Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

Summary

Células endoteliais microvasculares dos músculos esqueléticos (MMEC) forma a parede interna dos capilares musculares e regular a ambos, troca de fluidos/moléculas e migração de células (imunes) entre o tecido muscular e sangue. Isolamento de MMEC murino primário, conforme descrito aqui, permite investigações in vitro abrangentes da unidade"myovascular".

Abstract

As células endoteliais dos capilares do músculo esquelético (músculo microvascular em células endoteliais, MMEC) construir a barreira entre a corrente sanguínea e músculos esqueléticos, regulamenta a troca de fluidos e nutrientes, bem como a resposta imune contra infecciosas agentes, controlando a migração celular imune. Para essas funções, MMEC formam um funcional "unidade de myovascular" (MVU), com mais tipos de células, como fibroblastos, pericitos e células do músculo esquelético. Por conseguinte, uma disfunção do MMEC e, portanto, o MVU contribui para uma vasta variedade de miopatias. No entanto, mecanismos reguladores do MMEC na saúde e na doença permanecem insuficientemente compreendidos e sua elucidação precede a tratamentos mais específicos para miopatias. O isolamento e a investigação aprofundada das principais funções do MMEC no contexto do MVU podem facilitar uma melhor compreensão destes processos.

Este artigo fornece um protocolo para isolar MMEC murino primária do músculo esquelético por dissociação mecânica e enzimática, incluindo a purificação e etapas de manutenção da cultura.

Introduction

Via corrente sanguínea, células e órgãos são fornecidos com oxigênio, substratos e outras moléculas necessárias. Este intercâmbio ocorre em capilares, vasos menores. Os capilares são formados por uma camada interna de células endoteliais (CE) cuja integridade continua a ser um pré-requisito para o sucesso regulação da homeostase do músculo entre o espaço intravascular e intersticial. Para garantir uma transição seletiva de células e fatores solúveis, CE constituem uma monocamada interligados por firme e aderente junções ¹. Além de seu papel como barreira para nutrientes ou produtos metabólicos, CE regula o recrutamento de leucócitos em processos inflamatórios. Danos no tecido ou inflamação leva a uma regulação de moléculas de adesão na superfície do CE e produção de quimiocinas, facilitando a fixação dos leucócitos e transmigração no tecido alvo ². Por conseguinte, CE criticamente estão envolvidos na regulação de processos inflamatórios, tais como a defesa contra patógenos ou reparação dos tecidos.

Uma disfunção da CE está diretamente associado com doenças vasculares, insuficiência renal crônica, infecções de patógeno grave de trombose venosa. Além disso, a CE praticamente sempre estão envolvidos em auto-imunidade órgão-específicas, tais como diabetes mellitus ou esclerose múltipla ³. A função de barreira entre o fluxo de sangue e órgãos, portanto, é controlada por uma interação concertada de diferentes tipos de células. As músculo esquelético microvascular células endoteliais (MMEC) juntamente com células musculares, fibroblastos e pericitos formam uma unidade funcional, a unidade de"myovascular" (MVU). Portanto, uma disfunção do MVU pode desempenhar um papel crítico na fisiopatologia de miopatias. No entanto, uma compreensão mais profunda desses mecanismos regulatórios ainda está desaparecida e atualmente impede a identificação dos alvos novos, urgentes, terapêuticos em miopatias.

Para investigar os complexos mecanismos fisiológicos e fisiopatológicos, modelos animais são comumente usados. No entanto, em vitro modelos oferecem a vantagem de focar o assunto de interesse, excluindo uma variedade de fatores de confundimento. Para investigar processos in-vitro é necessário isolar as células primárias puras e viáveis. Em contraste com linhas de células, as células primárias isoladas de animais transgénicos permitem para investigar as consequências das modificações genéticas in vitro.

Aqui, um método para isolar MMEC murino primário é descrito usando dissociação mecânica e enzimática, seguida por magnético celular ativado classificação técnicas (MCS) para a purificação. Para este efeito, grânulos magnéticos contra marcadores de superfície específicos são utilizados. Plaquetas células endoteliais adesão molécula-1 (PECAM1, CD31) manifesta-se principalmente na CE e pode ser usado para enriquecer este tipo de célula. Para garantir a pureza elevada célula, células de origem hematopoiética são excluídas por uma seleção negativa para proteína tirosina fosfatase receptor tipo C (PTPRC, CD45). Além disso, são apresentados os controles de qualidade, cultivo de primário MMEC murino, aplicações potenciais e limitações, bem como considerações especiais.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelas autoridades locais e realizados de acordo com a lei alemã de bem-estar animal (84-02.05.20.13.097).

1. general observações sobre experimentação Animal

1. Executar todos os experimentos de rato em conformidade com as orientações dos respectivos cuidados institucionais animais e usar o Comité.
2. Manter os ratos sob condições padronizadas e de acordo com as diretrizes internacionais, como a Federação de associações de ciência do laboratório Animal (FELASA).
   Nota: Em geral, esta técnica de isolamento pode ser usada para os ratos, independentes da idade, sexo ou genético. Para obter um número suficiente de células, semana 4 – 10 machos são preferidos, por porque propriedades biológicas podem variar com a idade e o sexo.

2. preparação de soluções, meios de comunicação e revestimento

1. Preparar a solução de digestão (DS) misturando 2,2 mL de Dulbecco´s modificado águia médio (DMEM) com 200 μL colagenase-Dispase e 45 μL Desoxyribonuclease (DNase).
2. Preparar 500 mL de meio de célula endotelial (ECM) misturando 450 mL de DMEM com 50 mL FCS (aproximadamente 10%), 0,25 mL bFGF de fator de crescimento fibroblástico básico (20 μg/mL; aproximadamente 0.05%) e 5 mL de penicilina-estreptomicina (aproximadamente 1%). Realizar a filtração estéril em um tubo de vidro (diâmetro dos poros do filtro: 0,2 μm). Depois de armazenar a solução a 4 ° C.
3. Revestir as placas de cultura de células, conforme descrito abaixo.
   1. Para o cultivo da recém isolada tampa do MEC murino primário toda a superfície com 1 mL por alvéolo de um 6 bem celular placa de cultura com uma solução de revestimento à base de gelatina velocidade (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante para 3-5 min no quarto temperatura (RT).
   2. Aspire e descartar a solução de revestimento. Lave cada alvéolo com soro fisiológico estéril tamponado de fosfato 2 mL (PBS), pH 7.1 – 7,5 em duas etapas de lavagem consecutivos.
   3. Aspire e descartar a PBS. Encha poços com volume de 1 mL de ECM.

3. o isolamento do músculo murino primário de células endoteliais Microvascular (MMEC)

1. Eutanásia em um adulto 4 – 12 semanas rato velho, do sexo masculino por deslocamento cervical sem qualquer anestesia. O objectivo é separar rapidamente medula espinhal do cérebro a fim de fornecer o animal com uma morte rápida e indolor.
2. Cortar as extremidades.
   1. Use um afiado/blunt cirúrgico (ponta 42 mm, em linha reta) e sharp/sharp tesoura (ponta 23mm, em linha reta), uma linha reta (serrilhada, 2 x 1,25 mm x 12 cm) e uma curva (serrilhada, 1.3 x 1 mm x 13 cm) fórceps.
   2. Desinfecte todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70%.
   3. Posicionar o animal em suas costas, umedeça as pernas com etanol a 70%. Cortar a perna toda cortando na articulação do quadril com a tesoura cirúrgica sharp/blunt. Coloque as extremidades em um prato de cultura de células fechadas (35 x 10 mm).
      Nota: De agora em diante, execute cada etapa sob uma capa de estéril de fluxo laminar e trabalhar com instrumentos esterilizados.
3. Isolar o tecido muscular (preferencialmente use o musculus quadríceps femoral ou musculus tríceps sural de ambas as pernas).
   1. Corte a pele aberta da cintura até a ponta do dedo do pé-usando uma tesoura afiada/sharp e pinça curvada. Segure o dedo do pé ou pata com a pinça reta. Tire a pele com a pinça curvada do dedão ao quadril.
   2. Isolar o musculus quadríceps femoral por cortar o tendão do joelho e romper o músculo ao longo do fêmur até à anca. Isole o musculus tríceps sural pela ruptura do tendão de Aquiles. Daqui por diante, corte ao longo da tíbia até a fossa poplítea e remover o músculo.
      Nota: Se os grandes vasos (a. femoralis a. tibial anterior, a. tibial posterior, a. músculo fibular) são visíveis nos músculos isolados, remova os vasos para evitar a contaminação por endotélio macrovascular.
   3. Para remover os grandes navios, segure a parte do músculo que não contém grandes vasos com uma pinça curvada e cortá-lo ao lado do navio. Para este protocolo, é recomendado 1 g ou menos tecido muscular igual para ambos os quadríceps femoral e tríceps sural .
   4. Adicionar 2.445 µ l DS (da etapa 2.1) a um prato de cultura celular (35 x 10 mm) e determinar o peso.
   5. Transferir todos os pedaços de músculo para este prato de cultura de células contendo o 2445 µ l DS e determinar o peso. A diferença de ambos os valores medidos fornece o peso seco do tecido muscular, que não deve exceder 1 g.
   6. Corte o tecido do músculo inteiro em pedaços pequenos (≤ 2 mm cubos, cerca de 100 peças) usando a tesoura afiada/afiado.
4. Dissocia o tecido muscular.
   Nota: esta etapa leva cerca de 120 min.
   1. Loja muscular/DS suspensão a 37 ° C (incubadora com 5% CO₂) para 1,5 h. misturar a suspensão cuidadosamente a cada 20 min por cerca de 5 min, utilizando uma seringa de insulina 1 mL.
   2. Suspensão de transferência para um 70 μm nylon célula coador colocado em um tubo de 50 mL e coletar o fluxo através de. Lavar o filtro de célula com 8 mL de DMEM e coletar o fluxo através de.
   3. Descartar a suspensão de células de filtro e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g a 20 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
      Atenção: pellet é fácil perder.
   4. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de um tampão de lysing de amónio-cloreto de potássio (ACK) (ver anexo Tabela de materiais) para a Lise das células vermelhas do sangue e incube por 30 s a RT. adicionar 9 mL DMEM + 10% FCS para parar a suspensão de células de reação e transferência para um t de 15 mL Ube.
5. Empobrecem a CD45⁺ células seguindo as instruções do fabricante microbeads CD45. Para todas as etapas seguintes de CD45⁺ depleção usam buffer MCS (ver anexo tabela de materiais).
   Nota: esta etapa leva cerca de 60 min.
   1. Determinar o número de células usando uma célula de Neubauer contando câmara (Espere cerca de 5 x 10⁶ células por tecido muscular de g).
   2. Suspensão de centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Tira completamente o sobrenadante e ressuspender de células no buffer MCS µ l 90 (por 10⁷ células ou menos). Adicione 10 μL de microbeads CD45 (por 10⁷ células ou menos).
   3. Suspensão de células de misturar e incubar por 15 min na geladeira 4 – 8 ° c.
   4. Adicione 1mL de tampão MCS (por 10⁷ células ou menos). Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remover completamente o sobrenadante e ressuspender as células em buffer MCS 500 μL.
   5. Para a separação magnética celular use uma grande coluna magnética (LMC) com um volume de reservatório de 8 mL e uma capacidade de até 2 x 10⁹ células total. Posicione o LMC no campo magnético do separador.
   6. Enxágue com 3 mL de tampão MCS no reservatório do LMC. Após enxaguar, coloque um tubo cônico de 15 mL, abaixo da coluna para coletar o fluxo através de. Aplicar a suspensão de células inteiras (500 µ l) na coluna e deixá-lo completamente fluxo.
   7. Lavar a coluna três vezes, adicionando-se 3 mL de tampão MCS no reservatório e esperar até que o reservatório de column´s está vazio antes de executar a próxima etapa de lavagem.
   8. Recolher as células sem rótulo, passando a coluna usam para novas etapas de separação (representando a CD45 fração^– ). Rotulado de células (representando a CD45⁺ fração) acumulada na coluna pode ser descartada.
6. Acumular CD31⁺ células seguintes CD31 microbeads do fabricante. Para todas as etapas seguintes do CD31⁺ acumulação usar buffer de MCS.
   Nota: esta etapa leva cerca de 60 min.
   1. Determinar o número de celular usando uma célula de Neubauer contando câmara (esperar cerca de 4 x 10⁶ células por tecido muscular de g).
   2. Suspensão de células sem rótulo centrífuga obtidas passo 3.5 durante 10 minutos a 300 x g a 4 ° C.
   3. Remova o sobrenadante completamente. Resuspenda o pellet em buffer MCS 90 μL e adicionar 10 μL de microbeads CD31 (por 10⁷ células total ou menos). Misturar a suspensão inteira e incube por 15 min na geladeira 4 – 8 ° c.
   4. Adicionar 1mL de tampão MCS e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Tire o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de tampão MCS.
   5. Para a separação magnética celular use uma coluna magnética média (MMC) com um volume de reservatório de 3,5 mL e uma capacidade de até 2 x 10⁸ células total.
   6. Posicione o MMC no campo magnético do separador. Enxágue o MMC com 500 µ l de tampão MCS. Após enxaguar, coloque um tubo cônico de 15 mL, abaixo da coluna para coletar o fluxo através de.
   7. Aplicar a suspensão de células inteiras (500 µ l) na coluna e deixá-lo completamente fluxo.
   8. Lavar a coluna três vezes adicionando 500 µ l de tampão MCS e esperar até que o reservatório da coluna está vazio antes de executar a próxima etapa de lavagem. Células sem rótulo, passando a coluna representam a CD45^– CD31 fração^– . Armazená-los para mais controles de qualidade.
   9. Remover o separador de coluna e coloque-o em um tubo de recolha adequada (tubo de 15 mL). Pipeta 2 mL MCS de tampão para a coluna. Imediatamente lave as pilhas magneticamente etiquetadas empurrando firmemente o êmbolo na coluna. Este CD45^– CD31⁺ fração representa a principal enriquecido murino CE.
   10. Suspensão de células centrifugar durante 5 min à 350 x g a 20 ° C. Remover completamente o sobrenadante e ressuspender as células (esperar em torno de 0,6 x 10⁶ células por tecido muscular de g) em 1 mL de ECM (consulte a etapa 2.2.). Transferir (0,5 – 0,7 x 10⁶ células) para um único poço de uma placa de cultura de 6-Poços revestidos (do passo 2.3) contendo 1 mL de ECM.
7. Para o cultivo, Incube as células em 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora estéril. Atualize o ECM cada dois ou três dias.

4. primário MMEC murino purificação

1. Realizar um segundo ciclo de CD31⁺ acumulação, seguindo as instruções do fabricante (CD31 microbeads mouse protocolo; consulte Passo 3.6.).
   1. Separe as células com solução de tripsina/EDTA quando eles estão na confluência de 80-90% (geralmente após 7 dias). Por isso, enxágue cada poço com 2 mL de PBS estéril, em duas etapas de lavagem consecutivos. Use a solução de tripsina/EDTA 800 μL por 6-poços e incubar a 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora estéril de 3 – 5 min.. atividade enzimática de Stop usando 1200 μL DMEM contendo um mínimo de 10% FCS.
   2. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 5 min à 350 x g a 20 ° C.
   3. Realize a segunda etapa CD31-MCS para aumentar a pureza (de acordo com as instruções de manufacturer´s de microbeads CD31; ver 3.6).
   4. Observar a confluência de célula através de campo brilhante ou microscopia de contraste de fase padrão usando um
      20 x ampliação e abertura numérica da lente de 0,35. Veja a Figura 1.
      Nota: As células podem ser usadas para as respectivas experiências ou mantidas em cultura pela passagem. Use as células para experimentos prontamente em passagens inferiores. Não se recomenda usar células após a passagem
      8 – 10.

5. controle de qualidade

1. Execute a citometria de fluxo do MMEC murino primário após o segundo CD31-MCS-passo.
   1. Prepare um tubo de FACS, adicionando 1 mL de tampão de citometria (FC) fluxo (ver anexo Tabela de materiais).
   2. Separe as células com solução de tripsina/EDTA quando eles estão na confluência de 100% (geralmente após 14 dias). Por isso, enxágue cada poço com 2 mL de PBS estéril, em duas etapas de lavagem consecutivos. Use a solução de tripsina/EDTA 800 μL por 6-poços e incubar a 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora estéril de 3 – 5 min.. atividade enzimática de Stop usando 1200 μL DMEM contendo 10% FCS.
   3. Determine o número de células usando um Neubauer célula contando de câmara e adicionar um mínimo de 1 x 10⁵ células para o tubo de FACS preparado.
   4. Suspensão de células centrifugar durante 10 minutos a 300 x g a 4 ° C. Executar duas etapas de lavagem, removendo o sobrenadante, resuspending células em 1 mL FC de tampão e centrifugação por 10min a 300 x g a 4 ° C.
   5. Prepare uma mistura de coloração adicionando anti-rato anticorpo CD31-FITC (1: 100) e anti-mouse CD45-PE (1: 100) com buffer FC.
   6. Ressuspender as células em 100 μL de coloração mistura nos tubos FACS. Incubar durante 30 min a 4 ° C. Adicione 1 mL de tampão FC. Suspensão de células centrifugar durante 5 min à 300 x g a 4 ° C. Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 200 μL de tampão FC.
   7. Medida de células em um citômetro de fluxo, seguindo a estratégia associada é mostrada na figura. 2A.
2. Alternativamente, realize-se de mancha da imunofluorescência de MMEC murino primário após o segundo CD31-MCS-passo.
   1. As lamelas de casaco.
      1. Transferi um estéril 13 mm de diâmetro redondo lamela de vidro em um poço de um prato bem 24. Casaco lamela adicionando 300 µ l da solução de revestimento de velocidade por bem. Incube durante 3 – 5 min à temperatura ambiente (RT).
      2. Aspire e descartar a solução de revestimento. Lave cada poço com 2 mL de PBS estéril em duas etapas de lavagem consecutivos. Aspire e descartar a PBS.
      3. Semente de 1 x 10⁵ células em 1 mL de ECM na lamela revestida e incubar a 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora estéril até que as células são 99% de Confluencia.
   2. Execute a fixação e a mancha da imunofluorescência.
      1. Remova o meio de ECM de células cultivadas de 5.2.1.3.
      2. Corrigir pilhas cultivadas adicionando paraformaldeído de 4% de 300 µ l (PFA) com pH de 7,4 por alvéolo, durante 10 minutos a 4° C.
         Atenção: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
      3. Realizar 3 etapas de lavagem, adicionando 1 mL de PBS por bem e remover o sobrenadante após 5 min à RT
      4. Prepare um bloqueio solução contendo 5% BSA, soro de cabra Triton-X e 1% 0,2% em PBS.
      5. Adicione 300 µ l de solução de bloqueio a cada poço e incubar durante 1 h em RT
      6. Remover o sobrenadante e adicionar 200 µ l por alvéolo de anticorpos anti-PECAM-1 (CD31) (1: 200) em 5% BSA, 1% de soro de cabra em PBS e incubar a 4 ° C durante a noite.
      7. Realize 3 lavagem passos adicionando 1 mL de PBS por bem e remoção de sobrenadante após 5 min à RT em cada etapa.
      8. Prepare uma solução de anticorpo secundário contendo Cy3-conjugado anticorpo IgG anti-rato (1: 500) em 1% de BSA e PBS. Adicione 300 μl por poço da solução anticorpo secundário e incubar durante 1 h a RT no escuro.
      9. Realize 3 lavagem passos adicionando 1 mL de PBS por bem e remoção de sobrenadante após 5 min à RT em cada etapa.
   3. Tirar as lamelas de vidro redonda cuidadosamente com a pinça e transferi-lo numa lâmina de microscopia. Adicionar uma quantidade adequada de DAPI contendo médio de montagem sobre a camada de células e cuidadosamente coloque um tampa de vidro nela (ver anexo Tabela de materiais).
   4. Observa-se células com um microscópio de fluorescência apropriados equipado com uma fonte de luz de fluorescência (120 W) e dois conjuntos de filtro: um filtro de excitação/emissão definido com 550/25 nm e comprimentos de onda de nm 605/70 para detectar Cy3 540/562 nm.
   5. Use um segundo filtro definido com um comprimento de onda de excitação/emissão de 365/50 nm e 445/50 nm para detectar DAPI 350/440 nm. Use uma ampliação de 40 x e 80% de intensidade de 14,5 mW/cm² para DAPI com duração de 30 ms. aquisição para a deteção de Cy3 use 80% de 67.5 mW/cm² com uma duração de aquisição de 60 ms.
3. Realize o PCR quantitativo.
   1. Isolamento do mRNA.
      1. Siga os procedimentos padrão de utilização de um reagente de tiocianato-fenol (AGTP) ácido guanidínio para isolar o mRNA. Use um mínimo de 0,5 x 10⁶ células de CD45^– CD31^– (consulte a etapa 3.6.8), CD45^– CD31⁺ (consulte a etapa 3.6.9.) frações e cultivada MMEC primária de murino (4.1.3)
      2. Suspensão de células centrifugar durante 10 minutos a 300 x g a 20 ° C. Tire o sobrenadante completamente. Resuspenda o pellet de célula em 500 µ l de suspensão de células AGTP reagente e transferência em um tubo de reação de 2 mL. Incubar durante 5 min à RT.
      3. Adicione 100 µ l de clorofórmio e agitar vigorosamente durante 15 s. Incubar por 3 min em RT
      4. Suspensão de centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
      5. Tira superior fase aquosa (contendo RNA) com cuidado e transfira para um tubo de reação de 1,5 mL. Adicionar 250 µ l de isopropanol e incubar durante 10 minutos a RT
      6. Executar uma etapa de centrifugação a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.
      7. Tire o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol 75% cuidadosamente. Centrifugar a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C.
         Nota: Pelota é fácil perder.
      8. Remova o sobrenadante completamente. Deixe o sedimento secar no ar por 5-10 min.
         Nota: etanol precisa ser removido mas não seco demais.
      9. Dissolva a pelota em 30 µ l diethylpyrocarbonate Tratado contendo água em e calor por 10 min a 55 ° C.
         Nota: Pureza e concentração de RNA podem ser medidos por um fotômetro-espectral.
   2. Realize a síntese do cDNA (transcriptase reversa PCR).
      1. Preparar um mastermix contendo: 10 µ l de tampão PCR (5x), 2,5 µ l desoxyribonucleosid-trifosfato (dNTP (10 mM)), mistura aleatória de 0,5 µ l de single-stranded primer (0,2 µ g / µ l), 1 µ l de inibidor de RNase (40 U / µ l, 0.4 reverse transcriptase (200 U / µ l) e 5,6 µ l de diethylpyrocarbonat água tratada (ver anexo tabela de materiais).
      2. Dilua 500 ng RNA em 30 µ l diethylpyrocarbonate Tratado água em 0,2 mL PCR tubos e adicionar o mastermix inteira de 20 µ l.
      3. Use um reciclador PCR executar seguindo as etapas: 10 min, 30 min 5 min 85 ° C, 50 ° C, 25 ° C e mantenha a 4 ° C.
4. Realize o PCR quantitativo (qPCR).
   Nota: Execute qPCR de amostras em duplicatas ou triplica.
5. Use a primeira demão com dois corantes diferentes de fluorescência. Primeira demão com uma absorção de 495 nm e uma emissão de 517 nm para o gene de interesse.
6. Para detecção de expressão gene marcador de célula satélite, use primers para proteína emparelhados caixa 7 (Pax7) e M-caderina (Cdh15) (ver anexo Tabela de materiais).
7. Para detecção de expressão de gene marcador de célula endotelial, use primers para claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) e zonula occludens-1 (Tjp1 ou ZO1) (ver anexo tabela de materiais).
8. Como o gene de referência para 18s rRNA, use um primer com absorção de 538 nm e uma emissão de comprimento de onda de 554 nm.
9. Prepare um mastermix qPCR para cada gene de interesse com o primer respectivo. Mastermix contém: tampão de qPCR 10 µ l (2 x), 1 µ l de Primer para o gene de interesse (10 µM), 1 µ l de Primer para 18s rRNA e 4 µ l de nuclease água livre.
10. Adicione 16 µ l do mastermix a um único poço de uma placa de 96 poços de reação. Adicione 4 µ l de cDNA (obtido de passo 5.3.2.) por bem contendo o mastermix.
11. Use um reciclador PCR em tempo real realizando seguindo as etapas: segurando o palco com 50 ° C por 2 min e 95 ° C por 10 min. fase de ciclismo com 40 ciclos de 95 ° C 15 s e 60 ° C por 1 min.

Representative Results

Um dia após o isolamento, MMEC murino primário e residual outras células formam conglomerados e aderirem ao fundo de pratos de cultura (figura 1A dia 1). Dia 7 em diante, podem ser observadas células alongadas e planas. No entanto, a contaminação de outras, principalmente as células de esferoide, é ainda visível (figura 1A dia 7). Assim, outro ciclo de CD31 positivo de seleção através de MCS é necessária. Daqui por diante, primário MMEC murino proliferar para uma densidade de aproximadamente 80-90%. A confluência normalmente formam uma monocamada de não-sobreposição de células alinhadas no sentido longitudinal (figura 1A dia 14). Proliferação para na confluência devido à inibição de contato. Após 14 dias sobre 5 – 10 x 10⁵ células pode ser usado para mais investigações.

Controle de qualidade através de citometria de fluxo utilizando corante viabilidade fixável FVD780 (a mancha por células mortas), PECAM1 (CD31) e PTPRC (CD45, como marcador de células de origem hematopoiética) mostrou valores de viabilidade e pureza que variam em torno de 70% cada para células imediatamente após o isolamento (Figura 2A). Células cultivadas após outro CD31 selecção positiva através de MCS, mostrou satisfação valores de pureza, bem como quanto à viabilidade, variando até 95% cada (Figura 2B).

Para avaliar a precisão da seleção etapas, obtidas de células foram investigadas ainda mais para a expressão dos genes da célula satélite músculo marcador genes emparelhados caixa proteína 7 (Pax7) e M-caderina (Cdh15) no nível de mRNA por PCR quantitativo (qPCR). MMEC murino primário (pmMMEC) e células musculares de murino primária diferenciada (pmMC) foram utilizadas como controle negativo e positivo, respectivamente. Células musculares murino foram adquiridas comercialmente. Como esperado, só a CD45^– CD31 fração^– , bem como a pmMC expresso Pax7 e Cdh15, Considerando que CD45^– CD31⁺ e o MMEC murino primário foram negativos para estes marcadores (Figura 2).

CE derivado de capilares no endomísio do músculo esquelético junção expressa apertado proteínas ^4,5. Usando qPCR, a expressão de claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) e zonula occludens-1 (Tjp1 ou ZO1) dos confluente MMEC murino primário após o MCS CD31 segunda etapa foi avaliada. PmMC foram usados como controles (Figura 2D). MMEC murino primária expressa níveis elevados de Cld5, Ocln e Tjp1, Considerando que pmMC só mostram baixa expressão de Tjp1. Além disso, a mancha como controle de qualidade confirmou expressão superfície do endotélio específico marcador PECAM1 em MMEC murino primária (Figura 2E).

Figura 1: morfologia do primário MMEC murino. (A) imagem representativa da cultura primária MMEC murino por microscopia de contraste de fase dos dias 1 a 14. D1 = 1 dia, d7 = dia 7, d14 = dia 14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: controle de qualidade da primária murino MMEC. Retenção de estratégia para fluxo cytometric análise de primário MMEC murino imediatamente após isolamento (A) e no dia 15 (B) (I) usando FSC/SSC, (II) FVD780 e (III) CD45, CD31 (IIIb) (tracejado linhas = isotipo controle). (C) expressão nível de Pax7 e M-caderina em CD45 (Cdh15)^– CD31^-, CD45^– CD31⁺ frações após isolamento de MCS, bem como no primário MMEC murino (pmMMEC) e células musculares de murino primário (pmMC ). Níveis de expressão são mostrados como valores de_t ΔC (amostra - 18S rRNA), n.d. = não determinado. (D) expressão nível de junção apertada proteínas claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) ou zonula occludens-1 (Tjp1 ou ZO-1) do pmMMEC e pmMC, mostrado como valores de_t ΔC. (E) imunofluorescência mancha para PECAM1 (vermelho) em cultivadas primário murino MMEC 24 h após a segunda selecção positiva do CD31. Nuclear de coloração com DAPI (azul) contendo o meio de montagem; esquerda = anti-PECAM1/DAPI, bem: negativo controle/DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Células endoteliais microvasculares fornecem funções de barreira em todos os tecidos e seus resultados de disfunção na doença dos órgãos associados ³. Além disso, estudos de órgãos específicos da CE microvascular podem pavimentar o caminho para novas estratégias terapêuticas. Portanto, uma compreensão mais profunda da função microvascular de CE sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é de grande interesse científico. Modulação da interação dos leucócitos/endotélio é utilizada com sucesso para tratar pacientes de esclerose múltipla com natalizumab, um anticorpo que impede a aderência de linfócitos e, assim, transmigração ⁶. No entanto, várias miopatias incluindo os subtipos inflamatórios ainda permanecem apenas mal tratáveis até à data. Portanto, elucidação das propriedades de CE especificamente no endotélio músculo esquelético poderia ajudar a expandir os tratamentos disponíveis para miopatia ou resultado em novas abordagens terapêuticas.

Linhas de células endoteliais imortalizado (IECL) foram estabelecidas e usadas para vários modelos in vitro. Estas linhas de celular oferecem algumas vantagens em relação ao primário microvascular CE devido à rápida proliferação e immortalization. Além disso, culturas de células primárias passam por senescência e ou podem perder mudar sua morfologia ou função fisiológica após algum tempo ou passagens. No entanto, IECL apenas manter algumas propriedades da célula endotelial e não pode assemelhar-se a variedade da diferentes transmitidas por órgão primário microvascular CE. Digno de nota, eles raramente são derivados dos músculos esqueléticos. Até à data, apenas uma única publicação descreve uma linha de célula endotelial microvascular esquelético humano chamada TSM15 ⁵. Em contraste, murino microvascular CE não foram descritos até agora. Finalmente, as células primárias de animais transgénicos oferecem a oportunidade de estudar as modificações genéticas em vitro. No entanto, culturas de células primárias também possuem certas armadilhas. Primeiro, a contaminação com células sem interesse pode interferir com a validade das conclusões experimentais. Portanto, devem ser garantidas a exactidão das várias etapas de seleção e alta pureza de células isoladas. Suspensão de células após a dissociação do tecido muscular contém hemácias e tipos diferentes de células mononucleares como células do sistema imunológico, células satélites, pericitos, fibroblastos e células endoteliais ⁷. Portanto, frações de célula após a etapa de MCS CD31 foram testadas para marcadores exclusivamente expressados pelas células satélite de músculo. Como esperado CD45^– CD31 fração^– e células musculares primária mostraram Pax-7 e Cdh15 expressão, Considerando que CD45^– CD31⁺ e MMEC murino primário cultivada foram negativos para estes marcadores após um segundo CD31 Passo MCS. Além disso, um controle de qualidade de células isoladas ou cultivadas é inevitavelmente a garantia de experiências reprodutíveis e confiáveis. Vários métodos de controle de qualidade de MMEC murino primária estão disponíveis: além de microscopia de propriedades morfológicas, citometria de fluxo, PCR e imunofluorescência citológicas para marcadores característicos do CE (por exemplo, CD31, Sca-1) podem ser usadas. Avaliação da pureza de recém isolado primário murino MMEC foi apenas cerca de 60-70%, Considerando que poderia ser detectada uma viabilidade de cerca de 70%. Microscopia dessas células parcialmente mostra conglomerados de célula, que podem consistir em células contaminantes, como fibroblastos ou pericitos anexados à CE. Após 7 dias podem ser observadas principalmente esferoide células e células alongadas e planas. No entanto, duas passagens de MCS CD31 resultaram em pureza e alta viabilidade. Abordagens alternativas para aumentar a pureza como mídia contendo puromicina falhou no primário MMEC murino, sendo eficaz em murino microvascular CE ⁸no cérebro.

Pois CE microvascular derivada dos capilares expressam proteínas de junção apertada, analisou-se a expressão gênica de Cld5, Ocln e Tjp1 no primário MMEC murino em comparação com células musculares diferenciadas. Como esperado todas as moléculas de junção apertada foram detectadas no primário MMEC murino. Em comparação, células musculares demonstraram apenas baixa expressão de Tjp1, Considerando que nenhuma expressão de Cld5 e Ocln pôde ser determinada. Padrões de expressão semelhantes foram demonstrados anteriormente no músculo esquelético toda murino. Aqui, uma expressão em nível de gene e proteína poderia ser detectada para Tjp1 mas não para occludin ⁹. Novas características funcionais tais como a resistência de transendothelial poderiam ser medidas.

O protocolo descrito neste documento possui apenas o isolamento da CE microvascular do tecido muscular murino. No entanto, pode ser transferida para várias outras espécies, como por exemplo que um protocolo semelhante foi publicado para CE microvascular derivado de almofadas de gordura epidídimo de rato. Aqui, CD31 selecção positiva através de MCS foi precedida por centrifugação gradiente de densidade ¹⁰. Abordagens similares foram bem sucedidas em isolamento de CE macrovascular do rato artérias femoral ¹¹. Um método recentemente publicado para isolar CE microvascular do tecido do coração e pulmão usa CD31 e endoglin (CD105) como antígenos para célula magnética classificação ¹². No entanto, a pureza da CE poderia não mais será aumentada usando adicional separação magnética do grânulo de CD105. Outra possibilidade para isolar e purificar MMEC murino primária é a célula de fluorescência multicolor ativada classificação (FACS). Uma população distinta de Sca-1⁺, CD31⁺, CD34^dim e CD45^– células de músculos murino pode ser isoladas e caracterizou-se como principal murino MMEC ¹³. Uma vantagem deste método é uma população de CE pura, que pode ser usada diretamente ou cultivada para novas experiências (Note que, em nossa experiência FACS leva a aumento da morte celular, devido ao maior estresse celular). Além disso, mortas células ou conglomerados de diferentes tipos de células podem reduzir significativamente o número de células isoladas por FACS. Além disso, é relatado que primário MMEC murino isolado por FACS sem sucesso foram cultivadas em condições de cultura comumente utilizados de 21% O₂ e 5% de CO₂. Aqui, o nível de oxigênio tinha que ser ajustado para 5%, para um suficiente de cultivo ¹³. Além disso, a técnica de FACS é mais complexa, demorada e os pré-requisitos de infra-estrutura são caros.

O musculus quadríceps da coxa e o musculus tríceps sural de camundongos machos em idade de 4 a 12 semanas são mais adequados para isolamento do MEC murino primário como eles são facilmente acessíveis e grande o suficiente para o isolamento de número suficiente de células (5-10 x 10⁵ por grama de músculo). Portanto, deve assegurar-se que as condições são comparáveis em experimentos independentes. Conforme descrito acima, as células primárias podem se submeter a senescência. Portanto, use células para as respectivas experiências prontamente em passagens inferiores. Após a passagem principal MMEC murino de 8 – 10 mudar sua morfologia, demonstrar taxas de proliferação lenta e perder sua inibição de contato como sinais para quê e senescência.

Ainda existem algumas notas para solução de problemas para este protocolo. Trabalho estéril é essencial para evitar contaminações. Controles de qualidade são necessários para monitor pureza e viabilidade de células isoladas. Materiais utilizados neste protocolo devem ser armazenados e aplicados de acordo com as instruções do fabricante. Adicionais, idade e sexo dos animais utilizados, bem como grupos musculares diferentes podem influenciar a qualidade e comparabilidade das células isoladas em experimentos.

O protocolo descrito deve ser considerado como método de plataforma para isolar CE microvascular primário dos músculos esqueléticos. Células isoladas podem ser usadas para diversas aplicações para ganhar ainda mais insights sobre a função de barreira de sangue do músculo. As células são adequadas para proteína e estudos de expressão de RNA tanto ensaios funcionais (incluindo estudos de transmigração e adesão). No entanto, este protocolo foi otimizado para estudos enfocando processos inflamatórios e, portanto, pequenas modificações podem ser necessárias em relação a áreas de investigação diferentes.

Para modelar as complexas espaciais e funcionais celulares interações dentro do MVU, MMEC murino primária pode ser cultivado em sistemas mais complexos de cultura celular 3D juntamente com outros tipos de células. Prospectivamente, também é possível gerar MVU organoids como tem sido descrito em outros tecidos, antes de ¹⁴. No entanto, isolamento bem sucedido de MMEC murino primário é inevitável para visando este próximo passo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25200-056	ready to use
ACK buffer			150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)	Biolegend	102506	Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)	Biolegend	103106	Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A4503
CD31 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-097-418
CD45 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Collagenase-Dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates	Corning	3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody	dianova	712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)	Thermo Fisher	P36935
Desoxyribonuclease	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water	Thermo Fisher	AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate	Thermo Fisher	31966-021	warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192	1 mL
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
FACS tubes	Sarstedt	551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer	Corning	352350
FC buffer			0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780	Thermo Fisher	65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix)	Braun	9161708V
large magnetiv columns (LS columns)	Miltenyi Biotec	130-042-401	for CD45-MACS-step
MCS buffer			0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column)	Miltenyi Biotec	130-042-201	for CD31-MACS-step
Nuclease free water	Thermo Fisher	R0581
PBS	Sigma Aldrich		Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742	in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse	SantaCruz	Sc-52713	100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
primary murine muscle cells	celprogen	66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)	Thermo Fisher	Mm00483191_m1	FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5)	Thermo Fisher	Mm00727012_s1	FAM labeled
Primer Ocln (occludin)	Thermo Fisher	Mm00500912_m1	FAM labeled
Primer Pax-7	Thermo Fisher	Mm01354484_m1	FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)	Thermo Fisher	Mm00493699_m1	FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)	Thermo Fisher	4310893E	VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)	Thermo Fisher	K0231	2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer	Thermo Fisher	SO142	Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)	Thermo Fisher	EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp)	Fine Science Tools	14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)	Fine Science Tools	14001-13
Speed Coating solution	PeloBiotech	PB-LU-000-0002-00