いと CD45-マウスの筋肉細胞分離可能性があります、プライマリ マウス MMEC 13として特徴付けられました。この方法の利点は、直接使用または培養実験 (注に FACS つながりで高い細胞ストレスによる細胞死を増加する) ことができる純粋な EC 人口です。さらに、死んだ細胞や異なる種類の細胞集塊は大幅 FACS により分離細胞の数を減らすことができます。さらに、プライマリ マウス MMEC FACS により分離が 21% O2と 5% CO2の一般的に使用される培養条件で培養した失敗が報告されます。ここでは、酸素レベルは十分な栽培13の 5% に調整していた。また、FACS 法はより複雑な時間のかかる、インフラ前提条件は高い。
彼らは簡単にアクセスできる、十分な細胞数の分離に対して十分な大きさ、毛様体筋大腿四頭筋と 4-12 週齢の雄マウスの下腿三頭筋がプライマリ マウス メックの分離に最適 (× 10 5 105あたりグラムの筋肉)。したがって、条件の独立した実験で対等であることが保障されなければなりません。前述のように、細胞は老化を受けることができます。したがって、速やかに下の通路でそれぞれ実験用セルを使用します。通過後 8-10 プライマリ マウス MMEC はその形態を変更、低速増殖率を示す、脱分化と老化のための印として彼らの接触阻止を失います。
さらにこのプロトコル用のトラブルシューティングのいくつかのメモがあります。滅菌作業は、汚染を避けるために不可欠です。品質管理はモニター純度と単離細胞の生存に必要です。このプロトコルで使用される材料は、保存され、製造元の指示に従って適用する必要があります。追加、年齢や別の筋群と同様、使用される動物の性別可能性があります品質と影響実験で単離細胞の比較。
記述されていたプロトコルは、骨格筋の主な血管の EC を分離するプラットフォーム メソッドとして見なす必要があります。隔離されたセルは、さらに血筋肉バリア機能への洞察を得るためにいくつかのアプリケーションを使用できます。細胞は、タンパク質と RNA 発現研究と同様両方機能アッセイ (輪廻と密着性の研究を含む) に適しています。しかし、炎症性プロセスに焦点を当てて研究をこのプロトコルを最適化した、それ故にわずかな変更は、様々 な研究分野に関してが必要があります。
MVU 内複雑な空間と機能の携帯電話のやり取りをモデル化するには、プライマリ マウス MMEC 一緒に他のセルタイプより複雑な 3 D 細胞培養システム培養できます。前向き、 14の前に他の組織を説明しているように MVU オルガノイドを生成でく必要があります。ただし、プライマリ マウス MMEC の正常な分離はこの次のステップを目指すため避けられないです。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
この作品によって、「他 Kröner ・ フレゼニウス財団」を受けました (TR に 2018_A03)、"革新的なこの上海虹橋 (IMF) ミュンスター"(私-RU211811 TR) とドイツ研究振興協会 (DFG、INST 2105/27-1、私 3283/5-1、と私 3283/6-1 SGM に).イラスト画像は、平家 Blum によって提供されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
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