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Neuroscience

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos (MMEC) forma la pared interna de los capilares musculares y regulan ambos, intercambio de moléculas de líquidos y migración de las células (inmunes) entre sangre y tejido muscular. Aislamiento de MMEC murino primario, como se describe aquí, permite completa investigaciones in vitro de la "unidad myovascular".

Abstract

Las células endoteliales de capilares del músculo esquelético (músculo microvascular las células endoteliales, MMEC) construcción la barrera entre la sangre y los músculos esqueléticos que regula el intercambio de fluidos y nutrientes así como la respuesta inmune contra infecciosas agentes de control de la migración de células inmunes. Para estas funciones, forman un funcional MMEC "unidad myovascular" (MVU), con más tipos de células, como fibroblastos y pericitos, células del músculo esquelético. Por lo tanto, una disfunción de MMEC y por lo tanto la MVU contribuye a una gran variedad de miopatías. Sin embargo, mecanismos de MMEC en la salud y la enfermedad siguen siendo insuficientemente comprendidos y su elucidación precede a tratamientos más específicos para miopatías. El aislamiento y la investigación en profundidad de funciones primarias de MMEC en el contexto de la MVU podrían facilitar una mejor comprensión de estos procesos.

Este artículo proporciona un protocolo para aislar MMEC murino primaria del músculo esquelético por la disociación mecánica y enzimática, incluyendo purificación y pasos de mantenimiento de la cultura.

Introduction

Órganos, células y a través de torrente sanguíneo están provistos de oxígeno, substratos y otras moléculas necesarias. Este intercambio tiene lugar en los capilares, los vasos más pequeños. Los capilares están formados por una capa interna células endoteliales (CE), cuya integridad es un pre-requisito para la exitosa regulación de la homeostasis del músculo entre el espacio intravascular e intersticial. Para asegurar una transición selectiva de células y factores solubles, CE constituyen un monocapa interconectados por apretada y de las ensambladuras de los adherens 1. Además de su papel como barrera para alimentos o productos metabólicos, CE regular el reclutamiento de leucocitos en los procesos inflamatorios. Inflamación o tejido daños conduce a una para arriba-regulación de moléculas de adhesión en la superficie de la CE y la producción de quimiocinas facilitando el apego del leucocito y transmigración en los tejidos de destino 2. En consecuencia, CE están implicados críticamente en la regulación de procesos inflamatorios como la defensa contra agentes patógenos o reparación de los tejidos.

Una disfunción de la CE está directamente asociada con enfermedades vasculares, la insuficiencia renal crónica, trombosis venosa grave patógeno infecciones. Además, CE casi siempre están implicadas en autoinmunidad órgano-específicas como diabetes mellitus o esclerosis múltiple 3. La función de barrera entre la sangre y órganos por lo tanto es controlada por una interacción concertada de diferentes tipos de células. En el músculo esquelético microvascular células endoteliales (MMEC) junto con las células musculares, fibroblastos y pericitos forman una unidad funcional, la "unidad myovascular" (MVU). Por lo tanto, una disfunción de la MVU pudo desempeñar un papel fundamental en la fisiopatología de las Miopatías. Sin embargo, una comprensión más profunda de estos mecanismos reguladores todavía falta y actualmente imposibilita la identificación de objetivos nuevos, urgentes, terapéuticos en las Miopatías.

Para investigar los mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos complejos, se utilizan modelos animales. Sin embargo, en vitro modelos ofrecen la ventaja de centrarse en el tema de interés mediante la exclusión de una gran variedad de factores de confusión. Para investigar los procesos in vitro es necesario aislar células primaria puras y viables. En contraste con las líneas celulares, células primarias aisladas de animales transgénicos permiten investigar las consecuencias de modificaciones genéticas in vitro.

Aquí, un método para aislar primaria MMEC murino se describe mediante el uso de disociación mecánica y enzimática, seguida de magnético celular activado clasificación técnicas (MCS) para la purificación. Para ello, se utilizan granos magnéticos contra marcadores de superficie específicos. Plaquetas endotelial de la célula molécula 1 de adhesión (PECAM1, CD31) se expresa principalmente en el CE y se puede utilizar para enriquecer este tipo celular. Para garantizar la pureza alta de la célula, las células de origen hematopoyético son excluidas por una selección negativa para la proteína tirosina fosfatasa receptor tipo C (PTPRC, CD45). Además, se presentan los controles de calidad, el cultivo de primaria MMEC murino, aplicaciones potenciales y limitaciones, así como consideraciones especiales.

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Protocol

Todos los experimentos en animales eran aprobados por las autoridades locales y llevó a cabo conforme a la ley de bienestar animal alemán (84-02.05.20.13.097).

1. general observaciones en animales de experimentación

  1. Todos los experimentos de ratón siguiendo las directrices de la respectiva atención animal institucional y Comité.
  2. Mantener los ratones en condiciones estandarizadas y de acuerdo con las normas internacionales como la Federación de laboratorio animales ciencia asociaciones (personal).
    Nota: En general puede utilizarse esta técnica de aislamiento para los ratones independientemente de la edad, el género o la genética. Para obtener un número suficiente de células, 4 – 10 semanas de edad los machos se prefieren, porque propiedades biológicas pueden variar con la edad y género.

2. preparación de soluciones, medios de comunicación y la capa

  1. Preparar la solución de digestión (DS) mediante la mezcla de 2, 2 mL de Dulbecco´s modificado Eagle Medium (DMEM) con 200 μL Dispase colagenasa y 45 μL Desoxyribonuclease (DNasa).
  2. Preparar 500 mL de medio (ECM) de la célula endotelial mezclando 450 mL de DMEM con FCS de 50 mL (10% aproximadamente), 0.25 mL bFGF de factor de crecimiento básico del fibroblasto (20 μg/mL, aproximadamente 0.05%) y 5 mL penicilina-estreptomicina (aproximadamente 1%). Realizar la filtración estéril en un tubo de vidrio (diámetro de los poros del filtro: 0.2 μm). Luego almacenar la solución a 4 ° C.
  3. Placas de cultivo de células de la capa como se describe a continuación.
    1. Para el cultivo de cubierta del MEC murino primaria recién aislado toda la superficie con 1 mL por pozo de 6 celulares bien placa de cultivo con una solución de recubrimiento de gelatina base velocidad (véase Tabla de materiales) según instrucciones del fabricante de 3 a 5 minutos en la sala de temperatura (RT).
    2. Aspirar y descartar la solución de recubrimiento. Lave cada pocillo con 2 mL tamponada de fosfato estéril solución salina (PBS), pH 7.1, 7.5 en dos pasos consecutivos de lavado.
    3. Aspirar y descartar el PBS. Llenar los pozos con volumen de 1 mL de ECM.

3. aislamiento de células endoteliales microvasculares principal músculo murino (MMEC)

  1. Eutanasia a un adulto 4 – 12 semanas ratón viejo, hombre por dislocación cervical sin ninguna anestesia. El objetivo es separar rápidamente la médula espinal desde el cerebro con el fin de proporcionar al animal una muerte rápida e indolora.
  2. Cortar las extremidades.
    1. Utilizar un quirúrgica sharp/blunt (borde de corte de 42 mm, recto) y sharp/sharp (vanguardia 23 mm, recta) tijera recta (serrada, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) y una curva (serrado, 1.3 mm x 1 mm x 13 cm) fórceps.
    2. Desinfecte todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%.
    3. Coloque el animal en su espalda, humedecer las piernas con etanol al 70%. Cortar la pierna entera por corte en la articulación de la cadera con la tijera quirúrgica sharp/blunt. Colocar las extremidades en una placa de cultivo de célula cerrada (35 x 10 mm).
      Nota: De ahora en adelante realizar cada paso bajo campana de flujo laminar estéril y con instrumentos esterilizados.
  3. Aislar del tejido muscular (preferentemente usar el cuadriceps de musculus femoris o surae del tríceps de musculus de ambas piernas).
    1. Cortar la piel abierta de la cadera hasta la punta del dedo del pie mediante un afilado/afilado tijeras y pinzas curvas. Sostenga el dedo del pie o bandolero con el fórceps recto. Pele la piel con el fórceps curvado desde el dedo del pie a la cadera.
    2. Aislar el cuadriceps de musculus femoris cortar el tendón de la rodilla y separa el músculo a lo largo del fémur a la cadera. Aislar el musculus triceps surae por cortar el tendón de Aquiles. En adelante, corte a lo largo de la tibia a la fosa poplítea y retirar el músculo.
      Nota: Si grandes vasos (femoralis de a. a. tibial anterior, a. tibial posterior, a. fibularis) son visibles en los músculos aislados, retire los recipientes para evitar la contaminación por endotelio macrovasculares.
    3. Para quitar los recipientes grandes, sujete la parte del músculo que no contiene vasos con un fórceps curvo y cortar al lado de la nave. De este protocolo, se recomienda 1 g o menos tejido muscular igual al cuádriceps femoral y triceps surae .
    4. Añadir μl 2.445 DS (del paso 2.1) en una placa de cultivo celular (35 x 10 mm) y determinar el peso.
    5. Transferir todos los pedazos de músculo a este plato de cultivo celular que contiene el μl 2445 DS y determinar el peso. La diferencia de ambos valores medidos proporciona el peso seco de tejido muscular que no debe exceder de 1 g.
    6. Cortar el tejido de músculo entero en trozos pequeños (≤ 2 mm cubos, cerca de 100 piezas) mediante el uso de la tijera aguda/aguda.
  4. Disociar el tejido muscular.
    Nota:     este paso toma unos 120 minutos.
    1. Suspensión de músculo/DS tienda a 37 ° C (incubadora con 5% CO2) por 1,5 h. mezclar la suspensión cuidadosamente cada 20 min durante unos 5 minutos utilizando una jeringa de insulina 1 mL.
    2. Transferir la suspensión a 70 μm nylon celular colador colocado sobre un tubo de 50 mL y recoger el flujo a través. Lave el filtro celular con 8 mL de DMEM y recoger el flujo a través.
    3. Descartar la suspensión celular del colador y centrifugar 10 min a 300 x g a 20 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante.
      PRECAUCIÓN: pellet es fácil de perder.
    4. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de un tampón de lisis de amonio cloruro de potasio (ACK) (véase la adjunta Tabla de materiales) para la lisis de glóbulos rojos e incube durante 30 s RT. Añadir 9 ml de DMEM + 10% FCS para detener la suspensión de células de reacción y transferencia para una t de 15 mL UBE.
  5. Agotan CD45+ siguiendo las instrucciones del fabricante de microesferas de CD45 de las células. Para todos los siguientes pasos de CD45+ agotamiento usar tampón MCS (ver adjunto tabla de materiales).
    Nota:     este paso tarda unos 60 minutos.
    1. Determinar el número de células con una célula de Neubauer recuento de cámara (esperar aproximadamente 5 x 106 células por g de tejido muscular).
    2. Suspensión de centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Despegar totalmente de sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 90 μl de tampón de MCS (por 107 células o menos). Añada 10 μL de microesferas de CD45 (por 107 células o menos).
    3. Mezclar la suspensión de células e incubar durante 15 min en la nevera a 4-8 ° C.
    4. Añadir 1mL de tampón de MCS (por 107 células o menos). Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Quite completamente el sobrenadante y resuspender las células en buffer MCS de 500 μL.
    5. Para la separación magnética de células utilizar una columna magnética grande (LMC) con un volumen de embalse de 8 mL y una capacidad de hasta 2 x 109 células totales. La posición en el campo magnético del separador de la LMC.
    6. Lavar con 3 mL de tampón de MCS en el depósito de la LMC. Después de enjuagar, colocar un tubo cónico de 15 mL por debajo de la columna para recoger el flujo a través. Aplicar la suspensión de células enteras (500 μl) sobre la columna y dejar totalmente flujo a través.
    7. Lavar la columna tres veces mediante la adición de 3 mL de tampón de MCS en el depósito y esperar a que el embalse de column´s está vacío antes de realizar el siguiente paso de lavado.
    8. Recoger las células sin etiqueta pasando la columna utilizan para seguir los pasos de separación (que representa el CD45 fracción– ). Etiquetado células (representando el CD45+ fracción) acumulados en la columna puede ser desechada.
  6. Se acumulan CD31+ las células siguientes CD31 microbeads del fabricante. Para todos los siguientes pasos de CD31+ acumulación utilizan búfer MCS.
    Nota:     este paso tarda unos 60 minutos.
    1. Determinar el número de celular utilizando una celda de Neubauer recuento de cámara (esperar aproximadamente 4 x 106 células por g de tejido muscular).
    2. Centrífuga obtenido suspensión de células sin etiqueta de paso 3.5 por 10 min a 300 x g a 4 ° C.
    3. Quite completamente el sobrenadante. Resuspender el precipitado en tampón MCS de 90 μL y añadir 10 μL de microesferas de CD31 (por 107 de células totales o menos). Mezclar la suspensión entera e incubar durante 15 min en la nevera a 4-8 ° C.
    4. Añadir 1mL de tampón de MCS y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender las células en 500 μl de tampón MCS.
    5. Para la separación magnética de células utilizar una columna magnética media (MMC) con un volumen de embalse de 3.5 mL y una capacidad de hasta 2 x 108 células totales.
    6. Coloque el MMC en el campo magnético del separador. Enjuague el MMC con 500 μl de tampón MCS. Después de enjuagar, colocar un tubo cónico de 15 mL por debajo de la columna para recoger el flujo a través.
    7. Aplicar la suspensión de células enteras (500 μl) sobre la columna y dejar totalmente flujo a través.
    8. Lavar la columna tres veces al agregar 500 μl de tampón MCS y espere hasta que el depósito de la primera columna está vacía antes de realizar el siguiente paso de lavado. Las células pasando la columna representan el CD45– CD31 fracción– . Guárdelo para más controles de calidad.
    9. Retire el separador de columna y colóquelo en un tubo de recogida (tubo 15 mL). Pipeta 2 mL MCS de tampón sobre la columna. Limpie inmediatamente las células magnéticamente etiquetado empujar firmemente el émbolo en la columna. Este CD45– CD31+ fracción representa a la EC murino primario enriquecido
    10. Suspensión de células de centrifugar 5 min a 350 x g a 20 ° C. Quite completamente sobrenadante y resuspender las células (esperar alrededor de 0.6 x 106 células por g de tejido muscular) en 1 mL de ECM (vea el paso 2.2.). Transferencia (0,5 – 0,7 x 106 células) a un único pozo de una placa de cultivo de 6 pozos recubiertos (del paso 2.3) que contiene 1 mL de ECM.
  7. Para el cultivo, se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora estéril. Actualizar el ECM cada dos o tres días.

4. primaria MMEC murino purificación

  1. Realizar un segundo ciclo de CD31+ acumulación, siguiendo las instrucciones del fabricante (CD31 microbeads protocolo del ratón; vea paso 3.6.).
    1. Separar las células con solución de tripsina/EDTA cuando están en 80-90% de confluencia (generalmente después de 7 días). Para ello, lavar cada pocillo con 2 mL de PBS estéril, en dos pasos consecutivos de lavado. Utilizar solución de tripsina/EDTA de 800 μL por pocillo 6 e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora estéril por 3 a 5 minutos parada de actividad enzimática utilizando 1200 μL DMEM con un mínimo de 10% FCS.
    2. Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 350 x g a 20 ° C.
    3. Realizar el segundo paso de CD31-MCS para aumentar la pureza (de acuerdo a las instrucciones de CD31 microbeads manufacturer´s; ver 3.6.).
    4. Observar células confluencia vía campo brillante o estándar de contraste de fase microscopio usando un
      20 aumentos y apertura numérica de la lente 0.35. Vea la figura 1.
      Nota: Las células pueden ser utilizadas para experimentos respectivos o mantenidas en cultivo por pases. Utilizar células para experimentos puntualmente en pasos inferiores. Se recomienda no utilizar las células después de paso
      8 – 10.

5. Control de calidad

  1. Realizar citometría de flujo de MMEC murino primaria después del segundo paso de MCS CD31.
    1. Preparar un tubo de FACS agregando 1 mL flujo cytometry (FC) de tampón (ver adjunto Tabla de materiales).
    2. Separar las células con solución de tripsina/EDTA cuando están en el 100% de confluencia (generalmente después de 14 días). Para ello, lavar cada pocillo con 2 mL de PBS estéril, en dos pasos consecutivos de lavado. Utilizar solución de tripsina/EDTA de 800 μL por pocillo 6 e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora estéril por 3 a 5 minutos parada de actividad enzimática utilizando 1200 μL DMEM con 10% FCS.
    3. Determinar el número de celular utilizando un Neubauer recuento celular cámara y añadir un mínimo de 1 x 105 células en el tubo preparado de FACS.
    4. Suspensión de células de centrifugar 10 min a 300 x g a 4 ° C. Realizar dos pasos de lavado eliminando el sobrenadante, resuspender las células en 1 mL FC de tampón y centrifugar 10 min a 300 x g a 4 ° C.
    5. Preparar una mezcla de tinción mediante la adición de anti-ratón CD31-FITC anticuerpo (1: 100) y anti-ratón CD45-PE (1: 100) con tampón de FC.
    6. Resuspender las células en 100 μL de la mezcla en los tubos de la FACS de la coloración. Incubar durante 30 min a 4 ° C. Añadir 1 mL de tampón FC. Suspensión de células de centrifugar 5 min a 300 x g a 4 ° C. Con cuidado quite el sobrenadante y resuspender las células en 200 μL de tampón FC.
    7. Medida de células en un citómetro de flujo siguiendo la estrategia bloquea se muestra en la figura. 2A.
  2. También puede realizar inmunofluorescencia tinción de MMEC murino primaria después del segundo paso de MCS CD31.
    1. Capa el cubreobjetos.
      1. La transferencia estéril de 13 mm de diámetro redondo cubreobjetos de cristal en un pozo de una placa bien 24. Cubreobjetos de capa añadir 300 μL de solución de recubrimiento de velocidad por pozo. Incubar durante 3 – 5 min a temperatura ambiente (RT).
      2. Aspirar y descartar la solución de recubrimiento. Lave cada pocillo con 2 mL de PBS estéril en dos pasos consecutivos de lavado. Aspirar y descartar el PBS.
      3. Semilla 1 x 105 células en 1 mL de ECM en el cubreobjetos recubierto e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora estéril hasta que las células son 99% confluente.
    2. Realizar la fijación y tinción de inmunofluorescencia.
      1. Retire el medio ECM de células cultivadas de 5.2.1.3.
      2. Fije las células cultivadas mediante la adición de paraformaldehído al 4% de 300 μL (PFA) con pH de 7.4 por pozo, 10 min a 4° C.
        PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.
      3. Realizar 3 pasos de lavado agregando 1 mL de PBS por pozo y sobrenadante después de 5 min a TA.
      4. Preparar un bloqueo solución que contiene 5% BSA, 0.2% Triton-X y el 1% de suero de cabra en PBS.
      5. Añadir 300 μL de solución de bloqueo a cada pozo e incubar 1 h a TA.
      6. Quite el sobrenadante y agregar 200 μL por pocillo de un anti-PECAM-1 (CD31) anticuerpo (1: 200) en 5% BSA, suero de cabra de 1% en PBS e incubar a 4 ° C durante la noche.
      7. Realizar 3 lavado pasos agregando 1 mL de PBS por bien y eliminar sobrenadante después de 5 min a temperatura ambiente en cada paso.
      8. Preparar una solución de anticuerpo secundario conjugado con Cy3 anti-rata IgG del anticuerpo (1: 500) en 1% de BSA y PBS. Añadir 300 μL por pocillo de la solución de anticuerpo secundario e incubar 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
      9. Realizar 3 lavado pasos agregando 1 mL de PBS por bien y eliminar sobrenadante después de 5 min a temperatura ambiente en cada paso.
    3. Sacar con cuidado el cubreobjetos de vidrio redondo con pinzas y ponerlo sobre un portaobjetos de microscopía. Agregue una cantidad apropiada de DAPI que contiene medio de montaje sobre la capa de células y cuidadosamente puso un cubierta de vidrio (véase adjunto Tabla de materiales).
    4. Observar las células con un microscopio de fluorescencia adecuado equipado con una fuente de luz de fluorescencia (120 W) y dos conjuntos de filtro: un filtro de excitación/emisión de conjunto con 550/25 nm y longitudes de onda de nm 605/70 para detectar Cy3 540/562 nm.
    5. Utilizar un segundo filtro con una longitud de onda de excitación/emisión de 365/50 nm y 445/50 nm para detectar DAPI 350/440 nm. Usar un aumento de x 40 y 80% de intensidad de 14.5 mW/cm2 para DAPI con una duración de la adquisición de 30 ms. para la detección de Cy3 uso 80% de 67,5 mW/cm2 con una duración de la adquisición de 60 ms.
  3. Realizar PCR cuantitativa.
    1. Aislamiento del mRNA.
      1. Siga los procedimientos estándar mediante un reactivo de ácido Guanidinio tiocianato-fenol (AGTP) para aislar mRNA. Utilizar un mínimo de 0.5 x 106 células CD45– CD31– (ver paso 3.6.8), CD45– CD31+ (ver paso 3.6.9.) fracciones y cultivada MMEC murino primaria (4.1.3)
      2. Suspensión de células de centrifugar 10 min a 300 x g a 20 ° C. Sacar completamente el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de suspensión AGTP reactivo y la transferencia de células en un tubo de ensayo 2 mL. Incubar por 5 min a TA.
      3. Añada 100 μl de cloroformo y agite vigorosamente por 15 s. Incubar 3 min a TA.
      4. Suspensión de la centrífuga durante 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
      5. Despegar la parte superior fase acuosa (que contiene RNA) cuidadosamente y transferir a un tubo de reacción de 1,5 mL. Añadir 250 μl de isopropanol e incubar 10 min a TA.
      6. Realizar un paso de centrifugación a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
      7. Quite el sobrenadante y agregar cuidadosamente 1 mL de etanol al 75%. Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C.
        Nota: Pellet es fácil de perder.
      8. Quite completamente el sobrenadante. Que el sedimento seco en el aire 5-10 minutos.
        Nota: etanol debe eliminarse pero no no se seque demasiado.
      9. Disolver el pellet en 30 μL diethylpyrocarbonate tratar agua que contiene en y calentar 10 min a 55 ° C.
        Nota: Pureza y concentración del RNA se pueden medir por un espectral-fotómetro.
    2. Realizar síntesis de cDNA (polimerización en cadena de la transcriptasa reversa).
      1. Preparar un mastermix que contiene: 10 μl de tampón PCR (5 x), 2,5 μl desoxyribonucleosid-trifosfato (dNTP (10 mM)), mezcla al azar de 0,5 μl de primer monocatenario (0,2 μg / μl), 1 μl de inhibidor de la Rnasa (40 U / μl, 0.4 reversa transcriptasa (200 U/μL) y 5.6 μl de diethylpyrocarbonat agua tratada (ver adjuntada tabla de materiales).
      2. Diluir 500 ng RNA en 30 μl de agua tratada diethylpyrocarbonate en 0,2 mL tubos de PCR y añadir el mastermix entero de 20 μl.
      3. Utiliza un ciclador PCR realizando siguiendo pasos: 10 min 25 ° C, 30 min 50 ° C, 5 min 85 ° C y mantener a 4 ° C.
  4. Realizar PCR cuantitativa (qPCR).
    Nota: Realizar qPCR de muestras en duplicado o triplicado.
  5. Usar imprimación con dos tintes diferentes fluorescencia. Cartilla con una absorción de 495 nm y una emisión de 517 nm para el gen de interés.
  6. Para la detección de la expresión de genes del marcador de célula satélite, uso de cebadores para la proteína de sincronizado caja 7 (Pax7) y M-cadherin (Cdh15) (véase la adjunta Tabla de materiales).
  7. Para la detección de la expresión de genes marcadores de células endoteliales, usar primers de claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) y zonula occludens-1 (Tjp1 o ZO1) (ver adjuntada tabla de materiales).
  8. Gen de referencia para el 18s rRNA, utilizar una cartilla con la absorción de 538 nm y una emisión de longitud de onda nm 554.
  9. Preparar un mastermix de qPCR para cada gen de interés, con la cartilla respectiva. Mastermix contiene: 10 μl buffer de qPCR (x 2), 1 μl de cebador para el gen de interés (10 μm), 1 μl de cebador para 18s rRNA y 4 μL de nucleasa agua libre.
  10. Añadir 16 μl del mastermix a un único pozo de una placa de 96 pocillos de reacción. Añadir 4 μL de cDNA (Obtenido de paso 5.3.2.) por que también contiene el mastermix.
  11. Utiliza un ciclador PCR en tiempo real realizar siguiendo pasos: holding etapa con 50 ° C por 2 min y 95 ° C durante 10 minutos etapa de ciclismo con 40 ciclos de 95 ° C 15 s y 60 ° C durante 1 minuto.

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Representative Results

Un día después de aislamiento, principal MMEC murino y residual otras células forman conglomerados y se adhieren a la parte inferior de los platos de la cultura (figura 1A día 1). Del día 7, se pueden observar células alargadas y planas. Sin embargo, la contaminación de otros, sobre todo células del esferoide, es aún visible (figura 1A día 7). Así, otro ciclo de CD31 positiva selección vía MCS se requiere. En adelante, primaria MMEC murino proliferan a una densidad de aproximadamente 80-90%. A confluencia por lo general forman una monocapa no superpuestas de células alineadas longitudinalmente (figura 1A día 14). Proliferación se detiene sobre confluencia debido a la inhibición de contacto. Después de 14 días sobre 5-10 x 105 células puede ser utilizado para otras investigaciones.

Control de calidad mediante citometría de flujo utilizando medio de contraste viabilidad fijable FVD780 (para tinción de las células muertas), PECAM1 (CD31) y PTPRC (CD45, como marcador para las células de origen hematopoyético) mostraron valores de viabilidad y pureza que van alrededor de 70% cada uno para las células inmediatamente después el aislamiento (figura 2A). Células cultivadas después otro CD31 selección positiva a través de MCS, mostró satisfacción de valores de pureza, así como por la viabilidad que se extienden hasta 95% cada uno (figura 2B).

Para evaluar la exactitud de la selección pasos, obtenidos células fueron investigados más de expresión del gen de la proteína del músculo célula satélite marcador genes pares caja 7 (Pax7) y M-cadherin (Cdh15) a nivel de mRNA por PCR cuantitativa (qPCR). Primaria MMEC murino (pmMMEC) y las células del músculo murino primaria diferenciada (pmMC) se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. Las células musculares murinas fueron compradas comercialmente. Como era de esperar, sólo el CD45– CD31 fracción– , así como el pmMC expresó Pax7 y Cdh15, considerando que el CD45– CD31+ y la primaria murina MMEC fueron negativas para estos marcadores (figura 2).

CE se deriva de los capilares en el endomysium de músculo esquelético expresa estrecha ensambladura proteínas 4,5. Utilizando qPCR, la expresión de claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) y zonula occludens-1 (Tjp1 o ZO1) de MMEC murino primario confluente después el MCS de CD31 segunda paso fue evaluado. PmMC fueron utilizados como controles (Figura 2D). MMEC murino primaria expresaron altos niveles de Cld5y Ocln Tjp1, considerando que el pmMC sólo muestran baja expresión de Tjp1. Además, la inmunofluorescencia que manchaba como control de calidad confirmó la expresión superficial del marcador específico de endotelio PECAM1 en primaria MMEC murino (Figura 2E).

Figure 1
Figura 1: morfología de MMEC murino primaria. (A) imagen representativa de MMEC murino primaria cultivada por microscopia de contraste de fase de días 1 a 14. D1 = día 1, d7 = día 7, d14 = 14 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: control de calidad de MMEC murino primaria. Estrategia para el análisis cytometric del flujo primario MMEC murino inmediatamente después de aislamiento (A) y el día 15 (B) (I) usando FSC/SSC, (II) FVD780 y (IIIa) CD45, CD31 (IIIb) que bloquean (discontinuas líneas = control de isotipo). (C) expresión de Pax7 y M-Cadherin (Cdh15) en CD45– CD31-, CD45– CD31+ fracciones después aislamiento de MCS, así como en primaria MMEC murino (pmMMEC) y las células del músculo murino primaria (pmMC ). Niveles de expresión se muestran como valores det ΔC (muestra - 18S rRNA), n.d. = no determinado. (D) expresión de proteínas de Unión estrecha claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) o zonula occludens-1 (Tjp1 o ZO-1) de pmMMEC y pmMC, se muestra como valores det ΔC. (E) inmunofluorescencia que manchaba para PECAM1 (rojo) en cultivo primario murino MMEC 24 h después de la segunda selección positiva de CD31. Nuclear de tinción con DAPI (azul)-que contiene el medio de montaje; izquierda = anti-PECAM1/DAPI, derecha: negativo control/DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las células endoteliales microvasculares proporcionan funciones de barrera en todos los tejidos y los resultados de la disfunción en la enfermedad de los órganos asociados 3. Por otra parte, estudios de órgano-específicas de la CE microvascular podrían allanar el camino para nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, una comprensión más profunda de la función microvascular de CE bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es de gran interés científico. Modulación de la interacción leucocito/endotelio es utilizado con éxito para tratar a pacientes de esclerosis múltiple con natalizumab, un anticuerpo que evita la adhesión de linfocitos y de tal modo transmigración 6. Sin embargo, varias miopatías incluyendo los subtipos inflamatorios aún siguen siendo sólo mal tratables hasta la fecha. Por lo tanto, elucidación de las propiedades EC específicamente en el endotelio del músculo esquelético podría ayudar a ampliar los tratamientos disponibles para myopathy o resultado en nuevos enfoques terapéuticos.

Líneas inmortalizadas de la célula endotelial (IECL) han sido establecidas y usado para varios modelos in vitro. Estas líneas celulares ofrecen algunas ventajas en comparación con la primaria CE microvascular por la inmortalización y la rápida proliferación. Además, cultivos primarios de células pueden someterse a senescencia y perder o cambiar su morfología o función fisiológica después de algún tiempo o pasajes. Sin embargo, IECL sólo mantener algunas propiedades de la célula endotelial y no se parecen a la variedad de diferentes transmitidas por el órgano primario microvascular CE. De nota, rara vez se derivan de los músculos esqueléticos. Hasta la fecha, sólo una sola publicación describe una línea de células endoteliales microvasculares esquelético humano llamada TSM15 5. En cambio, CE microvascular murino se han descrito hasta ahora. Por último, pilas de animales transgénicos ofrecen la oportunidad de estudiar modificaciones genéticas in vitro. Sin embargo, las culturas de célula primaria también tienen ciertas dificultades. En primer lugar, la contaminación con células de ningún interés puede interferir en la validez de los resultados experimentales. Por lo tanto, deben garantizarse la exactitud de los varios pasos de selección y una pureza alta de células aisladas. Suspensión de la célula después de la disociación del tejido muscular contiene eritrocitos y células mononucleares distintos tipos como las células inmunes, las células satélite, pericitos, fibroblastos y células endoteliales 7. Por lo tanto, fracciones de la célula después del paso de CD31 MCS fueron probadas para marcadores expresados exclusivamente por las células satélite del músculo. Como CD45 esperado– CD31 fracción– y células primarias del músculo demostraron la expresión de Pax-7 y Cdh15 , mientras que CD45– CD31+ y cultivada primaria MMEC murina eran negativos para estos marcadores después de un segundo CD31 Paso MCS. Además un control de calidad de células aisladas o cultivadas es inevitablemente garantizar experimentos fiables y reproducibles. Existen varios métodos para el control de calidad de MMEC murino primaria: además de microscopía de propiedades morfológicas, citometría de flujo, PCR e inmunofluorescencia los stainings para marcadores característicos de EC (CD31, Sca-1) puede ser utilizados. Evaluación de pureza de MMEC murino primaria recién aislado era solamente cerca de 60-70%, mientras que se pudo detectar una viabilidad de cerca de 70%. Microscopía de estas células muestra parcialmente conglomerados de células, que pueden ser de células contaminantes tales como fibroblastos o del pericitos adjunta de la CE. Después de 7 días se observan principalmente células planas y alargadas y las células de esferoide. Sin embargo, dos pasajes de CD31 MCS resultaron en pureza y alta viabilidad. Alternativas para aumentar la pureza tales como los medios de comunicación que contiene la puromicina fallaron en primaria murina MMEC siendo eficaz en murine del cerebro microvascular CE 8.

Ya que CE microvascular derivado de capilares expresan proteínas de Unión estrecha, expresión génica de Cld5y Ocln Tjp1 en primaria MMEC murino frente a células musculares diferenciadas fue examinado. Como era de esperar todas las moléculas de la ensambladura apretada fueron detectadas en primaria MMEC murino. En comparación, las células del músculo demostraron solamente baja expresión de Tjp1, mientras que ninguna expresión de Cld5 y Ocln podría ser determinada. Similares patrones de expresión fueron demostrados previamente en músculo esquelético todo murino. Aquí, se pudo detectar una expresión a nivel gene y proteína Tjp1 pero no occludin 9. Más características funcionales tales como transendothelial resistencia podrían ser medidos.

El protocolo aquí descrito ofrece sólo el aislamiento de la CE microvascular del tejido fino del músculo murino. Sin embargo, puede transferirse a otras especies como por ejemplo que un protocolo similar fue publicado por rata que microvascular CE deriva de almohadillas de grasa epididimales. Aquí, CD31 selección positiva a través de MCS fue precedida de densidad gradiente de centrifugación 10. Enfoques similares fueron exitosos en aislamiento macrovasculares CE rata arterias femorales 11. Un método recientemente publicado para aislar CE microvascular de los tejidos del corazón y del pulmón utiliza CD31 y endoglina (CD105) como antígenos de célula magnética clasificación 12. Sin embargo, la pureza de la CE podría no ser incrementada usando separación de grano magnético CD105 adicional. Otra posibilidad para aislar y purificar primaria MMEC murino es célula multicolor fluorescencia activada (FACS) de clasificación. Una población distinta de Sca-1+, CD31+, CD34dim y CD45– las células de los músculos murinos podría ser aisladas y caracterizado como primaria murinas MMEC 13. Una ventaja de este método es una población pura de CE que puede ser utilizada directamente o cultivada para experimentos adicionales (tenga en cuenta que en nuestra experiencia FACS conduce a mayor muerte celular debido a la tensión más alta de la célula). Más células muertas o conglomerados de diferentes tipos de células pueden reducir significativamente el número de células aisladas por FACS. Además, se divulga que MMEC murino primaria aislada por FACS sin éxito fueron cultivadas en condiciones de cultivo comúnmente usados de 21% O2 y 5% CO2. Aquí, el nivel de oxígeno tuvo que ajustarse al 5% para una suficiente cultivo 13. Por otra parte, la técnica de FACS es más complejo y desperdiciador de tiempo y las condiciones de infraestructuras son caras.

El cuadriceps de musculus femoris y el musculus triceps surae de ratones machos en la edad de 4 a 12 semanas son los más adecuados para el aislamiento de primaria MEC murino como son fácilmente accesibles y lo suficientemente grande como para el aislamiento de un número suficiente de células (5-10 x 105 por gramo de músculo). Por lo tanto, debe garantizarse que las condiciones son comparables en experimentos independientes. Como se describió anteriormente, las células primarias puede someterse a senescencia. Por lo tanto, utilizar las células para los respectivos experimentos puntualmente en pasos inferiores. Después paso MMEC murino primaria 8 – 10 cambiar su morfología, demuestran tasas de proliferación lenta y perder su inhibición de contacto como señales para la diferenciación y la senescencia.

Fomente allí son algunas notas para la solución de problemas de este protocolo. Trabajo estéril es esencial para evitar contaminaciones. Controles de calidad son necesarios para monitor de pureza y viabilidad de las células aisladas. Materiales utilizados en el presente Protocolo deben ser almacenados y aplicados según las instrucciones del fabricante. Adicional, edad y sexo de los animales utilizados, así como diferentes grupos musculares pueden influir en la calidad y comparabilidad de células aisladas en los experimentos.

El protocolo descrito puede considerarse método de plataforma para aislar primaria CE microvascular de los músculos esqueléticos. Células aisladas pueden utilizarse para varias aplicaciones para obtener más ideas sobre la función de barrera de sangre del músculo. Las células son adecuadas para proteínas y estudios de expresión de RNA, así como análisis funcionales (incluyendo estudios de transmigración y adherencia). Sin embargo, este protocolo fue optimizado para estudios centrados en procesos inflamatorios y por lo tanto, ligeras modificaciones pueden que sea necesarios con respecto a áreas de investigación diferentes.

Para modelar las interacciones celulares espaciales y funcionales complejas dentro la MVU, primaria MMEC murino se puede cultivar en sistemas más complejos de la cultura de célula 3D junto con otros tipos de células. Anticipado, también debe ser posible generar MVU organoides, como se ha descrito para otros tejidos antes de 14. Sin embargo, acertado aislamiento de primaria MMEC murino es inevitable con el objetivo de este paso.

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Disclosures

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el "Else Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 TR), "Innovative Medizinische Forschung (FMI) Münster" (I-RU211811 a TR) y la Fundación alemana de investigación (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 y ME 3283/6-1 a las SGM). Ilustrado imágenes proporcionadas por Heike Blum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

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References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

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Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

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