Summary
本文介绍了一种利用三维扫描技术将两个空间尺度连接起来的实验方案:由MRI在>100 μm处成像的全脑解剖结构的宏观空间尺度,以及使用神经元分布的微观空间尺度免疫组织化学染色和多电极阵列系统等方法(±10μm)。
Abstract
人脑是一个多尺度系统,它同时具有宏观电信号,沿着厚厚的白质纤维束在全球流动,以及微小的神经元尖峰,沿着斧头和树突传播。两种尺度都补充了人类认知和行为功能的不同方面。在宏观层面,MRI是目前的标准成像技术,其中最小的空间分辨率,体素大小,是0.1×1毫米3。此外,在微观层面上,以前的生理学研究知道这种体素内的神经元结构不均匀。本研究通过将生物科学研究与3D扫描技术的进步相连接,为将微观数据准确嵌入宏观图谱而开发一种强有力的方法。由于3D扫描技术一直主要用于工程和工业设计,它第一次被重新用于将微连接体嵌入整个大脑,同时保留活脑细胞中的天然尖峰。为了实现这一目标,首先,我们构建了一个扫描协议,从生物生物中获取准确的3D图像,由于潮湿和反射表面,对图像本身具有挑战性。其次,我们训练保持速度,以防止活脑组织的退化,这是保持更好的条件和记录更多的自然神经元尖峰从脑组织的活动神经元的关键因素。两个皮质表面图像,从两个不同的成像模块(即 MRI 和 3D 扫描仪表面图像)独立提取,令人惊讶的是,作为直方图的模值,其距离误差仅为 50 μm。这种精度在尺度上可与细胞间距离的微观分辨率相媲美;此外,它是稳定的不同单独的小鼠。这种新协议,3D新嵌入重叠(3D-NEO)协议,桥接由该集成协议派生的宏观和微观水平,并加速新的科学发现,以研究综合连接架构(即,微连接)。
Introduction
不同物理和生物组织的非均匀多尺度架构通常见1,2。大脑也是一个非常不统一和多尺度的网络组织3,4。各种认知功能被编码在这样的网络组织中,在亚毫秒时间分辨率中保存神经元群的电尖模式的时间变化。从历史上看,神经元之间的复杂网络被结构上详细观察使用染色技术由圣地亚哥拉蒙和卡哈尔从150多年前5。为了观察活动神经元的群体行为,研究人员开发了各种记录技术6,7,8,而最近这些技术的重大发展使我们能够记录同时来自大量神经元的电活动。此外,通过这些功能活动,科学家已经成功地重建了大量神经元之间的因果相互作用网络,并宣告了其复杂相互作用的拓扑结构"微连接体"9.对大脑的宏观观察也允许将整个大脑视为一个网络组织,因为许多大脑区域都通过多个纤维束连接。将微连接体嵌入到全球大脑图谱中,在目前的技术进步中仍有明显的局限性,这就是为什么这种嵌入协议如此重要的原因。但是,嵌入协议的开发面临着许多挑战。例如,为了观察纯隔离的大脑区域中活的局部神经元回路的活动,需要为体外记录制作脑切片。此外,从脑切片进行体外录音仍然是一个重要的选择,至少有两个原因。首先,从比±1.5毫米深的大脑区域和高时间分辨率(<1 ms)同时观察许多活个体神经元的活动仍然不容易。其次,当我们希望了解局部神经元回路的内部结构时,我们需要停止来自外部大脑区域的所有输入,以消除混淆因素。为了确定所生成脑切片的方向和位置,还需要使用坐标集成这些生成的脑切片的空间位置。然而,有一些系统可靠的方法,使大脑切片有组织的方式10,11。这里引入了一种新的共注册协议,使用3D扫描技术进行神经科学研究,以提供一体化协议。该协议用于协调微尺度和宏尺度,并通过提取的大脑的 3D 扫描表面,将数据嵌入到宏观 MRI 空间上,并将多电极阵列 (MEA) 微数据12、13和染色数据嵌入到宏观 MRI 空间上,非侵入性记录的大脑。令人惊讶的是,这显示距离误差仅为 ±50 μm,作为直方图的模式值。因此,所有六个小鼠的 MRI 表面与扫描的 3D 表面之间最小距离的模值接近 50 μm,这是检查个体之间的共性时的适当数字。典型的切片宽度记录的峰值活动约为 300 μm。
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Protocol
这里描述的所有实验程序都已获得京都大学动物护理委员会的批准。
1. 动物(第1天)
- 准备雌性C57BL/6J小鼠(n = 6,3~5周)。
注:该协议适用于所有啮齿动物物种。
2. MRI 设置(第 1 天)
- 使用加热器垫控制器将鼠标放入放在加热垫上调节至 37°C 的丙烯酸麻醉盒中。
- 使用由非脱脂蒸发器、气流计和空气压缩机组成的麻醉系统,以 1.4 L/min 的流量在流入箱内的空气中用 2% 的异常鲁兰对小鼠进行麻醉。
- 麻醉后,将鼠标放在与 MRI 兼容的摇篮中,放在易感位置。检查麻醉是否足够,用钳子剪下老鼠脚趾,看看是否感到疼痛。
- 用带底座的牙条和面罩固定鼠标头。然后,通过面罩将空气中的1%-1.5%的异常胶保持麻醉,在1.4 L/min。
- 将热敏电阻温度探头插入鼠标的直肠,并在鼠标背面放置压力感应呼吸传感器。
- 将底座转移到 MRI 磁铁的孔上。将胶原体浓度调整到1%~1.5%左右,以确保麻醉深度稳定且可重复。在整个 MRI 实验期间,使用监测系统(材料表)监测整个 MRI 实验期间是否将体温控制在 33~35 °C 之间,呼吸速率在 0.5~1.3 Hz 之间,用于监测小型动物的生理参数。专用软件 (材料表).
- 使用直肠温度的测量值,通过控制从监控系统中配备的加热器系统提供的磁孔中的热空气温度来调节体温。
3. MRI 采集(第 1 天)
-
高分辨率 3D T2 加权 MRI 扫描的准备工作
- 在三个正交(轴向、日冕和下垂)平面上获取三个磁共振 (MR) 图像,以检查鼠标的位置。
- 参考这些图像,通过移动底座来调整鼠标位置,使鼠标大脑的中心位于共音器的中心以及轴向的梯度线圈的中心。
- 通过调谐谐振器、调整静态磁场均质性(成像)和基本频率以及校准射频 (RF) 功率来调整 MRI 系统。
- 获取具有日冕和下垂方向的低分辨率 2D 多片 T2 加权 (T2W) 图像。基于这些图像,确定高分辨率 3D T2W MRI 扫描的视场 (FOV)。
- 使用 FASTMAP 自动浏览算法执行本地化的创建。对于 FASTMAP 协议,选择覆盖整个大脑的矩形区域。完成局部浏览后,使用点解光谱 (PRESS) 通过局部1H 光谱确认大脑区域内的 B0场不均匀性。
- 通过检查 FOV 的适当位置、无环绕(锯齿)伪像以及有效抑制胖信号,获取低分辨率 3D T2W 图像,以确保高分辨率 3D T2W MRI 的扫描设置合适。
-
成像脉冲序列
- 经过上述准备后,使用快速采集和放松增强(RARE)序列,获取小鼠整个大脑的高分辨率3D T2W图像。
注:在本文中,MRI实验是在7T,210毫米水平孔,临床前扫描仪,配备了440mT/m的梯度系统在斜坡时间100μs。内径为35 mm的正交体积复调器用于射频激发和信号接收。MRI数据是使用专用操作软件采集的。本研究中使用的3D RARE脉冲序列的采集参数在表1中进行了总结。
- 经过上述准备后,使用快速采集和放松增强(RARE)序列,获取小鼠整个大脑的高分辨率3D T2W图像。
4. 实验解决方案的准备(第2天)
- 制备 500 mL 的冷切溶液(2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 7 mM MgCl2, 15 mM M GCl 2, 25 mM NaHCO3, 0.5 mM CaCl2,11.6 mM 抗坏血酸钠, 3.1m M 丙酸钠, 和 100 m M 胆碱氯化物, 气泡95% O2和 5% CO2)。将 pH 调整为 7.3×7.4。
- 制备1 L的人工脑脊液(ACSF;127 mM NaCl,2.5 mM KCl,1.25 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2,15 mM NHCO3,和 2 mM CaCl2, 95% O2和 5% CO2) 。将 pH 调整到 7.3~7.4。
5. 设备准备(第2天)
- 准备一个6.6厘米2方形,0.5厘米厚的磁铁"环",第一,放置黑色胶带,第二,手术胶带在环上(图1c-2)。请注意,这种材料被命名为大脑块基(BBB),并在冰块上保持低温。
注:稍后,磁带将连接到带有振动器脑块的切片站。方形环用作 BBB 的底部基础,以满足两个目的,即将脑块从 3D 扫描站平滑地迁移到振动体,并在扫描步骤中精确测量脑块的高度。 - 使用自动转盘设置 BBB。打开扫描仪和转盘。启动图像处理软件。
-
在所有实验之前,对摄像机和结构化灯光投影和桌面式 3D 扫描仪的连接转盘进行校准。
- 打开中央投影仪、两个摄像头和转盘。然后,打开软件。在软件中,单击"光学设置"并选择图像区域为 100 x 80,将网格编号选择为 100 x 100。然后,摄像机校准根据以下四个步骤开始。
- 对于投影机设置,将校准表放在桌面上,并将校准板放在校准纸上,以将测量区域的固定点调整到纸张的中心和正面的方向。将投影机和电路板之间的距离调整到200毫米左右。松开固定两个旋钮的螺钉,旋转旋钮以调整两个摄像机的光灵敏度和对焦。然后,单击"箭头"转到下一步。
- 要定位摄像机,松开固定两个摄像机本身的螺钉,并移动位置和旋转,使其与校准板上的中心线、垂直线和从投影仪投影的黄色十字线重叠。修复摄像机,然后再次单击"箭头"。然后,屏幕将变暗。
- 要对焦摄像机,松开旋钮的固定螺钉后,增加光灵敏度并再次调整对焦。然后,单击"箭头"转到下一步。
- 对于 F 值和曝光程度(相机),再次将光灵敏度调整到红色区域消失的正下方。然后,再次单击"箭头",然后单击"校准开始",如果询问是否完成光学设置,请选择"是"？
- 单击初始化校准,并检查像素值是否在 0~255 之间规范化。然后,单击"继续"。
- 通过跟踪建议的位置,记录扫描仪和校准板的九个不同相对角度的图像,并在确认校准过程后完成,最后单击校准的更新。
- 更换转盘的校准板,然后单击转盘校准。
注:现在,所有校准都已完成。
- 打开中央投影仪、两个摄像头和转盘。然后,打开软件。在软件中,单击"光学设置"并选择图像区域为 100 x 80,将网格编号选择为 100 x 100。然后,摄像机校准根据以下四个步骤开始。
6. 脑表面扫描、切片和 MEA 记录(第 2 天)
- 用1%-1.5%的除胶麻醉鼠标,并斩首鼠标。使用手术刀打开皮肤并露出头骨。
- 用手术刀沿着下垂缝合线切割麻醉小鼠的头皮,并用手术剪刀将头骨从 lambda 点对角线切割到小点前的一点。然后,用弯曲的钳子轻轻地从大脑中剥下头骨。
- 使用铲子抬起大脑,并将其转移到培养皿(100 毫米 x 20 毫米)与冷切溶液(在步骤 4.1 中准备)。泵的旋转速度(±4.0 rpm)从外部气体炸弹中排出含有95%O2和5%CO2的空气,在冰冷的切割溶液中产生小气泡(图1a)。
- 1⁄2分钟后,将大脑放在一块微纤维布上,其表面被面粉筛稍微覆盖,并用超细纤维布轻轻擦拭大脑表面的液体(图1b)。
- 将大脑背向放在 BBB 上的样品支架上,并将 BBB 放在自动转盘的中心。
- 在 3D 扫描期间使房间变暗,并在转盘上执行 3D 扫描。要测试 3D 扫描是否正常工作,请单击3D扫描,将两个镜头之间的角度选择为 22.5,起始角度为 0,最终角度为 360(图 1c-1)。
- 将大脑移动到培养皿中,在切割溶液中将大脑泡入约 10 s。
- 用手术刀将大脑切成两块,用手术刀将两个脑块轻轻移动到平坦的表面。
- 使用即时胶水连接 BBB 的脑块,并在 1⁄2 分钟内再次使用超细纤维布轻柔地擦拭大脑表面的液体。然后,再次执行 3D 扫描 (图 1c-2)。
- 将覆盖 BBB 中心的黑色胶带连接到振动器切割阶段的中心(图 1d)。
- 将切削溶液倒入切割阶段,并在振动器上设置切割阶段。调整切削速度和振幅。从两个脑块制作2~5个日冕切片(300μm厚)。如果可能,将溶液保持在切割阶段冒泡(图1e)。
- 将刀片连接到振动器的刀片支架,通过将系统设置为 12.7 mm/min(频率为 87±88 Hz)和回转宽度为 0.8±1.0 mm 来优化系统的切割速度、频率和振动幅度。当需要小心切割时,将速度降低到 2⁄3 级。
- 在切割脑切片时,以格式记录切片坐标,包括前后坐标、半球和其他条件(图2c)。
- 使用厚塑料移液器将脑切片轻轻转移到装有预热 (+34 °C) ACSF 的烧杯中,并在 +34 °C 的烧杯中孵育,以 ±1 小时。在此期间,对切割阶段的剩余脑块进行 3D 扫描(图 1c-2)。
- 在录音装置上设置 MEA 芯片。使用两根管将芯片连接到蠕动泵。使用一根管将相同的 ACSF 引导到 MEA 芯片中,另一个管引导 ACSF 从 MEA 芯片中退出。
- 将两根针(0.60 mm x 19 mm)连接到两个管的尖端,连接到 MEA 芯片壁的顶部,并在 MEA 芯片的内壁下用尖端固定其位置。将 ACSF 的流量设置为 4.1 rpm。
- 1 小时后,使用厚塑料移液器在芯片上移动切片,并使用软刷设置位置。然后,开始神经元活动的记录过程 (图2-d)。
7. 免疫组织化学染色(第3天和第4天)
- MEA 记录完成后,将切片转移到 1.5 mL 管中,在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中填充 4% 的甲醛 (PFA)。在4°C下孵育它们过夜。然后,取出4%的PFA溶液,用PBS清洗切片3次,共5分钟。
注:如有必要,将切片嵌入 20% 明胶/PBS 中,并使用振动组切除切片,使其薄于 50 μm。 - 制备抗原检索溶液(10mM柠酸钠,pH6.0)。从上次洗涤中取出PBS,并添加抗原检索溶液。
- 将水煮在电热水瓶中,在锅中+95~98°C下用切片孵育管子20分钟,然后自然冷却。
- 准备50 mM三分缓冲盐水,加入1%的纳硫酸盐(1%纳双硫酸盐-Tris溶液)。将 pH 调整到 7.5。然后,在室温(+20~25°C)下,用1%的纳双硫酸盐-Tris溶液清洗切片5分钟。
- 在1%的Na双硫酸盐-Tris溶液中加入4%正常山羊血清和0.5%的八氯苯乙氧基酸酯,制备阻断溶液。
- 用切片从管中取出1%的Na双硫酸盐-Tris溶液,并添加阻滞溶液。在室温下孵育2小时。
- 通过在1%Na双硫酸盐-Tris溶液中加入1%正常山羊血清和0.5%Triton X-100溶液并稀释原抗体,制备原抗体溶液。使用以下浓度的初级抗体:1:800小鼠抗GAD67和1:500兔抗NeuN。
- 从切片管中取出1%的Na双硫酸盐-Tris溶液,并加入原抗体溶液。在4°C下孵育过夜。
- 准备 50 mM 三层缓冲盐水,并添加 8.5 g/L NaCl(Tris-NaCl 溶液)。将pH1tttto1到7.5。然后,用Tris-NaCl溶液(+20~25°C)清洗切片3倍,共5分钟。
- 通过在Tris-NaCl溶液中加入3%正常山羊血清和0.3%Triton X-100并稀释二级抗体,制备第二种抗体溶液。使用以下浓度的二次抗体:1:500山羊抗鼠和1:500山羊抗兔。
- 从带切片的管中取出Tris-NaCl溶液,并加入二级抗体溶液。在室温下孵育2小时。然后,用Tris-NaCl溶液清洗切片3次,共5分钟。
- 使用小刷子将切片放在幻灯片上,然后应用安装介质和盖玻片。使用共聚焦显微镜检查幻灯片。拍摄切片表面的图像(图2e)。
8. MRI 数据处理以提取皮质卷
- 安装免费软件 FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation)。准备第 3 节中获取的 MRI 图像。
- 使用fslchfile 类型 NIFTI_PAIR_GZ命令更改图像格式。使用fslcreatehd命令扩展大脑图像,使其与人脑一样大,如有必要,使用fslorient使用选项-setqformcode 1更改方向。在此之后,使用fslchfile 类型 NIFTI_GZ恢复原始文件格式。确切的命令如下所示。
fslchfile 类型 NFTI_PAIR [输入图像].nii.gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [输入图像]hdr.gz
fslorient =setqformm码 1 [输入图像]hdr.gz
fslchfile 类型 NIFTI_GZ [输入图像] - 键入fsl以打开 FSL 软件。使用图形用户界面 (GUI) 中的下注命令提取大脑,但不要剥离太多。然后,仔细控制初始脑表面球体的分数强度阈值和坐标。对于单个数据,最佳值是不同的。
- 使用与步骤 8.2 相同的过程,将大脑图像调整为原始鼠标大脑大小。确切的命令如下:
fslchfile 类型 NFTI_PAIR [输入图像].nii.gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.08 0 0 0 0 4 [输入图像]hdr.gz
fslorient =setqformm码 1 [输入图像]hdr.gz
fslchfile 类型 NIFTI_GZ [输入图像] - 使用调情命令对所有大脑图像进行注册,并使用-add选项和fslmaths命令的-div选项生成平均大脑图像。
fslmaths [大脑图像 1] [添加 [添加 [大脑图像 N] [div N ]平均图像名称] [odt 浮动 - 使用fslmaths命令的-thr选项使平均大脑更清洁。然后,选择适合个别情况的最佳阈值。
fslmaths [平均图像名称] [例如,5000 的 [阈值平均图像] - 最后,再次使用调情命令将平均大脑图像重塑为个人坐标。然后,准备相当干净的提取皮层 (图 2a).
注:不幸的是,嗅球和小脑在重建的大脑表面将不完美从MRI体积,因为FSL软件的基本限制,尿道的所有大脑部分,包括嗅球和小脑。
9. MRI 图像处理到条纹皮质表面
- 下载另一个免费软件,3D切片机 (https://download.slicer.org/.
- 打开提取的大脑的 MR 图像(单击"文件并选择添加数据"),使用 3D 切片器中的卷渲染和编辑器模块,根据第 8 节生成。
- 将模式从编辑器更改为"音量"渲染,然后单击目标按钮,使大脑的图像进入屏幕中心。
- 选择MR-T2 大脑模式,并通过移动Shift栏来调整阈值。然后,从"音量渲染"移回编辑器,然后单击"阈值效果"按钮。
- 应用标签41。大脑皮层,并将大脑表面数据保存为.stl文件。然后,将文件格式从.vtk更改为.stl,并通过检查窗体保存文件。
10. 3D 扫描数据的预处理
-
在扫描序列中从 8 或 16 个不同角度拍摄的 8 或 16 个图像之间执行自动共注册,通过单击"对齐"选项中包含的全局注册来更正它们之间的小不匹配,并集成它们。从不同角度重复扫描以获得整个大脑表面 (图2b)。
- 如果从不同角度扫描的图像之间的集成未成功,请单击"手动对齐"并选择一对固定图像和移动图像。
- 单击"开始",通过选择不同图像中的三个或四个公共点来开始手动对齐图像。然后,单击"确定"。优化算法是迭代最近点(ICP)算法10。它不包括非线性变形。
- 通过选择所有图像并单击"网格生成"按钮,创建所有对齐图像(即点数据集)的网格。然后,选择"小艺术对象"选项,将网格作为最高分辨率。然后,将图像保存为 .stl 二进制文件或 ASCII 格式。
11. MRI 表面和 3D 扫描表面的共配
-
打开 MRI 表面,并使用表面处理软件将其与 3D 扫描表面合并。然后,使用步骤 10.1.1 和 10.1.2 中所述的相同步骤执行手动校准过程。然后,再次保存这些共注册的表面图像(图2a,b)。
- 如有必要,请清洁单个表面数据,例如,通过清除大脑区域周围的小噪音,特别是 MRI 数据,以及填充孔(如果存在任何孔),尤其是在 3D 扫描数据的情况下。
- 最后,使用数据分析软件(例如 MATLAB)打开曲面数据,并执行和评估两个曲面之间最小距离的直方图。
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Representative Results
我们评估了通过剥离 MRI 体积产生的皮质表面与从提取的大脑的 3D 扫描中获得的表面之间的距离。距离直方图的模值仅为 55 μm (图3a)。此外,当从距离等于零的点累积直方图时,累积值在 ±300 μm 时达到总样本数的 90%(图 3b)。两个表面之间的距离的最终直方图显示了一个典型峰值约50μm。如果我们从宏观的角度来解释这个值,有趣的是,精度,模式值+50μm,对应于几何限制,这是从MRIs的体素大小(图3a)预期,即10μm。这一点间接地表明,MRI和3D扫描之间的重叠算法ICP工作得非常好,MRI和3D扫描的噪声水平被抑制为低值(图2a,b)14。
图1:实验流程。(a) 首先,从老鼠身上提取大脑后,大脑被放入气泡切割溶液中。(b) 用柔软且高度吸水性毛巾擦拭切割溶液后, (c) 在转盘上扫描大脑.(d) 在制作切片(过程的第 8 步)时,在 BBB 上扫描大脑块,因为很容易将脑块移动到振动体的基础(过程的步骤 7 和 8)。(e) 获得足够的切片以记录电活动或染色细胞分布和其他方法后,再次扫描剩余的脑块(该过程的第10步)。剩余脑块的厚度提供了关于切片从何处取出的其他重要支持信息。(f) 最后,我们使用 MEA 或染色方法和其他方法记录了功能活动或结构架构。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:数据处理管道。(a) 从MRI体积剥离皮层所产生的皮质表面的例子,如协议第8及第9节所述。(b) 由3D扫描仪系统直接扫描的皮质表面的例子。(c) 一份备忘录的例子,用来总结从中提取单个脑切片的大脑区域。(d) 皮质切片在电极盘上时的示例。(e) NeuN(红色)和GAD67(绿色)染色脑皮质切片的例子。所有信息现在都将在一个统一的数据库中收集。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:MRI 和 3D 扫描之间的重叠精度。(a) 从MRI体积剥离提取的表面之间的距离的直方图.表面来自 3D 扫描记录。主条形图是所有个体的平均直方图,其他彩色线是单个小鼠的结果(N = 6,年龄为 21-40 天,全部为雌性小鼠)。可以发现一个总的趋势,对所有个人都稳定。(b) 直方图的累积值显示为条形图。累积百分比达到 90%,在 +300 μm(虚线)时。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:概念化图像将两个信息尺度集成到一个图形用户界面 (GUI) 中。宏观大脑解剖学和微观神经元回路信息都集成到一个以网络为代表的系统中。如图3所示的高精度,使我们能够现实地集成这两个尺度。这里呈现的宏观图像来自可扩展的大脑图集15。请点击此处查看此图的较大版本。
| 参数 | 值 |
| 重复时间 (TR) | 2,000 毫秒 |
| 回声时间 (TE) | 9 毫秒 |
| 有效 TE: | 45 毫秒 |
| RARE 因子 | 16 |
| 采集矩阵大小 | 196 x 144 x 144 |
| 视场 (FOV) | 19.6 x 14.4 x 14.4 毫米3 |
| 采集带宽 | 75 千赫 |
| 取向 | 轴向(扫描仪设置中的日冕方向) |
| 脂肪抑制参数 | |
| 脂肪频率 | 2.6 ms-高斯形 +/2 脉冲,带宽为 1051 Hz |
| 扰流板梯度 | |
| 虚拟扫描 | 2 次 |
| 平均数 | 3 |
| 采集时间 | 2 小时 42 分钟 |
表1:本研究中使用的3D RARE脉冲序列的采集参数。
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Discussion
我们开发了一种称为3D-NEO协议的新协议,通过比以前更精确地重叠两个大脑表面来桥接宏观和微观空间尺度。最初,在创建该协议时有两个挑战,这使得两个大脑表面图像的准确重叠和记录来自生物体的健康神经元活动成为可能。首先,有必要在从头骨中提取切出切出后,在不伤害大脑有机体的情况下,有效地擦拭被提取的大脑周围的切割溶液(协议步骤6.2)。其次,由于干燥和时间延迟的第一和第三个条件对生物体来说是潜在的负面因素,因此在10-15分钟内完成从脑提取到切片准备的所有扫描过程也是必要的。神经元活跃。
使用该协议成功记录大脑活动的能力,现在不仅能够协调结构组织,而且能够协调整个大脑地图上的功能活动。该协议的另一个积极方面是,自BBB制备以来,从扫描仪到振动波姆底部的校准变得更加平滑。
如代表性结果中所述,两个表面之间的距离直方图显示峰值在50μm左右。虽然我们执行了重叠的过程,仿佛通过从宏观的角度来看。如果我们从微观角度解释结果,50 μm 是神经元分布中的可比空间尺度,因为皮质神经元对之间的连接概率在 ±100 μm16、17之间衰减,偶数在几毫米18内。实际上,MEA 或钙成像研究通常使用 300-400 μm 厚的切片。因此,如果切片正确嵌入到原始的全脑图中,这里介绍的技术将提供强有力的客观证据。精确实现重叠后,将纯粹从显微镜下观察到的本地信息获得额外的精度。因此,通过执行由全局和局部优化步骤组成的两步优化过程,将来可以达到半自动与神经元典型大小等同的空间分辨率。
这种精确的集成协议提供了基本技术,可以生成各种大脑图集18、20、21,甚至更深入地研究其他灵长类动物的MRI22、23和人类死后的大脑(虽然人脑有硫磺,但有可能从陀螺仪获得足够数量的记录点)。现在,我们还正在开发一个可视化界面,将许多记录的数据样本集成到一个通用的空间坐标中。图4显示了一个这样的图像图。在哺乳动物大脑中,定量不同尺度的整合在了解疾病状态和评估药物效果方面也将取得新的进展。一般来说,这很难适用于鱼类、爬行动物和两栖动物,因为研究人员将发现很难保持提取的瘦脑的形式稳定到预提取的形式,而他们较小大脑的MRI图像也会相对嘈杂。
3D-NEO协议已被引入神经科学或细胞生物学研究领域,成功地证明了宏观解剖学和微观神经元分布之间的高精度,包括宏观和微连接体拓扑结构。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
M.S.感谢医学院医学院医学信息工程课程全体教职员工的支持,并感谢高村正彦教授、野本教授和多里斯·扎基安教授的帮助。评论。这项研究得到了挑战性探索研究援助资助和教育部(教育、文化、体育、科学和技术部)对M.S.的优秀青年研究人员领导计划的支持。这项工作的MRI实验在日本京都大学医学院小动物MRI系医学研究支持中心进行。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
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