Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering av primære Murine Skjelettmuskel mikrovaskulær endotelceller

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Mikrovaskulær endotelceller i skjelettmuskulatur (MMEC) form indre veggen av muskel kapillærene og regulere begge, utveksling av væsker/molekyler og migrering av () immunceller mellom muskelvev og blod. Isolering av primære murine MMEC, kan som beskrevet her, omfattende i vitro undersøkelser av"myovascular".

Abstract

Endotelceller i skjelettmuskulatur kapillærene (muskel mikrovaskulær endotelceller, MMEC) bygge opp barrieren mellom blod og muskler regulere utveksling av væsker og næringsstoffer, samt immunrespons mot smittsomme agenter ved å kontrollere immun celle migrasjon. For disse funksjonene, MMEC danne en funksjonell "myovascular enhet" (MVU), med ytterligere celletyper, for eksempel fibroblaster, pericytes og skjelettlidelser muskelceller. Derfor bidrar en dysfunksjon av MMEC og derfor MVU til et stort utvalg av myopathies. Imidlertid regulatoriske mekanismer for MMEC i helse og sykdom fortsatt utilstrekkelig forstått og deres forklaring foran mer spesifikke behandlinger for myopathies. Isolasjon og grundig undersøkelse av MMEC hovedfunksjoner i sammenheng med MVU kan gjøre en bedre forståelse av disse prosessene.

Denne artikkelen inneholder en protokoll for å isolere primære murine MMEC av skjelettmuskelen av mekanisk og enzymatiske dissosiasjon inkludert rensing og kultur vedlikehold trinn.

Introduction

Via blodbanen, cellene og organene leveres med oksygen, underlag og andre nødvendige molekyler. Denne utveksling foregår i kapillærene, minste fartøyene. Kapillærene er dannet av en indre endothelial celle (EC) lag som har integritet forblir en forutsetning for vellykket regulering av muskel homeostase mellom intravascular og interstitielle rommet. For å sikre en selektiv overgang av løselig faktorer og celler, EC utgjør en monolayer forbundet med fast og adherens veikryss 1. Foruten sin rolle som barriere for næringsstoffer eller metabolske produkter, EU regulere rekruttering av leukocytter i inflammatoriske prosesser. Betennelse eller vev skade fører til en opp-regulering av vedheft molekyler på EC overflaten og produksjon av chemokines tilrettelegge leukocytter vedlegg og transmigration i målet vev 2. Derfor EF er kritisk involvert i regulering av inflammatoriske prosesser som forsvar mot patogener eller reparasjon av vev.

En dysfunksjon av EC er direkte forbundet med vaskulær sykdom, kronisk nyresvikt, venetrombose alvorlig patogen infeksjoner. Videre EC er nesten alltid involvert i organ-spesifikke autoimmunitet som diabetes mellitus eller multippel sklerose 3. Funksjonen barriere mellom blod og organer er derfor styrt av et felles samspill mellom forskjellige celletyper. I skjelettmuskulatur mikrovaskulær endotelceller (MMEC) sammen med muskelceller, fibroblaster og pericytes utgjør en funksjonell enhet, "myovascular enhet" (MVU). Derfor kan en dysfunksjon av MVU spiller en avgjørende rolle i Patofysiologien ved myopathies. Men en dypere forståelse av disse regulatoriske mekanismene mangler fortsatt og nå utelukker identifisering av nye, presserende behov, terapeutiske mål i myopathies.

For å undersøke de komplekse fysiologiske og patofysiologiske mekanismene, brukes dyremodeller. Men tilbyr i vitro modeller fordelen med å fokusere på motivet av interesse ved å ekskludere en rekke forvirrende faktorer. Undersøke prosesser i vitro er det nødvendig å isolere ren og levedyktig primære celler. I motsetning til cellelinjer kan primær celler isolert fra transgene dyr undersøke konsekvensene av genetiske modifikasjoner i vitro.

Her er en metode for å isolere primære murine MMEC beskrevet ved hjelp av mekanisk og enzymatiske dissosiasjon etterfulgt av magnetiske aktivert celle sortering teknikker (MCS) for rensing. For dette formålet brukes magnetiske perler mot bestemte overflate markører. Blodplater endothelial celle vedheft molekyl-1 (PECAM1, CD31) er hovedsakelig uttrykt i EU og kan brukes til å berike denne celle type. For å garantere høyt renhet, utelates celler blodkreft opprinnelse som en negativ utvalg for protein tyrosin fosfatase reseptor type C (PTPRC, CD45). Videre presenteres kvalitetskontroll, dyrking av primære murine MMEC, potensielle og begrensninger i tillegg til spesielle hensyn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av lokale myndigheter og følge tysk dyrevelferd handling (84-02.05.20.13.097).

1. generelle bemerkninger om dyreforsøk

  1. Utfører alle mus eksperimenter i henhold til veiledning av respektive institusjonelle dyr omsorg og bruke komiteen.
  2. Holde mus under standardiserte forholdene og internasjonale retningslinjer som Federation for laboratoriet dyr Science foreninger (FELASA).
    Merk: Generelt kan denne isolasjon teknikken brukes til mus uavhengig av alder, kjønn eller genetisk bakgrunn. For å få en tilstrekkelig celle nummer, foretrekkes 4-10 uke gamle menn, fordi biologiske egenskaper kan variere med alder og kjønn.

2. utarbeidelse av løsninger, Media og belegg

  1. Forberede fordøyelsen løsning (DS) ved å blande 2,2 mL av Dulbecco´s endret Eagle Medium (DMEM) med 200 μL Collagenase-Dispase og 45 μL Desoxyribonuclease (DNase).
  2. Forberede 500 mL Endothelial celle medium (EFM) ved å blande 450 mL DMEM med 50 mL FCS (ca 10%), 0,25 mL grunnleggende fibroblast vekst faktor bFGF (20 μg/mL, omtrent 0,05%) og 5 mL penicillin-streptomycin (ca 1%). Utføre sterilt filtrering i et glassrør (diameter på filteret porene: 0,2 μm). Etterpå lagre løsningen på 4 ° C.
  3. Coat celle kultur plater som beskrevet nedenfor.
    1. For dyrking av fersk isolert primære murine MEC dekker hele overflaten med 1 mL per brønn en 6 vel celle kultur plate med en gelatin basert hastighet belegg løsning (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner for 3-5 minutter på rommet temperatur (RT).
    2. Sug opp og kast belegg løsning. Skyll hver brønn med 2 mL steril fosfat bufret saltvann (PBS), pH 7.1-7.5 i to påfølgende vask trinn.
    3. Sug opp og kast PBS. Fyll opp brønner med 1 mL volumet av ECM.

3. isolering av primære Murine muskel mikrovaskulær endotelceller (MMEC)

  1. Euthanize en voksen 4-12 uker gamle, mannlige musen av cervical forvridning uten noen anestesi. Målet er å raskt skille ryggmargen fra hjernen for å gi dyret med en rask og smertefri død.
  2. Sever ekstremiteter.
    1. Bruke en kirurgisk skarp/stump (cutting edge 42 mm, rett) og skarp/skarpe (cutting edge 23 mm, rett) saks, en straight (taggete, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) og en buet (taggete, 1.3 mm x 1 mm x 13 cm) tang.
    2. Desinfiser alle kirurgiske instrumenter med 70% etanol.
    3. Plassere dyret på ryggen, fukte Ben med 70% etanol. Sever hele benet ved å kutte på hofteleddet med skarp/blunt kirurgisk saks. Plass ekstremiteter i en lukket celle kultur parabol (35 mm x 10 mm).
      Merk: Fra nå av hvert trinn under sterilt laminær strømning hette og fungerer med steriliserte instrumenter.
  3. Isolere muskelvev (fortrinnsvis bruk musculus quadriceps femoris eller musculus triceps surae fra begge beina).
    1. Kutt huden åpen fra hoften toe-spissen med en skarp/skarp saks og buede tang. Hold toe eller footpad med rett tang. Løsner huden med buet Tang fra tåen til hip.
    2. Isoler musculus quadriceps femoris ved å kutte senen fra kneet og bryte muskelen langs femur til hip. Isolere musculus triceps surae ved severing av akillessene. Heretter, kutt langs tibia til femoral fossa og fjerne muskelen.
      Merk: Hvis store fartøy (A. femoralis, A. tibialis fremre, A. tibialis bakre, A. fibularis) vises i isolerte muskler, fjerne fartøy for å unngå forurensning av macrovascular endotelet.
    3. Du fjerner store fartøy, holder delen av muskel ikke inneholder store skip med en buet tang og kutt den av ved siden av fartøyet. For denne protokollen anbefales 1 g eller mindre muskelvev lik både quadriceps femoris og triceps surae .
    4. Legg 2,445 µL DS (fra trinn 2.1) til en celle kultur parabol (35 mm x 10 mm), og fastslå vekten.
    5. Overføre alle muskel brikker til denne cellen kultur parabol med 2445 µL DS og fastslå vekten. Forskjellen på begge målte verdier gir tørrvekt av muskelvev som ikke må overstige 1 g.
    6. Skåret i hele muskelvev i små biter (≤2 mm kuber, ca. 100 deler) ved hjelp av sharp/skarp saks.
  4. Distansere muskelvev.
    Merk:     dette trinnet tar ca 120 min.
    1. Store muskel/DS suspensjon på 37 ° C (inkubator med 5% CO2) i 1,5 h. Bland suspensjon nøye hvert 20 min i ca 5 min bruker en 1 mL insulinsprøyte.
    2. Overføre suspensjon til en 70 μm nylon celle sil plassert på en 50 mL tube og samle flyten gjennom. Vask celle silen med 8 mL DMEM og samle flyten gjennom.
    3. Forkaste celle sil og sentrifuger suspensjon for 10 min på 300 x g ved 20 ° C. Fjern forsiktig nedbryting.
      Forsiktig: pellets er lett å miste.
    4. Resuspend celle pellet i 1 mL av en Ammonium klor kalium (ACK) lysing buffer (se vedlagte Tabell for materiale) for lysis av røde blodlegemer og Inkuber for 30 s på RT. legge 9 mL DMEM + 10% FCS stoppe reaksjon og overføre celle suspensjon til en 15 mL-t Ube.
  5. Tømme CD45+ celler etter CD45 microbeads produsentens instruksjoner. For alle følgende av CD45+ uttømming bruke MCS buffer (se vedlagte tabell for materiale).
    Merk:     dette trinnet tar ca 60 min.
    1. Finne ut celle tall ved hjelp av en Neubauer celle teller kammer (forventer ca 5 x 106 celler per g muskelvev).
    2. Sentrifuger suspensjon på 300 x g i 10 min på 4 ° C. Ta av nedbryting helt og resuspend celle pellet 90 µL MCS buffer (per 107 celler eller mindre). Legge til 10 μL CD45 microbeads (per 107 celler eller mindre).
    3. Bland celle suspensjon og ruge i 15 min i kjøleskapet på 4-8 ° C.
    4. Legg 1mL MCS buffer (per 107 celler eller mindre). Sentrifuger 300 x g i 10 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting helt og resuspend celler i 500 μL MCS buffer.
    5. Bruk en stor magnetisk kolonne (LMC) med et reservoar volum 8 ml og en kapasitet på opptil 2 x 109 totalt celler for magnetisk celle separasjon. Plasser LMC i magnetfeltet av separatoren.
    6. Skyll med 3 mL MCS buffer i reservoaret av LMC. Etter skylling, kan du plassere en 15 mL konisk rør under kolonnen samle strømme gjennom. Bruke hele cellen suspensjon (500 µL) på kolonnen og la det helt flyte.
    7. Vask kolonnen tre ganger ved å legge til 3 mL MCS buffer i reservoaret og vente til column´s tanken er tom før du utfører neste vask trinn.
    8. Samle umerkede cellene passerer kolonnen bruker for ytterligere separasjon trinnene (som representerer CD45- brøkdel). Merket celler (som representerer CD45+ brøkdel) akkumulert i kolonnen kan kastes.
  6. Samle CD31+ celler følgende CD31 microbeads produsentens instruksjoner. For alle følgende av CD31+ akkumulering bruke MCS buffer.
    Merk:     dette trinnet tar ca 60 min.
    1. Bestemme celle nummer ved hjelp av en Neubauer celle teller kammer (forventer ca 4 x 106 celler per g muskelvev).
    2. Sentrifuger Hentet umerkede celle suspensjon i trinn 3.5 for 10 min på 300 x g på 4 ° C.
    3. Fjerne nedbryting helt. Resuspend pellet i 90 μL MCS bufferen og legge 10 μL CD31 microbeads (per 107 totalt celler eller mindre). Bland hele suspensjon og ruge i 15 min i kjøleskapet på 4-8 ° C.
    4. Legge 1mL MCS buffer og sentrifuger på 300 x g i 10 min på 4 ° C. Ta av nedbryting og resuspend celler i 500 µL MCS bufferen.
    5. For magnetisk celle separasjon bruke en middels magnetiske kolonne (MMC) med et reservoar volum på 3,5 mL og en kapasitet på opptil 2 x 108 totalt celler.
    6. Plasser MMC i magnetfeltet av separatoren. Skyll MMC med 500 µL MCS bufferen. Etter skylling, kan du plassere en 15 mL konisk rør under kolonnen samle strømme gjennom.
    7. Bruke hele cellen suspensjon (500 µL) på kolonnen og la det helt flyte.
    8. Vask kolonnen tre ganger ved å legge 500 µL MCS bufferen og vent til kolonnen reservoaret er tom før du utfører neste vask trinn. Umerkede cellene passerer kolonnen representerer CD45- CD31- brøkdel. Lagre dem for ytterligere kvalitetskontroll.
    9. Fjerne kolonnen fra skilletegnet og plassere den på en egnet samling rør (15 mL tube). Pipetter 2 mL MCS buffer på kolonnen. Umiddelbart skylle ut magnetisk merket cellene ved å skyve stempelet fast i kolonnen. Denne CD45- CD31+ brøkdel representerer beriket primære murine EF
    10. Sentrifuger celle suspensjon for 5 min på 350 x g ved 20 ° C. Fjerne nedbryting helt og resuspend celler (forvente rundt 0,6 x 106 celler per g muskelvev) i 1 mL ECM (se trinn 2.2.). Overføre celler (0,5-0,7 x 106 celler) til en enkelt brønn av en belagt 6-vel kultur plate (fra trinn 2.3) som inneholder 1 mL av ECM.
  7. Dyrking av ruge cellene på 37 ° C og 5% CO2 i et sterilt inkubator. Oppdater ECM hver to til tre dager.

4. primære Murine MMEC rensing

  1. Utføre en andre syklus av CD31+ opphopning, følg produsentens instruksjoner (CD31 microbeads mus protokollen, se trinn 3.6.).
    1. Koble celler med Trypsin/EDTA løsning når de er på 80-90% samløpet (vanligvis etter 7 dager). For dette, skyll hver brønn med 2 mL steril PBS, i to påfølgende vask trinn. Bruk 800 μL Trypsin/EDTA løsning per 6-brønn og ruge på 37 ° C og 5% CO2 i et sterilt inkubator for 3-5 min. stopp enzymatisk aktivitet ved hjelp av 1200 μL DMEM med minst 10% FCS.
    2. Sentrifuge celle suspensjon i 5 min på 350 x g ved 20 ° C.
    3. Utfør andre CD31-MCS trinn for å øke renhet (ifølge CD31 microbeads manufacturer´s instruksjoner, se 3.6.).
    4. Observere celle samløpet via lyse eller standard kontrast mikroskopi å en
      20 x forstørrelse og 0,35 numeriske blenderåpning. Se figur 1.
      Merk: Cellene kan brukes for respektive eksperimenter eller holdt i kultur av passaging. Bruke celler for eksperimenter umiddelbart i lavere passasjer. Det anbefales ikke å bruke celler etter passasje
      8-10.

5. kvalitetskontroll

  1. Utføre flowcytometri av primære murine MMEC etter andre CD31-MCS-trinn.
    1. Forberede en FACS rør ved å legge til 1 mL flyt cytometri (FC) buffer (se vedlagte Tabell for materiale).
    2. Koble celler med Trypsin/EDTA løsning når de er på 100% samløpet (vanligvis etter 14 dager). For dette, skyll hver brønn med 2 mL steril PBS, i to påfølgende vask trinn. Bruk 800 μL Trypsin/EDTA løsning per 6-brønn og ruge på 37 ° C og 5% CO2 i et sterilt inkubator for 3-5 min. stopp enzymatisk aktivitet ved hjelp av 1200 μL DMEM inneholder 10% FCS.
    3. Bestemme celle nummer ved hjelp av en Neubauer celle telle kammer og legge til minst 1 x 105 celler forberedt FACS røret.
    4. Sentrifuger celle suspensjon for 10 min på 300 x g på 4 ° C. Utføre to vask trinn ved å fjerne nedbryting, resuspending celler i 1 mL FC buffer og sentrifugering i 10 min på 300 x g på 4 ° C.
    5. Forberede en flekker blanding ved å legge til anti-mus CD31-FITC antistoff (1: 100) og anti-mus CD45-PE (1: 100) med FC buffer.
    6. Resuspend celler i 100 μL flekker blanding i FACS rørene. Inkuber i 30 min på 4 ° C. Legg 1 mL av FC buffer. Sentrifuger celle suspensjon for 5 min på 300 x g på 4 ° C. Nøye fjerne nedbryting og resuspend celler i 200 μL FC bufferen.
    7. Måle celler i en flyt cytometer følgende gating strategien er vist i figur. 2A.
  2. Du kan også utføre immunofluorescence farging av primære murine MMEC etter andre CD31-MCS-trinn.
    1. Coat coverslips.
      1. Overføre sterilt 13 mm diameter runde glass dekkglassvæske til et godt av en 24 godt plate. Lag dekkglassvæske ved å legge til 300 µL av hastighet belegg løsning per brønn. Inkuber for 3-5 minutter ved romtemperatur (RT).
      2. Sug opp og kast belegg løsning. Skyll hver brønn med 2 mL steril PBS i to påfølgende vask trinn. Sug opp og kast PBS.
      3. Frø 1 x 105 celler i 1 mL ECM på belagt dekkglassvæske og ruge på 37 ° C og 5% CO2 i et sterilt inkubator til celler er 99% confluent.
    2. Utføre fiksering og immunofluorescence flekker.
      1. Fjern ECM mediet dyrket celler fra 5.2.1.3.
      2. Fastsette kulturperler celler av tilføyer 300 µL 4% paraformaldehyde (PFA) med pH på 7,4 per brønn, i 10 minutter på 4° C.
        Forsiktig: PFA er giftig og må håndteres med forsiktighet.
      3. Trinnene 3 vask ved å legge til 1 mL PBS per brønn og fjerne nedbryting etter 5 min på RT.
      4. Forberede en blokkering løsning som inneholder 5% BSA, 0,2% Triton-X og 1% geit serum i PBS.
      5. Legger 300 µL av blokkering løsning i hver brønn og ruge 1t på RT.
      6. Fjerne nedbryting og legge 200 µL per brønn av et anti-PECAM-1 (CD31) antistoff (1:200) i 5% BSA, 1% geit serum i PBS og ruge på 4 ° C over natten.
      7. Utføre 3 vaske trinn ved å legge 1 mL PBS per brønn og fjerne supernatant etter 5 min på RT i hvert trinn.
      8. Forberede en sekundær antistoff løsning som inneholder Cy3-konjugerte anti-rotte IgG antistoff (1:500) i 1% BSA og PBS. Legger 300 µL per brønn av sekundær antistoff løsningen og ruge 1t på RT i mørket.
      9. Utføre 3 vaske trinn ved å legge 1 mL PBS per brønn og fjerne supernatant etter 5 min på RT i hvert trinn.
    3. Ta ut den runde glass coverslips nøye med tang og overføre den til et mikroskopi lysbilde. Legg til en passende mengde montering medium som inneholder DAPI på cellen laget og nøye sette et cover glass på det (se vedlagt Tabell for materiale).
    4. Observere celler med en passende fluorescens mikroskop utstyrt med fluorescens lyskilde (120 M) og to filtrere sett: en eksitasjon/utslipp filteret satt med 550/25 nm og 605/70 nm bølgelengder å oppdage Cy3 540/562 nm.
    5. Bruke filtere andre sett med en eksitasjon/utslipp bølgelengde 365/50 nm og 445/50 nm å oppdage DAPI 350/440 nm. Bruke en forstørrelse på 40 x og 80% intensitet av 14,5 mW/cm2 for DAPI med oppkjøpet varighet av 30 ms. For gjenkjenning av Cy3 bruke 80% av 67.5 mW/cm2 med oppkjøpet varighet på 60 ms.
  3. Utføre kvantitativ PCR.
    1. Isolering av mRNA.
      1. Følg standard prosedyrer ved hjelp av en syre guanidinium thiocyanate-fenol (AGTP)-reagens isolere mRNA. Bruk minst 0,5 x 106 celler fra CD45- CD31- (se trinn 3.6.8), CD45- CD31+ (se trinn 3.6.9.) brøker og dyrket primære murine MMEC (4.1.3)
      2. Sentrifuger celle suspensjon for 10 min på 300 x g ved 20 ° C. Ta av nedbryting helt. Resuspend celle pellet i 500 µL av AGTP reagens og overføre celle suspensjon i en 2 mL reaksjon rør. Inkuber i 5 min på RT.
      3. Legg 100 µL av kloroform og rist kraftig for 15 s. Incubate i 3 minutter på RT.
      4. Sentrifuger suspensjon i 15 min 12 000 x g på 4 ° C.
      5. Ta av den øvre vandige fasen (inneholder RNA) nøye og overføre til en 1,5 mL reaksjon rør. Legge til 250 µL av isopropanol og ruge i 10 min på RT.
      6. Utføre en sentrifugering Trinn 12 000 x g for 10 min på 4 ° C.
      7. Ta av nedbryting og legge 1 mL av 75% etanol nøye. Sentrifuger 7500 x g i 5 min på 4 ° C.
        Merk: Pellets er lett å miste.
      8. Fjerne nedbryting helt. La pellet tørke på luften for 5-10 minutter.
        Merk: etanol må fjernes, men ikke tørr for mye.
      9. Oppløse pellet i 30 µL diethylpyrocarbonate behandlet vann inneholder i og varme i 10 minutter på 55 ° C.
        Merk: RNA konsentrasjon og renhet kan måles ved en spektral-fotometer.
    2. Utføre cDNA syntese (revers transkriptase PCR).
      1. Forberede en mastermix som inneholder: 10 µL PCR buffer (5 x), 2,5 µL desoxyribonucleosid-trifosfat (dNTP (10 mM)), 0,5 µL tilfeldig blanding av enkelt-strandet primer (0,2 µg / µL), 1 µL av RNase hemmer (40 U / µL, 0.4 revers transkriptase (200 U/µL) og 5,6 µL av diethylpyrocarbonat behandlet vann (se vedlagte tabell for materiale).
      2. Fortynne 500 ng RNA i 30 µL diethylpyrocarbonate behandlet vann 0,2 mL PCR rør og legge hele 20 µL mastermix.
      3. Bruke en PCR cycler utføre følgende trinn: 10 min 25 ° C, 30 min 50 ° C, 5 min 85 ° C og hold på 4 ° C.
  4. Utføre kvantitativ PCR (qPCR).
    Merk: Utføre qPCR av prøver i duplikater eller triplicates.
  5. Bruk primer med to forskjellige fluorescens fargestoffer. Primer med en absorpsjon av 495 nm og et utslipp av 517 nm for genet av interesse.
  6. Deteksjon av satellitt celle markør genuttrykk, bruke primere for sammenkoblede boksen protein 7 (Pax7) og M-cadherin (Cdh15) (se vedlagte Tabell for materiale).
  7. Oppdagelsen av endothelial celle markør genuttrykk, bruke grunning claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) og zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO1) (se vedlagte tabell for materiale).
  8. Som referanse genet for 18s rRNA, bruke en primer med absorpsjon av 538 nm og et utslipp av 554 nm bølgelengde.
  9. Klargjør en qPCR mastermix for hver genet av interesse med respektive primer. Mastermix inneholder: 10µl qPCR buffer (2 x), 1 µL av Primer for genet av interesse (10 µM), 1 µL av Primer for 18s rRNA og 4 µL av nuclease gratis vann.
  10. Legge til 16 µL av mastermix i en enkelt brønn av en 96-brønns reaksjon plate. Legge til 4 µL av cDNA (hentes fra trinn 5.3.2.) per godt som inneholder mastermix.
  11. Bruke en sanntid PCR cycler utføre følgende trinn: holde scenen med 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C for 10 min. sykling scenen med 40 sykluser av 95 ° C 15 s og 60 ° C i 1 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En dag etter isolasjon, primære murine MMEC og gjenværende andre celler danne konglomerater og overholder nederst kultur retter (figur 1A dag 1). Fra dagen 7, kan avlang og flat celler observeres. Forurensning av andre, hovedsakelig spheroid celler, er imidlertid fortsatt synlig (figur 1A dag 7). Dermed en syklus av CD31 positiv valg via MCS kreves. Heretter, primære murine MMEC sprer en tetthet på rundt 80-90%. Ved samløpet vanligvis utgjør en ikke-overlappende monolayer langs justert celler (figur 1A dag 14). Spredning stopper ved samløpet på grunn av kontakt-hemming. Etter 14 dager om 5-10 x 105 celler kan brukes for videre undersøkelser.

Kvalitetskontroll via flowcytometri bruker fixable levedyktighet fargestoff FVD780 (å flekk for døde celler), PECAM1 (CD31) og PTPRC (CD45, som markør for celler blodkreft opprinnelse) viste verdier for både levedyktighet og renhet alt rundt 70% hver for celler umiddelbart etter isolasjon (figur 2A). Celler dyrket etter en CD31 positiv valg via MCS, viste tilfredsstillende verdier for renhet så vel som for levedyktigheten alt opptil 95% hver (figur 2B).

For å vurdere nøyaktigheten av utvalget ble trinn, innhentet celler videre undersøkt for genuttrykk av muskel satellitt celle markør gener sammenkoblede boksen protein 7 (Pax7) og M-cadherin (Cdh15) på mRNA nivå av kvantitative PCR (qPCR). Primære murine MMEC (pmMMEC) og differensiert primære murine muskelceller (pmMC) ble brukt som negative og positive kontroll, henholdsvis. Murine muskelceller ble kommersielt kjøpt. Som forventet, bare CD45- CD31- brøkdel samt pmMC uttrykt Pax7 og Cdh15, mens CD45- CD31+ og den primære murine MMEC var negativ for disse markørene (figur 2C).

EC avledet fra blodkar i endomysium Skjelettmuskel uttrykke tett krysset proteiner 4,5. Ved hjelp av qPCR, uttrykk for claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) og zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO1) av confluent primære murine MMEC etter andre CD31 MCS ble trinn evaluert. PmMC ble brukt som kontroller (figur 2D). Primære murine MMEC uttrykt høye nivåer av Cld5, Ocln og Tjp1, mens pmMC bare viser lav uttrykk for Tjp1. Videre bekreftet immunofluorescence flekker ofte kvalitetskontroll overflaten uttrykk på endotelet-spesifikke markøren PECAM1 i primære murine MMEC (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: morfologi av primære murine MMEC. (A) representativt bilde av kultivert primære murine MMEC av fase kontrast mikroskopi fra 1 til 14 dager. D1 = dag 1, d7 = dag 7, d14 = dag 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontroll av primære murine MMEC. Gating strategi for flyt cytometric analyse av primære murine MMEC umiddelbart etter isolasjon (A) og på dag 15 (B) med (I) FSC/SSC, (II) FVD780 og (IIIa) CD45, (IIIb) CD31 (stiplede linjer = isotype kontroll). (C) uttrykket Pax7 og M-Cadherin (Cdh15) i CD45- CD31-, CD45- CD31+ fraksjoner etter MCS isolasjon samt primære murine MMEC (pmMMEC) og primære murine muskelceller (pmMC ). Uttrykket nivåer vises som ΔCt -verdiene (sampling - 18S rRNA), nd = ikke bestemt. (D) uttrykk nivå tett krysset proteiner claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) eller zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO-1) av pmMMEC og pmMC, som ΔCt -verdiene. (E) Immunofluorescence flekker for PECAM1 (rød) i dyrket primære murine MMEC 24 h etter andre CD31 positive utvalg. Kjernefysisk farging med DAPI inneholder (blå) montering medium; venstre = anti-PECAM1/DAPI, rett: negativ kontroll/DAPI. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrovaskulær endotelceller gir barriere funksjonene i alle vev og dysfunksjon resultatene i sykdom av tilknyttede organer 3. Videre kunne organ-spesifikke studier av mikrovaskulær EC bane vei for nye strategier. Derfor er en dypere forståelse av mikrovaskulær EC-funksjonen under fysiologiske og patofysiologiske forhold av stor vitenskapelig interesse. Modulering av leukocytter/endotelet samhandling er brukt til å behandle multippel sklerose pasienter med natalizumab, et antistoff som hindrer lymfocytt vedheft og dermed transmigration 6. Ulike myopathies inkludert inflammatorisk subtyper fortsatt beholdes imidlertid bare dårlig treatable hittil. Derfor kunne utviklingen av EC egenskaper i skjelettmuskulatur endotelet hjelpe for å utvide tilgjengelig behandlinger muskeldystrofi eller resultatet i romanen terapeutiske metoder.

Udødeliggjort endothelial cellelinjer (IECL) har blitt etablert og brukes for flere i vitro modeller. Disse cellelinjer tilbyr noen fordeler sammenlignet med primære mikrovaskulær EC immortalization og rask spredning. Videre kan primære kulturperler celler gjennomgå senescence og miste eller endre morfologi eller fysiologiske funksjon etter noen tid eller passasjer. Men IECL bare opprettholde noen endothelial celleegenskaper og ligner ikke en rekke ulike organ-borne primære mikrovaskulær EC. Av notatet, er de sjelden avledet fra skjelettmuskulatur. Hittil har beskriver bare en enkelt publikasjon en menneskelige skjelett mikrovaskulær endothelial celle linje kalt TSM15 5. Derimot murine mikrovaskulær EU har ikke blitt beskrevet så langt. Til slutt, primær celler fra transgene dyr gir mulighet til å studere genetiske modifikasjoner i vitro. Men holde primært cellekulturer også visse fallgruvene. Først kan forurensning med celler uten interesse påvirke gyldigheten av eksperimentelle resultatene. Derfor må nøyaktigheten av flere utvalg trinn og høy renhet av isolerte celler garanteres. Cellen suspensjon etter av muskelvev inneholder erytrocytter og ulike mononukleære celletyper som immunceller, satellitt celler, pericytes, fibroblaster og endotelceller 7. Derfor ble celle fraksjoner etter CD31 MCS trinnet testet for markører utelukkende uttrykt av satellitt muskelceller. Som forventet CD45- CD31- brøk og primære muskelceller viste Pax-7 og Cdh15 uttrykk, mens CD45- CD31+ og dyrket primære murine MMEC var negativ for disse markørene etter en andre CD31 MCS trinn. Videre er en kvalitetskontroll av isolert eller kulturperler celler uunngåelig garantere pålitelig og reproduserbar eksperimenter. Flere metoder for kvalitetskontroll av primære murine MMEC er tilgjengelige: foruten mikroskopi morfologiske egenskaper, flow cytometri, PCR og immunofluorescence stainings for karakteristiske EC markører (f.eks CD31, Sca-1) kan brukes. Renhet vurdering av fersk isolert primære murine MMEC var bare ca 60-70%, mens en levedyktigheten til ca 70% ble oppdaget. Mikroskopi av disse cellene viser delvis cellen konglomerater, som kan bestå av forurensende celler som fibroblaster eller pericytes knyttet til EC. Etter 7 dager kan hovedsakelig avlang og flat celler og formet celler observeres. Men resulterte to CD31 MCS passasjer i høye levedyktighet og renhet. Alternative tilnærminger til øke renhet som puromycin inneholder medier mislykkes i primære murine MMEC samtidig effektive i Trouble hjernen mikrovaskulær EC 8.

Siden mikrovaskulær EC avledet fra kapillærene uttrykke tett krysset proteiner, genuttrykk Cld5, Ocln og Tjp1 i primære murine MMEC sammenlignet med differensiert muskelceller ble undersøkt. Som forventet ble alle tett krysset molekyler oppdaget i primære murine MMEC. Sammenligning vist muskelceller bare lav uttrykk for Tjp1, mens ingen uttrykk for Cld5 og Ocln kunne bestemmes. Lignende uttrykk mønstre ble tidligere vist i hele murine skjelettmuskulatur. Her et uttrykk på gene og protein nivå ble oppdaget for Tjp1 men ikke for occludin 9. Videre kunne funksjonelle egenskaper som transendothelial måles.

Her beskrives protokollen har bare isolering av mikrovaskulær EC fra murine muskelvev. Men kan det overføres til ulike andre arter som for eksempel en lignende protokoll ble utgitt for rotte mikrovaskulær EC avledet fra epididymal fett pads. Her var CD31 positiv valg via MCS innledes med tetthet gradert sentrifugering 10. Lignende tilnærminger var vellykket macrovascular EC isolert fra rotte femoral arterier 11. En nylig publisert metode for å isolere mikrovaskulær EF av hjerte- og lunge vev bruker CD31 og endoglin (CD105) som antigener for magnetisk celle sortering 12. Men kunne renheten av EU ikke videre økes ved å bruke flere CD105 magnetisk perle separasjon. En annen mulighet å isolere og rense primære murine MMEC er flerfarget fluorescens aktivert celle sortering (FACS). Forskjellige innbyggere Sca-1+, CD31+, CD34dim og CD45- celler fra murine muskler kan være isolerte og ble karakterisert som primære murine MMEC 13. En fordel med denne metoden er en ren EC befolkning som kan brukes direkte eller kultivert for ytterligere eksperimenter (Merk at i vår erfaring FACS fører til økt celledød på grunn av høyere celle stress). Videre, døde celler eller konglomerater forskjellige celletyper kan redusere isolert celle tall av FACS. I tillegg er det rapportert at primære murine MMEC isolert av FACS var forgjeves kultivert på brukte oppdrettsforholdene 21% O2 og 5% CO2. Her hadde oksygennivået justeres 5% for en tilstrekkelig dyrking 13. Videre FACS teknikken er mer komplekse, tidkrevende og infrastruktur forutsetningene er dyre.

Musculus quadriceps femoris og musculus triceps surae av mannlige mus i alderen 4-12 uker er mest egnet for isolering av primære murine MEC som de er lett tilgjengelig og stor nok for isolering av tilstrekkelig cellen tallene (5-10 x 105 per gram muskel). Derfor må det sikres at forholdene er sammenlignbare uavhengig eksperimenter. Som beskrevet ovenfor, kan primære celler gjennomgå senescence. Derfor bruk celler for respektive eksperimenter umiddelbart i lavere passasjer. Etter passasje 8-10 primære murine MMEC endre deres morfologi, viser langsom spredning priser og miste deres kontakt hemming som tegn på dedifferentiation og senescence.

Videre er det noen notater for feilsøking for denne protokollen. Sterilt arbeider er viktig å unngå forurensing. Kvalitetskontroll er nødvendig å overvåke renhet og levedyktigheten til isolerte celler. Brukte materialer i denne protokollen må lagres og brukes i produsentens instruksjoner. Ytterligere, alder og kjønn brukte dyr, i tillegg til forskjellige muskelgrupper kan påvirke kvalitet og sammenlignbarhet isolert celler i eksperimenter.

Beskrevet protokollen anses som plattform å isolere primære mikrovaskulær EC i skjelettmuskulatur. Isolert celler kan brukes for flere programmer for å få ytterligere innsikt i blod-muskel-barriere-funksjonen. Cellene er egnet for både protein og RNA uttrykk studier samt funksjonelle analyser (inkludert transmigration og vedheft studier). Men denne protokollen var optimalisert for studier med fokus på inflammatoriske prosesser og derfor liten modifikasjoner kan være nødvendig med hensyn til ulike forskningsområder.

For å modellere komplekse romlige og funksjonelle mobilnettet interaksjoner i MVU, kan primære murine MMEC være dyrket i mer komplekse 3D celle kultur systemer med andre celletyper. Prospektivt, bør det også være mulig å generere MVU organoids som det har blitt beskrevet for andre vev før 14. Men er vellykket isolering av primære murine MMEC uunngåelig for satsing på dette neste trinn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av den "andre Kröner-Fresenius-Stiftung» (2018_A03 til TR),"Innovative Medizinische Forschung (IMF) Münster"(I-RU211811 til TR) og tysk Research Foundation (DFG, INST 2105/27-1, meg 3283/5-1 og meg 3283/6-1 til SGM). Illustrert bilder gitt av Heike Blum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Tags

Nevrovitenskap problemet 145 cellen aisolering murine mikrovaskulær endotelceller skjelettlidelser muskelceller blod muskel barrieren myovascular enhet muskeldystrofi
Isolering av primære Murine Skjelettmuskel mikrovaskulær endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müntefering, T., Michels, A. P. … More

Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter