Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering av primära murina skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Mikrovaskulära endotelceller i skelettmuskulaturen (MMEC) forma den inre väggen av muskel kapillärer och reglera båda, utbyte av vätskor/molekyler och migration av (immunceller) mellan muskelvävnad och blod. Isolering av primära murina MMEC, kan som beskrivs här, omfattande in vitro-undersökningar av enheten ”myovascular”.

Abstract

Endotelceller i skelettmuskulaturen kapillärerna (muskel mikrovaskulära endotelceller, MMEC) bygga upp barriären mellan blodet och skelettmuskulaturen reglerar utbyte av vätskor och näringsämnen samt immunsvaret mot smittsamma agenter genom att kontrollera immunceller migration. För dessa funktioner, MMEC bildar en funktionell ”myovascular unit” (MVU), med ytterligare celltyper, såsom fibroblaster, pericyter och skelettmuskel celler. Följaktligen, en dysfunktion i MMEC och därför MVU bidrar till en stor mängd myopatier. Dock regleringsmekanismer av MMEC i hälsa och sjukdom förbli otillräckligt förstådda och deras klargörande föregår mer specifika behandlingar för myopatier. Isolering och djupgående utredning av primära MMEC funktioner i samband med MVU kan underlätta en bättre förståelse av dessa processer.

Denna artikel tillhandahåller ett protokoll för att identifiera primära murina MMEC av skelettmuskulaturen med mekaniska och enzymatisk dissociation inklusive rening och kultur underhåll steg.

Introduction

Via blodbanan, celler och organ levereras med syre, substrat och andra nödvändiga molekyler. Detta utbyte sker i kapillärerna, de minsta kärlen. Kapillärer bildas genom ett inre endotelceller (EG) lager vars integritet är fortfarande en förutsättning för framgångsrik reglering av muskel homeostas mellan det intravaskulära och interstitiell utrymmet. För att säkerställa en selektiv övergång av lösliga faktorer och celler, EG utgör en enskiktslager sammankopplade med tight och adherens föreningspunkter 1. Förutom sin roll som barriär för näringsämnen eller metaboliska produkter reglera EG rekrytering av leukocyter i inflammatoriska processer. Inflammation eller vävnad skada leder till en Uppregleringen av adhesionsmolekyler på EG ytan och produktion av kemokinerna underlätta leukocyt fastsättning och själavandring in i målet vävnad 2. EG är därför kritiskt involverade i regleringen av inflammatoriska processer såsom försvar mot patogener eller vävnad reparera.

En dysfunktion i EG är direkt associerade med vaskulära sjukdomar, kronisk njursvikt, venös trombos svår patogen infektioner. EG är dessutom nästan alltid involverade i organ-specifika autoimmunitet såsom diabetes mellitus eller multipel skleros 3. Barriärfunktionen mellan blodet och organ styrs därför av ett samordnat samspel av olika celltyper. I skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller (MMEC) tillsammans med muskelceller, fibroblaster och pericyter bildar en funktionell enhet, enhetens ”myovascular” (MVU). Därför kan en dysfunktion i MVU spelar en avgörande roll i patofysiologin bakom myopatier. Dock en djupare förståelse för dessa reglerande mekanismer saknas fortfarande och för närvarande utgör hinder för identifiering av nya, brådskande, terapeutiska mål i myopatier.

För att undersöka de komplexa fysiologiska och patofysiologiska mekanismerna, används djurmodeller ofta. In vitro- modeller erbjuder emellertid fördelen att fokusera på föremål för intresse genom att utesluta en mängd störfaktorer. För att undersöka processer in vitro-är det nödvändigt att isolera ren och livskraftig primära celler. I motsats till cellinjer aktivera primära celler isolerade från transgena djur för att undersöka konsekvenserna av genetiska modifieringar in vitro.

Här beskrivs en metod för att isolera primära murina MMEC med hjälp av mekaniska och enzymatisk dissociation följt av magnetiska aktiverad cell sortering tekniker (MCS) för rening. För detta ändamål används magnetiska pärlor mot specifika yta markörer. Trombocytantal endothelial celladhesionsmolekyl-1 (PECAM1, CD31) uttrycks huvudsakligen på EG och kan användas för att berika denna celltyp. För att garantera hög cell renhet, utesluts celler av hematopoetiska ursprung som ett negativt urval för protein tyrosin fosfatas receptor typ C (PTPRC, CD45). Ytterligare, kvalitetskontroller, odling av primära murina MMEC, potentiella tillämpningar samt begränsningar och särskilda överväganden presenteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av de lokala myndigheterna och bedrivs enligt lagen om tyska djurskydd (84-02.05.20.13.097).

1. allmänna kommentarer om djurförsök

  1. Utföra alla musen experiment i enlighet med riktlinjerna i de respektive institutionella Djurvård och använda kommittén.
  2. Hålla möss under standardiserade förhållanden och enligt internationella riktlinjer såsom federationen för Laboratory Animal Science Associations (FELASA).
    Obs: Denna isolering teknik kan i allmänhet användas för möss oberoende av ålder, kön eller genetisk bakgrund. För att erhålla en tillräcklig cell nummer, är 4 – 10 veckors gamla hanar att föredra, eftersom biologiska egenskaper kan variera med ålder och kön.

2. beredning av lösningar, Media och beläggning

  1. Förbereda matsmältningen lösning (DS) genom att blanda 2.2 mL av Dulbecco´s modifierade Eagle Medium (DMEM) med 200 μL kollagenas-Dispase och 45 μL Desoxyribonuclease (DNase).
  2. Förbered 500 mL endotelceller medium (ECM) genom att blanda 450 mL DMEM med 50 mL FCS (cirka 10%), 0,25 mL basic fibroblast tillväxtfaktor bFGF (20 μg/mL, ca 0,05%) och 5 mL penicillin-streptomycin (1%). Utföra steril filtrering i ett glasrör (diameter av filtret porer: 0,2 μm). Därefter förvara lösningen vid 4 ° C.
  3. Coat cell kultur plattor som beskrivs nedan.
    1. För odling av nymalen isolerade primära murina MEC täcka hela ytan med 1 mL per brunn en 6 väl cell kultur plattan med en gelatin baserat hastighet beläggning lösning (se Tabell för material) enligt tillverkarens anvisningar för 3 – 5 min på rummet temperatur (RT).
    2. Aspirera och kasta beläggning lösning. Skölj varje brunn med 2 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7.1 – 7.5 i två på varandra följande tvätt steg.
    3. Aspirera och kasta PBS. Fyll upp brunnar med 1 mL volym av ECM.

3. isolering av primära murina muskel mikrovaskulära endotelceller (MMEC)

  1. Avliva ett vuxen 4 – 12 veckor gamla, manliga mus av cervikal Dislokation utan någon bedövning. Syftet är att snabbt skilja ryggmärgen från hjärnan för att ge djuret en snabb och smärtfri död.
  2. Sever extremiteter.
    1. Använda en kirurgisk sharp/trubbig (framkant 42 mm, rak) och sharp/sharp (framkant 23 mm, rak) sax, en rak (tandad, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) och en böjd (tandade, 1,3 mm x 1 mm x 13 cm) pincett.
    2. Desinficera alla kirurgiska instrument med 70% etanol.
    3. Placera djuret på ryggen, fukta benen med 70% etanol. Sever hela benet genom att skära på höftleden med den skarpa/blunt kirurgisk sax. Placera extremiteter i en sluten cell kultur maträtt (35 x 10 mm).
      Obs: Från nu på utföra varje steg under en steril LAF och arbeta med steriliserade instrument.
  3. Isolera muskelvävnad (företrädesvis använder musculus quadriceps femoris eller musculus triceps surae från båda benen).
    1. Uppskuren huden från höften till tå-spetsen med hjälp av en skarp/skarp sax och böjd pincett. Håll den tå eller footpad med raka pincetten. Dra av huden med böjda pincetten från tån till höften.
    2. Isolera den musculus quadriceps femoris genom att skära senan från knäet och sever muskeln längs femur till höften. Isolera den musculus triceps surae genom severing hälsenan. Härefter, skär längs skenbenet till Poplietallymfknutor fossa och ta bort muskeln.
      Obs: Om stora fartyg (A. femoralis, A. tibialis anterior, A. tibialis posterior, A. fibularis) är synliga i de isolerade musklerna, ta bort fartyg för att undvika kontaminering av makrovaskulära endotelet.
    3. Ta bort stora fartyg, hålla delen av muskeln som inte innehåller stora fartyg med en böjd pincett och avskurna det bredvid fartyget. För detta protokoll rekommenderas 1 g eller mindre muskelvävnad motsvarar både quadriceps femoris och triceps surae .
    4. Tillsätt 2.445 µL DS (från steg 2.1) till en cell kultur maträtt (35 x 10 mm) och fastställa vikten.
    5. Överföra alla muskel bitar till denna cell kultur maträtt som innehåller den 2445 µL DS och fastställa vikten. Skillnaden av båda mätvärdena ger torr vikt av muskelvävnad som inte får överstiga 1 g.
    6. Skär hela muskelvävnad i små bitar (≤2 mm kuber, ca 100 stycken) med hjälp av den skarp/skarp sax.
  4. Avstånd i muskelvävnaden.
    Obs:     detta steg tar ca 120 min.
    1. Store muskel/DS suspension vid 37 ° C (inkubator med 5% CO2) för 1,5 h. blanda suspensionen noggrant varje 20 min för ca 5 min med en 1 mL spruta som insulin.
    2. Överföra suspension till en 70 μm nylon cell sil placeras på en 50 mL tub och samla flödet genom. Tvätta cell Silen med 8 mL DMEM och samla flödet genom.
    3. Kassera cellsuspension sil och Centrifugera i 10 min vid 300 x g vid 20 ° C. Ta försiktigt bort supernatanten.
      Försiktighet: pellets är lätt att förlora.
    4. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL av en Ammonium-klorid-kalium (ACK) lysing buffert (se bifogad Tabell för material) för lys av röda blodkroppar och inkubera i 30 s vid RT. lägga till 9 mL DMEM + 10% FCS att stoppa cellsuspensionen reaktion och överföring till en 15 mL t UBE.
  5. Bryter ned CD45+ celler efter CD45 Mikrokulor tillverkarens anvisningar. För alla följande steg i CD45+ utarmning använda MCS buffert (se bifogad tabell för material).
    Obs:     detta steg tar ca 60 min.
    1. Bestämma cell nummer med hjälp av en Neubauer cell räknar kammare (räkna med ca 5 x 106 celler per g muskelvävnad).
    2. Centrifugera fjädring på 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Helt ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 90 µL MCS buffert (per 107 celler eller mindre). Tillsätt 10 μL av CD45 Mikrokulor (per 107 celler eller mindre).
    3. Blanda cellsuspension och inkubera i 15 min i kylskåpet i 4 – 8 ° C.
    4. Tillsätt 1mL MCS buffert (per 107 celler eller mindre). Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Helt avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 μL MCS buffert.
    5. För magnetiska cellseparation Använd en stor magnetiska kolumn (LMC) med en reservoar volym på 8 mL och en kapacitet på upp till 2 x 109 totalt celler. Placera LMC i det magnetiska fältet i separatorn.
    6. Skölj med 3 mL MCS buffert in i reservoaren av LMC. Efter sköljning, placera en 15 mL koniska rör under kolumnen att samla flödet genom. Gäller hela cellsuspensionen (500 µL) på kolumnen och låt det helt flöde.
    7. Tvätta kolonnen tre gånger genom att tillföra 3 mL MCS buffert i behållaren och vänta tills column´s behållaren är tom innan du utför nästa tvätt steg.
    8. Samla de omärkta cellerna passerar kolumnen använda för ytterligare separation steg (som representerar CD45– fraktion). Märkt celler (som representerar CD45+ bråkdel) ackumuleras i kolumnen kan kasseras.
  6. Ackumulera CD31+ celler följande CD31 Mikrokulor tillverkarens anvisningar. För alla följande steg i CD31+ ansamling använda MCS buffert.
    Obs:     detta steg tar ca 60 min.
    1. Bestämma antalet celler med hjälp av en Neubauer cell räknar kammare (räkna ca 4 x 106 celler per g muskelvävnad).
    2. Centrifugen erhålls omärkt cellsuspension från steg 3.5 för 10 min vid 300 x g vid 4 ° C.
    3. Ta bort supernatanten helt. Återsuspendera pelleten i 90 μl MCS buffert och tillsätt 10 μL av CD31 Mikrokulor (per 107 totala celler eller mindre). Blanda hela suspensionen och inkubera i 15 min i kylskåpet i 4 – 8 ° C.
    4. Tillsätt 1mL MCS buffert och centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 µL av MCS buffert.
    5. För den magnetiska cellseparation Använd en medellång magnetiska kolumn (MMC) med en reservoar volym 3,5 ml och en kapacitet på upp till 2 x 108 totalt celler.
    6. Placera MMC i det magnetiska fältet i separatorn. Skölj av MMC med 500 µL av MCS buffert. Efter sköljning, placera en 15 mL koniska rör under kolumnen att samla flödet genom.
    7. Gäller hela cellsuspensionen (500 µL) på kolumnen och låt det helt flöde.
    8. Tvätta kolonnen tre gånger genom att lägga till 500 µL av MCS buffert och vänta tills kolumnens behållaren är tom innan du utför nästa tvätt steg. Omärkta celler passerar kolumnen representerar CD45– CD31– fraktion. Lagra dem för ytterligare kvalitetskontroller.
    9. Ta bort kolumnen från separatorn och placera den på en lämplig insamling tube (15 mL tub). Överför med pipett 2 mL MCS buffert på kolumnen. Spola omedelbart ut magnetiskt märkt cellerna av fast kolven in i kolonnen. Detta CD45– CD31+ bråkdel representerar primära berikad murina EG.
    10. Centrifugera cellsuspension för 5 min på 350 x g vid 20 ° C. Helt ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna (förväntar sig runt 0,6 x 106 celler per g muskelvävnad) i 1 mL ECM (se steg 2.2.). Överföra (0,5 – 0,7 x 106 celler) till en enda väl belagda 6-väl kultur platta (från steg 2.3) som innehåller 1 mL av ECM.
  7. För odling, Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 i en steril inkubator. Uppdatera ECM varje två till tre dagar.

4. primära murina MMEC rening

  1. Utföra en andra cykel CD31+ ackumulering, efter tillverkarens anvisningar (CD31 Mikrokulor mus protokollet; se steg 3.6.).
    1. Lossa cellerna med Trypsin/EDTA-lösning när de är på 80 – 90% confluence (vanligtvis efter 7 dagar). För detta, skölj varje brunn med 2 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, i två på varandra följande tvätt steg. Använda 800 μL Trypsin/EDTA-lösning per 6-väl och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 i en steril inkubator för 3 – 5 min. stoppa enzymatisk aktivitet med hjälp av 1200 μL DMEM som innehåller minst 10% FCS.
    2. Centrifugera cellsuspensionen i 5 min på 350 x g vid 20 ° C.
    3. Utför andra CD31-MCS steg för att öka renhet (enligt CD31 Mikrokulor tillverkarens anvisningar, se 3.6.).
    4. Iaktta cell sammanflödet via ljusa fält eller standard fas-kontrast mikroskopi med en
      20 x förstoring och 0,35 numeriska bländaröppning. Se figur 1.
      Obs: Celler kan användas för respektive experiment eller förvaras i kulturen av passaging. Använda celler för experiment omgående i lägre passager. Det rekommenderas inte att använda celler efter passage
      8 – 10.

5. kvalitetskontroll

  1. Utföra flödescytometri av primära murina MMEC efter det andra CD31-MCS-steget.
    1. Förbereda en FACS röret genom att tillsätta 1 mL flöde flödescytometri (FC) buffert (se bifogad Tabell för material).
    2. Lossa cellerna med Trypsin/EDTA-lösning när de är på 100% confluence (vanligtvis efter 14 dagar). För detta, skölj varje brunn med 2 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, i två på varandra följande tvätt steg. Använda 800 μL Trypsin/EDTA-lösning per 6-väl och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 i en steril inkubator för 3 – 5 min. stoppa enzymatisk aktivitet med hjälp av 1200 μL DMEM innehållande 10% FCS.
    3. Bestämma antalet celler med hjälp av en Neubauer cell räknar kammare och Lägg till minst 1 x 105 celler till beredda FACS röret.
    4. Cellsuspension Centrifugera i 10 min vid 300 x g vid 4 ° C. Två stegen tvätt genom att avlägsna supernatanten, omblandning celler i 1 mL FC buffert och centrifugering i 10 min vid 300 x g vid 4 ° C.
    5. Förbereda en färgning mix genom att lägga till antimus CD31-FITC-antikropp (1: 100) och antimus CD45-PE (1: 100) med FC buffert.
    6. Att resuspendera cellerna i 100 μL av färgning mix i FACS rören. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C. Tillsätt 1 mL FC buffert. Centrifugera cellsuspension för 5 min vid 300 x g vid 4 ° C. Försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 μL av FC buffert.
    7. Åtgärd celler i en flödescytometer efter usenets strategin visas i figur. 2A.
  2. Alternativt utföra immunofluorescens färgning av primära murina MMEC efter det andra CD31-MCS-steget.
    1. Kappa av coverslips.
      1. Överföra en steril 13 mm diameter runda täckglas i en bra 24 väl platta. Coat täckglas genom att lägga till 300 µL hastighet beläggning lösning per brunn. Inkubera under 3 – 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
      2. Aspirera och kasta beläggning lösning. Skölj varje brunn med 2 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i två på varandra följande tvätt steg. Aspirera och kasta PBS.
      3. Frö 1 x 105 celler i 1 mL ECM på det bestrukna täckglaset och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 i en steril inkubator tills cellerna är 99% konfluenta.
    2. Utför fixering och immunofluorescens färgning.
      1. Ta bort ECM medlet av odlade celler från 5.2.1.3.
      2. Fixa odlade celler genom att lägga till 300 µL 4% paraformaldehyd (PFA) med pH-värde 7,4 per brunn, under 10 minuter vid 4° C.
        Varning: PFA är giftigt och måste hanteras med försiktighet.
      3. Utför 3 tvätt steg genom att tillsätta 1 mL PBS per brunn och ta bort supernatanten efter 5 min på RT.
      4. Förbereda en blockerande lösning som innehåller 5% BSA, 0,2% Triton-X och 1% get serum i PBS.
      5. Tillsätt 300 µL blockerande lösning till varje brunn och inkubera i 1 h på RT.
      6. Avlägsna supernatanten och tillsätt 200 µL per brunn av en anti-PECAM-1 (CD31) antikropp (1: 200) i 5% BSA, 1% get serum i PBS och inkubera vid 4 ° C över natten.
      7. Utför 3 tvätta stegen genom att tillsätta 1 mL PBS per brunn och ta bort supernatanten efter 5 min vid RT i varje steg.
      8. Bered en sekundär antikropp som innehåller Cy3-konjugerad anti råtta IgG antikroppar (1: 500) i 1% BSA och PBS. Tillsätt 300 µL per brunn av sekundär antikropp lösningen och inkubera i 1 h på RT i mörkret.
      9. Utför 3 tvätta stegen genom att tillsätta 1 mL PBS per brunn och ta bort supernatanten efter 5 min vid RT i varje steg.
    3. Ta ut runda glas coverslips försiktigt med pincett och överföra den till en mikroskopi-bilden. Tillsätt en lämplig mängd montering medium innehållande DAPI på det cell-lagret och noggrant sätta en skyddsglaset på det (se bifogad Tabell för material).
    4. Observera celler med ett lämpligt fluorescens Mikroskop utrustat med fluorescens ljuskälla (120 W) och två filtrera uppsättningar: en magnetisering/utsläpp filter set med 550/25 nm och 605/70 nm våglängder att upptäcka Cy3 540/562 nm.
    5. Använda andra filter set med excitation/emissionsvåglängden 365/50 nm och 445/50 nm att upptäcka DAPI 350/440 nm. Använd en förstoring 40 x och 80% intensitet 14,5 mW/cm2 för DAPI med ett förvärv varaktighet 30 ms. för detektion av Cy3 använder 80% 67,5 mW/cm2 med en förvärv längd 60 ms.
  3. Utföra kvantitativa PCR.
    1. Isolering av mRNA.
      1. Följ standard procedurer använder en syra guanidinium kaliumtiocyanat-fenol (AGTP) reagens för att isolera mRNA. Använda minst 0,5 x 106 celler från CD45– CD31– (se steg 3.6.8), CD45– CD31+ (se steg 3.6.9.) bråk och odlade primära murina MMEC (4.1.3)
      2. Cellsuspension Centrifugera i 10 min vid 300 x g vid 20 ° C. Ta bort supernatanten helt. Återsuspendera cellpelleten i 500 µL av AGTP reagens och överföring cellsuspension i en 2 mL reaktionsröret. Inkubera i 5 min på RT.
      3. Tillsätt 100 µL av kloroform och skaka kraftigt för 15 s. Inkubera i 3 min vid RT.
      4. Centrifugera suspension för 15 min vid 12 000 x g vid 4 ° C.
      5. Ta bort övre vattenfasen (som innehåller RNA) omsorgsfullt och överför till en 1,5 mL reaktionsröret. Tillsätt 250 µL av isopropanol och inkubera i 10 min vid RT.
      6. Utföra en centrifugeringssteget vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
      7. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 mL 75% etanol noggrant. Centrifugera vid 7 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
        Obs: Pellets är lätt att förlora.
      8. Ta bort supernatanten helt. Låt pelleten torka på luft för 5 – 10 min.
        Obs: etanol behöver tas bort men inte torkar för mycket.
      9. Lös pelleten i 30 µL diethylpyrocarbonate behandlade vatten innehåller i och värme i 10 minuter vid 55 ° C.
        Obs: RNA-koncentrationen och renheten kan mätas genom en spektral-fotometer.
    2. Utföra cDNA syntes (omvänt transkriptas PCR).
      1. Förbereda en mastermix innehållande: 10 µL av PCR-buffert (5 x), 2,5 µL desoxyribonucleosid-trifosfat (dNTP (10 mM)), 0,5 µL slumpmässig blandning av enkelsträngat primer (0.2 µg / µL), 1 µL RNase inhibitor (40 U / µL, 0,4 omvänd transkriptas (200 U/µL) och 5,6 µL diethylpyrocarbonat behandlat vatten (se bifogat tabell för material).
      2. Späd 500 ng RNA i 30 µL diethylpyrocarbonate behandlat vatten i 0,2 mL PCR-rör och lägga till den hela 20 μl mastermix.
      3. Använda en PCR-apparat utför följande steg: 10 min 25 ° C, 30 min 50 ° C, 5 min 85 ° C och håll vid 4 ° C.
  4. Utföra kvantitativ PCR (qPCR).
    Obs: Utföra qPCR av prover i dubbletter eller exemplar.
  5. Använd primer med två olika fluorescens färgämnen. Primer med en absorption av 495 nm och ett utsläpp av 517 nm för gen av intresse.
  6. För påvisande av genuttrycket satellit cell markör, använda primers för Parade box protein 7 (Pax7) och M-cadherin (Cdh15) (se bifogad Tabell för material).
  7. För påvisande av genuttrycket endotelceller markör, använda primers för claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) och zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO1) (se bifogat tabell för material).
  8. Som referensgenen för 18s rRNA, Använd en primer med absorption av 538 nm och utsläpp av 554 nm våglängd.
  9. Förbereda en qPCR mastermix för varje gen av intresse med respektive primer. Mastermix innehåller: 10 µl qPCR buffert (2 x), 1 µL Primer för gen av intresse (10 µM), 1 µL Primer för 18s rRNA och 4 µL nuclease gratis vatten.
  10. Tillsätt 16 µL av mastermix till en enda brunn 96 brunnar reaktion platta. Tillsätt 4 µL av cDNA (erhålls från steg 5.3.2.) per brunn innehållande mastermix.
  11. Använda en realtids PCR-apparat som utför följande steg: holding scenen med 50 ° C i 2 min och 95 ° C i 10 min. cykling scenen med 40 cykler på 95 ° C 15 s och 60 ° C i 1 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En dag efter isolering, primära murina MMEC och resterande andra celler bildar konglomerat och följa botten av kultur rätter (figur 1A dag 1). Från dag 7, kan platt och långsträckta celler observeras. Kontaminering av andra, mestadels sfäroid celler, är dock fortfarande synliga (figur 1A dag 7). Således, en annan cykel av CD31 positiva urval via MCS krävs. Härefter, primära murina MMEC föröka till en densitet på cirka 80 – 90%. Vid sammanflödet bildar de vanligtvis en icke-överlappande enskiktslager av längdriktningen justerade celler (figur 1A dag 14). Spridning stannar vid sammanflödet på grund av kontakt-hämning. Efter 14 dagar om 5 – 10 x 105 celler kan användas för vidare utredning.

Kvalitetskontroll via flödescytometri med fastställbara livskraft dye FVD780 (att färga för döda celler), PECAM1 (CD31) och PTPRC (CD45, som markör för celler av hematopoetiska ursprung) visade värden för både lönsamhet och renhet som sträcker sig runt 70% vardera för celler omedelbart efter isolering (figur 2A). Celler odlade efter en annan CD31 positiva urval via MCS, visade tillfredsställande värden för renhet samt när det gäller lönsamhet som sträcker sig upp till 95% vardera (figur 2B).

För att utvärdera riktigheten av urvalet undersöktes steg, erhålls celler ytterligare för genuttryck av muskel satellit cell markör gener Parade box protein 7 (Pax7) och M-cadherin (Cdh15) på mRNA-nivå med kvantitativ PCR (qPCR). Primära murina MMEC (pmMMEC) och differentierade primära murina muskelceller (pmMC) användes som negativa och positiva kontroll, respektive. Murina muskelceller köptes kommersiellt. Som förväntat, endast CD45– CD31– delen samt pmMC uttryckt Pax7 och Cdh15, medan CD45– CD31+ det primära murina MMEC var negativa för dessa markörer (figur 2 c).

EG härrör från kapillärer i endomysium av skelettmuskulaturen express åtsittande föreningspunkt proteiner 4,5. Med hjälp av qPCR, uttrycket av claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) och zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO1) av konfluenta primära murina MMEC efter andra CD31 MCS utvärderades steg. PmMC användes som kontroller (figur 2D). Primära murina MMEC uttryckt höga nivåer av Cld5, Ocln och Tjp1, medan pmMC endast visar lågt uttryck av Tjp1. Dessutom bekräftade immunofluorescens färgning som kvalitetskontroll ytan uttryck av endotel-specifika markören PECAM1 i primära murina MMEC (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: morfologi av primära murina MMEC. (A) representativ bild av odlade primära murina MMEC av fas kontrast mikroskopi från dag 1 till 14. D1 = dag 1, d7 = dag 7, d14 = dag 14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontroll av primära murina MMEC. Gating strategi för flöde flödescytometrisk analys av primära murina MMEC omedelbart efter isolering (A) och på dag 15 (B) använda (I) FSC/SSC, (II) FVD780 och (IIIa) CD45, (IIIb) CD31 (streckade linjer = isotypen kontroll). (C) uttrycket Pax7 och M-Cadherin (Cdh15) i CD45– CD31-, CD45– CD31+ fraktioner efter MCS isolering samt för primära murina MMEC (pmMMEC) och primära murina muskelceller (pmMC ). Uttrycksnivåerna visas som ΔCt -värden (prov - 18S rRNA), nd = ej fastställt. (D) uttryck nivå av åtsittande föreningspunkt proteiner claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) eller zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO-1) av pmMMEC och pmMC, som ΔCt -värden. (E) immunofluorescens färgning för PECAM1 (röd) i odlade primära murina MMEC 24 h efter andra CD31 positivt urval. Nukleär färgning med DAPI-innehållande (blå) monteringsmedium; vänster = anti-PECAM1/DAPI, höger: negativ kontroll/DAPI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrovaskulära endotelceller ge barriär funktioner i alla vävnader och deras dysfunktion resultat vid sjukdom av associerade organ 3. Dessutom kunde organ-specifika studier av mikrovaskulära EG bana väg för nya terapeutiska strategier. En djupare förståelse för mikrovaskulära EG funktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden är därför av stort vetenskapligt intresse. Modulering av leukocyter/endotel interaktion används framgångsrikt att behandla multipel skleros patienter med natalizumab, en antikropp som förhindrar lymfocyter vidhäftning och därmed själavandring 6. Olika myopatier inklusive de inflammatoriska undertyperna fortfarande dock bara dåligt behandlingsbara hittills. Därför, klargörande av EG boenden specifikt i skelettmuskulaturen endotelet kan bidra till att expandera tillgängliga behandlingar till myopati eller resultera i nya terapeutiska metoder.

Förevigade endotelceller linjerna (IECL) har upprättats och använts för flera in vitro-modeller. Dessa cellinjer erbjuda vissa fördelar jämfört med primär mikrovaskulära EG på grund av immortalization och snabb spridning. Dessutom kan primära odlade celler genomgå åldras och förlorar eller ändra deras morfologi eller fysiologisk funktion efter lite tid eller passager. Dock IECL endast upprätthålla vissa endotelceller egenskaper och kan inte likna olika i olika organ-burna primära mikrovaskulära EG. Notera härrör de sällan från skelettmuskulaturen. Hittills har beskriver endast en enda publikation ett mänskligt skelett mikrovaskulära endotelceller lina benämn TSM15 5. Däremot har murina mikrovaskulära EG inte beskrivits hittills. Slutligen ger primära celler från transgena djur möjlighet att studera genetiska modifieringar in vitro. Dock hålla primära cellkulturer också vissa fallgropar. Först, kontaminering med celler utan intresse kan påverka giltigheten av experimentella resultat. Därför måste noggrannheten av flera urval steg och en hög renhet av isolerade celler garanteras. Cellsuspension efter dissociation av muskelvävnad innehåller erytrocyter och immunceller, satellit, pericyter, fibroblaster och endotelceller 7typer av olika mononukleära celler. Därför testades cell fraktioner efter CD31 MCS steget för markörer uteslutande uttryckt av satellit muskelceller. Som förväntade CD45– CD31– bråk och primära muskelceller visade Pax-7 och Cdh15 uttryck, medan CD45– CD31+ odlade primära murina MMEC var negativa för dessa markörer efter en andra CD31 MCS steg. Dessutom är en kvalitetskontroll av isolerade eller odlade celler oundvikligen att garantera tillförlitliga och reproducerbara experiment. Det finns flera metoder för kvalitetskontroll av primära murina MMEC: förutom mikroskopi av morfologiska egenskaper, flödescytometri, PCR och immunofluorescens infärgning för karakteristiska EG markörer (t.ex. CD31, Sca-1) kan användas. Renhetsgrad bedömning av nymalen isolerade primära murina MMEC var bara ca 60-70%, medan en bärkraft på ca 70% kunde upptäckas. Mikroskopi av dessa celler visar delvis cellen konglomerat, som kan bestå av kontaminerande celler såsom fibroblaster eller pericyter kopplade till EG. Efter 7 dagar kan främst platt och långsträckt och sfäroid celler observeras. Två CD31 MCS passager resulterade dock i hög lönsamhet och renhet. Alternativa metoder att öka renhet såsom puromycin-innehållande media misslyckades i primära murina MMEC samtidigt som den är effektiv i murin hjärnan mikrovaskulära EG 8.

Eftersom mikrovaskulära EG härrör från kapillärer express åtsittande föreningspunkt proteiner, genuttryck av Cld5, Ocln och Tjp1 i primära murina MMEC jämfört med differentierade muskelceller undersöktes. Som förväntat upptäcktes alla åtsittande föreningspunkt molekyler i primära murina MMEC. I jämförelse visade muskelceller bara lågt uttryck av Tjp1, inga uttryck för Cld5 och Ocln kunde fastställas. Liknande uttrycksmönster visades tidigare i hela murina skelettmuskulaturen. Här, kunde ett uttryck på gen- och protein-nivå upptäckas för Tjp1 men inte för occludin 9. Ytterligare kunde funktioner såsom transendothelial motstånd mätas.

Häri beskrivna protokollet har bara isoleringen av mikrovaskulära EG från murina muskelvävnad. Det kan dock överföras till olika andra arter som till exempel en liknande protokoll publicerades för råtta mikrovaskulära EG härrör från epididymal fett kuddar. Här, föregicks CD31 positiva urval via MCS av täthet lutning centrifugering 10. Liknande metoder lyckades makrovaskulära EG isolering från råtta femoral artärer 11. En nyligen publicerad metod att isolera mikrovaskulära EG hjärta och lunga vävnad använder CD31 och endoglin (CD105) som antigener för magnetiska cell sortering 12. Dock kunde renheten av EG vidare inte höjas med ytterligare CD105 magnetiska pärla separation. En annan möjlighet att isolera och rena primära murina MMEC är multicolor fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). En distinkt befolkning på Sca-1+, CD31+, CD34dim och CD45– celler från murina muskler kan isoleras och karakteriserades som primära murina MMEC 13. En fördel med denna metod är en ren EG befolkningen som direkt kan användas eller odlade för ytterligare experiment (notera att i vår erfarenhet FACS leder till ökad celldöd på grund av högre cell stress). Ytterligare, döda celler eller konglomerat av olika celltyper kan avsevärt minska den isolerad cell nummer av FACS. Dessutom rapporteras det att primära murina MMEC isolerats av FACS odlades utan framgång vid vanliga kultur 21% O2 och 5% CO2. Här hade syrenivån anpassas till 5% för en tillräcklig odling 13. Dessutom FACS tekniken är mer komplexa, tidskrävande och infrastrukturella förutsättningarna är dyra.

Den musculus quadriceps femoris och den musculus triceps surae hos hanmöss i 4-12 veckors ålder är mest lämplig för isolering av primära murina MEC som de är lättillgänglig och tillräckligt stor för isolering av tillräcklig cell nummer (5-10 x 105 per gram muskel). Därför måste det säkerställas att förhållandena är jämförbara i oberoende experiment. Som beskrivits ovan, kan primära celler genomgå åldras. Därför Använd celler för respektive experiment omgående i lägre passager. Efter passage 8 – 10 primär murina MMEC ändra deras morfologi, demonstrera långsam spridning priser och förlora sin kontakt hämning som tecken för dedifferentiering och åldras på hösten.

Det finns ytterligare några anteckningar för felsökning för detta protokoll. Sterila arbeta är viktig för att undvika föroreningar. Kvalitetskontroller är nödvändiga för att övervaka renhet och lönsamhet av isolerade celler. Material som används i detta protokoll skall förvaras och användas enligt tillverkarens anvisningar. Ytterligare, ålder och kön används djur, liksom olika muskelgrupper kan påverka kvalitet och jämförbarhet av isolerade celler i experiment.

Protokollet beskrivs bör betraktas som plattform metod att isolera primära mikrovaskulära EG av skelettmuskulaturen. Isolerade celler kan användas för flera program för att få ytterligare insikter i blod-muskel-barriärfunktion. Celler är lämpliga för både proteiner och RNA uttryck studier samt funktionella analyser (inklusive själavandring och vidhäftning studier). Emellertid detta protokoll var optimerad för studier med fokus på inflammatoriska processer och därmed smärre ändringar kan vara nödvändiga med avseende på olika forskningsområden.

För att modellera komplexa rumsliga och funktionella cellulära interaktioner inom MVU, kan primära murina MMEC odlas i mer komplexa 3D cell kultur system tillsammans med andra celltyper. Prospektivt, bör det också vara möjligt att generera MVU organoids som det har beskrivits för andra vävnader före 14. Framgångsrika isolering av primära murina MMEC är dock oundvikligt för syftar detta nästa steg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete fick stöd av den ”annat Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 i TR), ”innovativa Medizinische Forschung (IMF) Münster” (I-RU211811 till TR) och tyska Research Foundation (DFG, INST 2105/27-1, mig 3283/5-1, och mig 3283/6-1 till SGM). Illustrerade bilder som tillhandahålls av Heike Blum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Tags

Neurovetenskap fråga 145 Cell isolering murina mikrovaskulära endotelceller skelettmuskel celler blod muskel barriären myovascular enheten myopati
Isolering av primära murina skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müntefering, T., Michels, A. P. … More

Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter