Summary
本稿では、MRIによってイメージされた全脳解剖学のマクロ的な空間スケールと、ニューロン分布の顕微鏡空間スケールの2つの空間スケールを橋渡しする3Dスキャン技術を用いて実験的なプロトコルを紹介する。免疫組織化学染色および多電極アレイシステムおよび他の方法(〜10 μm)。
Abstract
人間の脳は、マルチスケールシステムであり、厚い白色物質繊維束に沿って世界的に流れるマクロ的な電気信号と、軸線とデンドライトに沿って伝播する顕微鏡的な神経スパイクの両方を持っています。両方のスケールは、人間の認知機能と行動機能の異なる側面を補完します。マクロスコピックレベルでは、MRIは現在の標準的なイメージング技術であり、最小の空間分解能ボクセルサイズは0.1~1 mm3です。また、顕微鏡レベルでは、以前の生理学的研究は、このようなボクセル内の不均一なニューロンアーキテクチャを認識していました。本研究は、3Dスキャン技術の技術進歩と生物科学研究をインターフェースすることにより、顕微鏡データをマクロスコピックマップに正確に埋め込む強力な方法を開発する。これまで3Dスキャン技術は、これまで工学や工業デザインに用いられてきたため、生きた脳細胞の自然なスパイクを維持しながら、マイクロコネトームを脳全体に埋め込むことが初めて目的としています。この目的を達成するために、まず、湿った反射面による画像に本質的に挑戦する生体生物から正確な3D画像を得るためのスキャンプロトコルを構築しました。第二に、我々は、より良い状態を維持し、脳組織内の活性ニューロンからより自然なニューロンスパイクを記録する重要な要因である生きている脳組織の劣化を防ぐために速度を維持するために訓練しました。2つの皮質表面画像は、2つの異なるイメージングモジュール、すなわちMRIおよび3Dスキャナ表面画像から独立して抽出され、驚くべきことに、ヒストグラムのモード値としてわずか50μmの距離誤差を示す。この精度は、細胞間距離の顕微鏡分解能に匹敵するスケールです。また、異なる個々のマウス間で安定である。この新しいプロトコル、3D新しい埋め込みオーバーラップ(3D-NEO)プロトコルは、この統合プロトコルによって導き出されたマクロスコピックと顕微鏡レベルを橋渡しし、包括的な接続アーキテクチャを研究するための新しい科学的知見を加速します(すなわち、マイクロコネクチョム)。
Introduction
様々な物理および生物学的組織における不均一なマルチスケールアーキテクチャは、一般的に1、2を見つけることができます。脳はまた、非常に不均一でマルチスケールのネットワーク組織3、4です。このようなネットワーク組織では、様々な認知機能がコード化され、サブミリ秒の時間分解能における神経集団の電気スパイクパターンの時間的変化を保持する。歴史的に、ニューロン間の複雑なネットワークは、150年以上前の5年前のサンティアゴ・ラモン・イ・カハルの染色技術を用いて詳細に観察された。活性ニューロンの集団挙動を観察するために、研究者は様々な記録技術6、7、8を開発し、最近の重要な技術の発展は、私たちが記録することを可能にしました同時にニューロンの膨大な数からの電気活動。さらに、このような機能的活動から、科学者は膨大な数のニューロン間の因果相互作用のネットワークを再構築することに成功し、複雑な相互作用のトポロジアーキテクチャを宣言しました 9.脳のマクロ的な観察はまた、多くの脳領域が複数のファイバーバンドルによって接続されているので、ネットワーク組織として脳全体を関連することを可能にします。マイクロコネクテムをグローバルな脳マップに埋め込むには、現在の技術の進歩の中で明らかな制限があり、この埋め込みプロトコルが非常に重要である理由です。ただし、埋め込みプロトコルの開発には多くの課題があります。例えば、純粋に孤立した脳領域における生きている局所神経回路の活動を観察するためには、インビトロ録音のために脳スライスを生成する必要があります。さらに、インビトロ録音のための脳スライスからの録音は、少なくとも2つの理由で重要な選択です。第一に、脳領域から1.5mm深く、高時間分解能(<1ミリ秒)で同時に多くの生きている個々のニューロンの活動を観察することは容易ではありません。第二に、局所神経回路の内部アーキテクチャを知りたいとき、交絡因子を排除するために、外部脳領域からのすべての入力を停止する必要があります。生成された脳スライスの方向と位置を特定するためには、これらの生成された脳スライスの空間位置を座標を使用して統合する必要があります。しかし、組織的な方法で脳のスライスを作るためにいくつかの体系的で信頼性の高い方法があります10,11.ここでは、統合プロトコルを提供するために、神経科学研究のための3Dスキャン技術を使用して、新しい共登録プロトコルが導入されています。このプロトコルは、マイクロスケールとマクロスケールを調整し、マルチエレクトロジカル配列(MEA)マイクロデータ12、13を埋め込み、抽出された脳の3Dスキャン表面を介してマクロスコピックMRI空間にデータを染色し、同様に非侵襲的に記録された脳。驚くべきことに、これはヒストグラムのモード値としてわずか〜50 μmの距離誤差を示した。その結果、MRI表面とスキャンされた3D表面との間の2つの表面間の最小距離のモード値は、6匹のマウスすべてに対してほぼ50μmであった。典型的なスライス幅は、約300μmのスパイク活性を記録した。
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Protocol
ここに記載されているすべての実験手順は、京都大学動物管理委員会によって承認されています。
1. 動物(1日目)
- メスのC57BL/6Jマウス(n=6、熟成3−5週間)を調出す。
注:このプロトコルは、すべてのげっ歯類種に適用可能です。
2. MRI設定(1日目)
- ヒーターマットコントローラーを使用して37°Cに調整したヒーターマットの上に置かれたアクリル麻酔ボックスにマウスを入れます。
- イソムラン気化器、空気流量計、空気圧縮機で構成される麻酔システムを使用して、1.4 L/minの流量でボックスを流れる空気中のイソルランを2%でマウスに麻酔します。
- 麻酔の誘導後、MRI互換のクレードルにマウスを置きます。痛みを感じないかピンセットでマウスのつま先を切り取って麻酔が十分かどうかを確認します。
- ゆりかごを装備した歯バーとフェイスマスクでマウスの頭部を固定します。次いで、フェイスマスクを介して1.4 L/minで空気中の1%−1.5%のイソファルランで麻酔を維持する。
- サーミスタ温度プローブをマウスの直腸に挿入し、マウスの背面に感圧呼吸センサーを設置します。
- ゆりかごをMRI磁石の穴に移します。イソファラン濃度を約1%−1.5%に調整し、麻酔の安定した再現性の深さを確保します。体温がMRI実験の全期間中に33~35°Cと0.5~1.3Hzの間で呼吸速度を制御しているかどうかを監視し、小型動物の生理パラメータに対するモニタリングシステム(材料の表)を使用して専用ソフトウェア(材料の表)。
- 直腸温度の測定値を用いて、監視システムに搭載されたヒーターシステムから磁石ボアに供給される温風の温度を制御して体温を調節する。
3. MRI取得(1日目)
-
高解像度3D T2加重MRIスキャンの準備
- マウスの位置を確認するために、3つの直交(軸、冠状、矢状)平面で3つの磁気共鳴(MR)画像を取得します。
- これらの画像を参照して、マウスの脳の中心が共振器の中心と軸方向のグラデーションコイルの中心に配置するように、クレードルを動かしてマウスの位置を調整します。
- 共振器を調整し、静磁界均質性(シミング)と基本周波数を調整し、無線周波数(RF)電力を調整してMRIシステムを調整します。
- コロナと矢状の向きを持つ低解像度の 2D マルチスライス T2 加重 (T2W) 画像を取得します。これらの画像に基づいて、高解像度 3D T2W MRI スキャンの視野 (FOV) を決定します。
- FASTMAP 自動シム アルゴリズムを使用してローカライズされたシミングを実行します。FASTMAP プロトコルの場合は、脳全体をカバーする長方形領域を選択します。局所シミングの完了後、点分解分光法(PRESS)を用いて局所的な1Hスペクトルにより脳領域内のB0場不均一性を確認する。
- 低解像度の 3D T2W 画像を取得して、FOV の適切な位置、ラップアラウンド (エイリアス) アーティファクトの不在、および脂肪信号の効率的な抑制を確認することで、高解像度 3D T2W MRI のスキャン設定が適切であることを確認します。
-
イメージングパルスシーケンス
- 上述の調製後、マウスの脳全体の高解像度3D T2W画像を取得し、リラクゼーション増強(RARE)配列を用いて迅速な取得を行う。
注:本稿では、MRI実験を7T、210mm水平ボア、前臨床スキャナで行い、ランプ時間100μsで440mT/mの勾配系を備えた。RF励起および信号受信には、内径35mmの直交体共振器を使用した。MRIデータは専用の運用ソフトウェアで取得しました。本研究で用いられる3D RAREパルス配列の取得パラメータを表1にまとめた。
- 上述の調製後、マウスの脳全体の高解像度3D T2W画像を取得し、リラクゼーション増強(RARE)配列を用いて迅速な取得を行う。
4. 実験ソリューションの準備(2日目)
- 氷冷切断溶液の500 mLを調製(2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO 4、7 mM MgCl2、15mMグルコース、25mM NaHCO3、0.5mM CaCl2、11.6mMアスコルベート、3.1mM mmピルビン酸ナトリウム、および10M95% O2および 5% CO 2)を使用します。pH を 7.3−7.4 に調整します。
- 人工脳脊髄液の1L(ACSF;127 mM NaCl、2.5mM KCl、1.25mM NaH2PO 4、1mM MgCl2、15mMグルコース、25mM NaHCO3、および2mM CaCl2、95%O2および5%CO2で泡立た)を調出す。 pH を 7.3~ 7.4 に調整します。
5. 設備の準備(2日目)
- 6.6 cm2正方形、0.5 cmの厚さの磁石「リング」を準備し、最初に黒いテープを配置し、第二に、リング上の外科テープ(図1c-2)。この材料は、脳ブロックベース(BBB)と呼ばれ、氷のブロックに冷やしておきます。
注:その後、テープはビブラートム用の脳ブロックを備えたスライスステーションに取り付けられます。正方形のリングは、2つの目的を満たすためにBBBの底ベースとして使用され、すなわち、3Dスキャンステーションからビブラートに脳ブロックをスムーズに移行し、スキャンステップで脳ブロックの高さを正確に測定します。 - 自動ターンテーブルでBBBを設定します。スキャナとターンテーブルの電源を入れます。画像処理ソフトウェアを起動します。
-
すべての実験に先立って、カメラのキャリブレーションと、構造化光投影とデスクトップ型3Dスキャナの接続ターンテーブルを実行します。
- センタープロジェクター、2台のカメラ、ターンテーブルをオンにします。次に、ソフトウェアを開きます。ソフトウェアで[光のセットアップ]をクリックし、画像領域を100 x 80、グリッド番号を100 x 100として選択します。次に、カメラキャリブレーションは、次の4つのステップに従って開始します。
- プロジェクターのセットアップでは、キャリブレーションシートを机の上に置き、キャリブレーションシートの上にキャリブレーションボードを置き、測定領域の固定点をシートの中央に、方向を前面に調整します。プロジェクターとボードの距離を約200mmに調整し、2つのノブを固定するネジを緩め、ノブを回転させて2台のカメラの光感度とフォーカスを調整します。次に、[矢印]をクリックして次の手順に進みます。
- カメラの向きを合向するには、2 台のカメラ自体を固定するネジを緩め、位置と回転をキャリブレーション ボードの中心線、垂直線、プロジェクターから投影された黄色の十字と重なるように動かします。カメラを修正し、もう一度[矢印] をクリックします。すると、画面が暗くなります。
- カメラに焦点を合わせるには、ノブの固定ネジを緩めた後、光の感度を上げ、フォーカスを再び調整します。次に、[矢印]をクリックして次の手順に進みます。
- F 値と露出の度合い(カメラ)の場合は、赤い領域が消える場所のすぐ下に再度光の感度を調整します。次に、もう一度矢印をクリックし、[キャリブレーションの開始]をクリックし、[はい] を選択すると[光学式設定が終了しましたか?
- キャリブレーションを初期化するをクリックし、ピクセル値が 0 ~ 255 の間で正規化されているかどうかを確認します。次に、[続行]をクリックします。
- 推奨される位置に従って、スキャナとキャリブレーションボードの9つの異なる相対角度の画像を記録し、キャリブレーションプロセスを確認した後に終了し、最後に、キャリブレーションの更新をクリックします。
- キャリブレーションボードをターンテーブルと交換し、ターンテーブルキャリブレーションをクリックします。
注:これで、すべてのキャリブレーションが完了しました。
- センタープロジェクター、2台のカメラ、ターンテーブルをオンにします。次に、ソフトウェアを開きます。ソフトウェアで[光のセットアップ]をクリックし、画像領域を100 x 80、グリッド番号を100 x 100として選択します。次に、カメラキャリブレーションは、次の4つのステップに従って開始します。
6. 脳表面スキャン、スライス、MEA記録(2日目)
- 1%−1.5%のイソファランでマウスを麻酔し、マウスを首を切り落とす。メスを使用して皮膚を開き、頭蓋骨を露出させます。
- 外科用ナイフを使用して矢状縫合に沿って麻酔マウスの頭皮をカットし、外科ハサミを使用して、ラムダポイントからブレグマの少し前のポイントに対角方向に頭蓋骨をカットします。その後、曲面ピンセットを使用して脳から頭蓋骨をそっと剥がします。
- へらを使って脳を持ち上げ、氷冷切断液(ステップ4.1で調製)でペトリ皿(100mm x 20mm)に移します。ポンプの制御回転速度(〜4.0rpm)を有する外部ガス爆弾から95%O2および5%CO2を含む流気は、氷冷切断液中に小さな気泡を発生させる(図1a)。
- 1~2分後、表面が小麦粉のふるいで覆われたマイクロファイバー布の上に脳を置き、マイクロファイバー布を使って脳表面から流体を拭きます(図1b)。
- BBBのサンプルスタンドに背部の側面を持つ脳を置き、また自動ターンテーブルの中心にBBBを置く。
- 3D スキャン中に部屋を暗くし、ターンテーブルで 3D スキャンを実行します。3D スキャンが適切に機能するかどうかをテストするには、2 つのショット間の角度を 22.5、開始角度を 0、最終角度を 360 (図 1c-1)に選択して、3Dスキャンをクリックします。
- ペトリ皿に脳を移動し、約10sの切断溶液で脳を泡立てます。
- 外科用ナイフを使用して、冠状平面の中央の2つのブロックに脳を切断し、外科的へらを使用して平らな表面に2つの脳ブロックを穏やかに移動させます。
- インスタント接着剤を使用してBBBの脳ブロックを取り付け、マイクロファイバー布を再び使用して、1~2分以内に脳表面から液体を柔らかく慎重に拭きます。次に、3D スキャンをもう一度実行します (図 1c-2)。
- BBBの中心を覆う黒いテープを、ビブラートメの切断段階の中心に取り付けます(図1d)。
- 切断段階に切断液を注ぎ、ビブラートに切断段階を設定します。切断速度と振幅を調整します。2つの脳ブロックから2~5個のコロナスライス(厚さ300μm)を作ります。可能であれば、溶液を切削段階に保ちます(図1e)。
- ビブラートムのブレードホルダーにブレードを取り付け、速度に対して12.7mm/min、周波数に87~88Hz、スイング幅に0.8~1.0mmと設定することで、システムの切断速度、周波数、振動振幅を最適化します。慎重な切断が必要な場合は、レベル2-3に速度を遅くします。
- 脳のスライスを切断しながら、前部後座標、半球、およびその他の条件を含む形式でスライスされた座標を記録します (図 2c)。
- 厚いプラスチックピペットを使用して、あらかじめ温められた(〜34°C)ACSFで満たされたビーカーに脳スライスを静かに移し、約34°Cでビーカーにインキュベートします。この間、切断段階で残りの脳ブロックの3Dスキャンを行います(図1c-2)。
- 記録ユニットにMEAチップをセットします。2本のチューブを使用して、チップを蠕動ポンプに接続します。一方のチューブを使用して同じ ACSF を MEA チップに導き、もう 1 つのチューブを MEA チップから ACSF をガイドします。
- 2本のチューブの先端に接続された2本の針(0.60 mm x 19 mm)をMEAチップの壁の上部に取り付け、MEAチップの内壁に続く先端で位置を固定します。ACSF の流量を 4.1 rpm に設定します。
- 1時間が経過した後、厚いプラスチックピペットを使用してチップ上のスライスを移動し、柔らかいブラシを使用して位置を設定します。次に、ニューロン活動の記録処理を開始する(図2-d)。
7. 免疫組織化学染色(3日目と4日目)
- MEA記録が終了したら、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)で満たされた1.5 mLチューブにスライスを移します。4°Cで一晩インキュベートします。次いで、4%のPFA溶液を取り出し、合計5分間PBSでスライスを3倍に洗浄する。
注:必要に応じて、スライスを20%ゼラチン/PBSに埋め込み、スライスを切除して50μmより薄くし、ビブラートムを使用します。 - 抗原検索液(10mMクチン酸ナトリウム、pH 6.0)を調記する。最後の洗浄からPBSを取り出し、抗原検索液を追加します。
- 電気サーモスポットで水を沸騰させ、ポットで〜95〜98°Cで20分間スライスしてチューブをインキュベートし、その後、自然な冷却を行います。
- 50 mMトリスバッファー生理食塩水を調製し、1% ナビスルボディ(1% ナビスルフィット-トリス溶液)を追加します。pH を 7.5 に調整します。その後、室温(〜20〜25°C)で5分間、1%のNaビスルフィットトリス溶液でスライスを洗浄します。
- 1%Naビスルフィット-トリス溶液に4%正常ヤギ血清および0.5%オクチルフェノールエトキシ酸塩を添加してブロッキング溶液を調製する。
- スライスでチューブから1%のNaビスルフィット-トリス溶液を取り出し、ブロッキング溶液を追加します。室温で2時間インキュベートする。
- 1%正常なヤギ血清と0.5%のトリトンX-100を1%Naビスルサイズトリス溶液に添加し、一次抗体を希釈することにより、一次抗体溶液を調製する。次の一次抗体の濃度を使用してください:マウス抗GAD67の1:800およびウサギの抗NeuNの1:500。
- スライスでチューブから1%のNaビスルフィット-トリス溶液を取り出し、一次抗体溶液を添加する。4°Cで一晩インキュベートします。
- 50 mMのトリスバッファリング生理食塩水を準備し、8.5 g/L NaCl(トリス-NaCl溶液)を追加します。pHを7.5に引き上げる。その後、スライスをトリスNaCl溶液(~20~25°C)で3倍に洗い、合計5分間洗います。
- 3%正常ヤギ血清と0.3%トリトンX-100をTris-NaCl溶液に添加し、二次抗体を希釈することにより、第2の抗体溶液を調製する。次の二次抗体の濃度を使用してください:ヤギの抗マウスの1:500とヤギの抗ウサギの1:500。
- スライスでチューブからTris-NaCl溶液を取り出し、二次抗体溶液を添加します。室温で2時間インキュベートします。その後、スライスをトリスNaCl溶液で3倍に洗い、合計5分間洗います。
- 小さなブラシを使用してスライド上にスライスを配置し、取り付けメディアとカバースリップを適用します。共焦点顕微鏡でスライドを調べます。スライスの表面の画像を撮ります(図2e)。
8. 皮質容積を抽出するMRIデータ処理
- フリーソフトウェアFSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation)をインストールします。セクション 3 で取得した MRI イメージを準備します。
- fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZコマンドを使用してイメージ形式を変更します。fslcreatehdコマンドを使用して人間の脳と同じ大きさにするために脳画像を展開し、必要に応じて、オプション-setqformcode 1を使用してfslorientを使用して向きを変更します。この後、fslchfiletype NIFTI_GZを使用して元のファイル形式を回復します。正確なコマンドは次のとおりです。
fslchファイルタイプ NFTI_PAIR [入力画像].nii.gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [入力画像].hdr.gz
fslorient –setqformmcode 1 [入力画像].hdr.gz
fslchファイルタイプ NIFTI_GZ [入力画像] - FSLと入力して、FSL ソフトウェアを開きます。グラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)からbetコマンドを使用して脳を抽出しますが、あまり剥がしません。次に、分画強度閾値、および初期脳表面球の中心の座標を慎重に制御する。最適な値は、個々のデータに対して異なります。
- ステップ 8.2 と同じ手順を使用して、脳イメージを元のマウスの脳サイズに変更します。正確なコマンドは次のとおりです。
fslchファイルタイプ NFTI_PAIR [入力画像].nii.gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.0 0 0 4 [入力画像].hdr.gz
fslorient –setqformmcode 1 [入力画像].hdr.gz
fslchファイルタイプ NIFTI_GZ [入力画像] - flirtコマンドを使用してすべての脳画像をコアギストレーションし、fslmaths コマンドの-addオプションと-divオプションを使用して平均的な脳イメージを生成します。
fslmaths [脳画像 1] – 追加 ... -追加 [脳画像 N] –div N [平均画像名] – odt float - fslmathsコマンドの-thrオプションを使用して、平均的な脳をクリーナーにします。次に、個々のケースに適応する最適なしきい値を選択します。
fslmaths [平均画像名] –thr [thr 値, 5000] [しきい値平均画像] - 最後に、flirt コマンドを使用して、平均的な脳画像を個人の座標に再度再形成します。次に、かなりきれいに抽出された皮質を調出す(図2a)。
注:残念ながら、嗅球と小脳を含むすべての脳の部分を覗き込むFSLソフトウェアの本質的な制限のために、MRI体積から再構築された脳表面に完全ではありません。
9. 皮質表面をストライプするMRI画像処理
- 別のフリーソフトウェア、3Dスライサー(https://download.slicer.org/)をダウンロードしてください。
- 3D スライサーのボリューム レンダリングモジュールとエディタ モジュールを使用して、抽出された脳の MR イメージを開きます([ファイル]をクリックし、セクション 8 に従って生成された[データの追加] を選択します)。
- モードをエディタからボリュームレンダリングに変更し、ターゲットボタンをクリックして、脳の画像を画面の中央に表示します。
- MR-T2ブレインモードを選択し、Shiftバーを動かしてしきい値を調整します。次に、ボリュームレンダリングからエディタに戻り、しきい値効果ボタンをクリックします。
- ラベル 41 を適用します。大脳皮質と.stlファイルとして脳表面データを保存します。次に、ファイル形式を.vtkから.stlに変更し、フォームをチェックしてファイルを保存します。
10. 3Dスキャンデータの前処理
-
スキャンのシーケンス内の 8 つまたは 16 の異なる角度から撮影された 8 つまたは 16 個の画像間で自動共同登録を実行し、[位置合わせ] オプションに含まれるグローバル登録をクリックして、それらの間の小さな不一致を修正し、それらを統合します。異なる角度からスキャンを繰り返し、脳全体の表面を得る(図2b)。
- 異なる角度からスキャンした画像間の統合が成功しなかった場合は、[手動位置合わせ]をクリックし、固定画像と動画のペアを選択します。
- [開始]をクリックして、異なるイメージ内の 3 つまたは 4 つの共通点を選択して、イメージの手動配置を開始します。次に、[OK] をクリックします。 最適化アルゴリズムは、反復的に最も近いポイント (ICP) アルゴリズム10です。非線形変形は含まれません。
- すべての画像を選択し、[メッシュ生成]ボタンをクリックして、整列されたすべてのイメージ (ドット データセット) のメッシュを作成します。次に、[小さいアーティスティックオブジェクト] オプションを選択して、メッシュを最高解像度として取得します。次に、イメージを .stl バイナリとして、または ASCII 形式で保存します。
11. MRI表面と3Dスキャンサーフェスの共登録
-
MRI サーフェスを開き、表面処理ソフトウェアを使用して 3D スキャン サーフェスとマージします。次に、手順 10.1.1 および 10.1.2 で説明した手順と同じ手順を使用して手動の位置合わせプロセスを実行します。次に、これらの共登録されたサーフェスイメージをもう一度保存します(図2a,b)。
- 必要に応じて、個々の表面データをクリーンアップし、例えば、脳領域を取り巻く小さなノイズを、特にMRIデータの場合は、特に3Dスキャンデータの場合は穴を埋めることによって除去する。
- 最後に、MATLABなどのデータ解析ソフトウェアを使用してサーフェスデータを開き、2つのサーフェス間の最小距離のヒストグラムを実行して評価します。
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Representative Results
MRI体積を剥離して生成される皮質表面間の距離と、抽出した脳の3Dスキャンから得られた表面を評価した。距離のヒストグラムのモード値はわずか 55 μm です (図3a)。さらに、距離がゼロに等しい点からヒストグラムを蓄積すると、累積値は〜300 μm(図3b)でサンプル総数の90%に達する。2つの表面間の距離の最終的なヒストグラムは、50 μmの周りの典型的なピークを示した。この値をマクロ的な観点から解釈すると、興味深いことに、精度、モード値~50 μm は、MRI のボクセルサイズ(図3a)、すなわち100 μmと予想される幾何学的制限に対応しています。この点は間接的に、MRIと3Dスキャンの間の重複するアルゴリズムICPが見事に機能し、MRIと3Dスキャンの両方のノイズレベルが低い値として抑制されたことを示唆している(図2a,b)14。
図1:実験フロー。(a) まず、マウスから脳を抽出した後、脳を泡立て切断液に落とし込んだ。(b) 柔らかく吸収性の高いタオルで切断液を拭き取った後、(c)脳をターンテーブルでスキャンした。(d) スライスを作る際(プロセスのステップ8)において、脳ブロックはビブラートのベースに脳ブロックを移動しやすいのでBBB上でスキャンした(プロセスのステップ7および8)。(e) 電気的活動を記録したり、細胞分布やその他の方法を染色するのに十分なスライスを得た後、残りの脳ブロックを再びスキャンした(プロセスのステップ10)。残りの脳ブロックの厚さは、スライスがどこから採取されたかの追加の重要なサポート情報を提供しました。(f) 最後に、MEAや染色方法等を用いて機能活動や構造構造を記録した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: データ処理パイプライン。(a) プロトコルのセクション8および9で説明されているように、MRI体積から皮質を剥離することによって生成される皮質表面の例。(b) 3Dスキャナシステムで直接スキャンした皮質表面の例。(c) 個々の脳スライスが抽出された脳領域を要約するために用いられるメモの一例。(d) 皮質スライスが電極皿上にある場合の例。(e) NeuN(赤)およびGAD67(緑)による染色された脳皮質スライスの例。すべての情報が統合データベースに収集されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: MRI と 3D スキャンの精度の重複。(a) MRI体積から剥離して抽出した表面間の距離のヒストグラム。サーフェスは 3D スキャンの記録から来ました。主棒グラフは、すべての個体の平均ヒストグラムであり、他の色付き線は個々のマウスの結果である(N=6、21-40日齢、全て雌マウスであった)。すべての個人に安定した一般的な傾向が見つかりました。(b) ヒストグラムの累積値は棒グラフで示されます。累積パーセンテージは~300 μm(点線)で90%に達しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:概念化された画像1 つのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) に統合された 2 つのスケールの情報。マクロ的な脳解剖学と顕微鏡神経回路情報の両方がウェブで表される1つのシステムに統合された。図3に示す高い精度により、これら2つのスケールをリアルに統合することができました。ここに示すマクロスコピック画像は、スケーラブルな脳アトラス15からです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | 値 |
| 繰り返し時間(TR) | 2,000 ミリ秒 |
| エコー時間(TE) | 9 ミリ秒 |
| 効果的な TE: | 45 ミリ秒 |
| レアファクター | 16歳 |
| 集録マトリックスサイズ | 196 x 144 x 144 |
| 視野 (FOV) | 19.6 x 14.4 x 14.4 mm3 |
| 取得帯域幅 | 75 kHz |
| 方向 | 軸(スキャナ設定のコロナ方向) |
| 脂肪抑制パラメーター | |
| 脂肪周波数 | 1051 Hz帯域幅の2.6ミリ秒ガウス形π/2パルス |
| スポイラーグラデーション | |
| ダミースキャン | 2回 |
| 平均数 | 3 |
| 取得時間 | 2 時間 42 分 |
表1:本研究で用いられる3D RAREパルス配列の取得パラメータ。
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Discussion
我々は、2つの脳表面をより正確に重ねることによって、マクロスコピックと顕微鏡空間スケールを橋渡しする3D-NEOプロトコルと呼ばれる新しいプロトコルを開発した。もともと、2つの脳表面画像の正確な重なり合いを可能にし、生物から健康な神経活動を記録することを可能にするこのプロトコルを作成する際に2つの課題がありました。まず、脳の生物を傷つけることなく頭蓋骨から抽出した後、抽出した脳を取り巻く切断液を効果的に拭き取る必要があった(プロトコルのステップ6.2)。第二に、乾燥と時間遅延の第1および第3の条件は、生体の潜在的な負の要因であるため、脳抽出からスライス製剤までのすべてのステップを10-15分以内に終了することも必要でした。ニューロンがアクティブです。
このプロトコルを用いて脳活動を正常に記録する能力により、構造組織だけでなく、脳全体の地図上の機能的活動の調整も可能になりました。このプロトコルのもう一つの肯定的な側面は、BBBが調製されたので、スキャナからビブラートメの基部への較正がはるかにスムーズになったことです。
代表的な結果で述べたように、2つの表面間の距離のヒストグラムは、約50μmでピークを示した。重なり合うプロセスを行いましたが、まるでマクロ的な視点から見たかのように。顕微鏡的な観点から結果を解釈すると、50 μmはニューロンの分布において同等の空間スケールであり、皮質ニューロンのペア間の接続確率は~100 μm16,17の範囲内で崩壊するので、数ミリメートル18内.実際には、MEAまたはカルシウムイメージング研究では、多くの場合、300~400 μmの厚いスライスを使用します。したがって、ここで提示する技術は、スライスが元の脳全体のマップに適切に埋め込まれている場合、強力な客観的証拠を提供します。重なり合いを正確に達成した後、顕微鏡下で観察されたローカル情報から純粋に追加の精度が得られます。したがって、グローバルおよびローカルの最適化ステップからなる2段階の最適化プロセスを実行することにより、将来的にはニューロンの典型的なサイズに半自動的に等しい空間分解能に到達することが可能となる。
この正確な統合プロトコルは、様々な脳アトラス18、20、21を生成するための基本的な技術を提供し、さらには他の霊長類22、23および人間のMRIをより深く研究する死後の脳(人間の脳は硫酸塩を有するが、gyriから十分な数の記録ポイントを得ることは可能である)。現在は、多くの記録されたデータ サンプルを 1 つの共通の空間座標に統合するビジュアル インターフェイスも開発しています。このような 1 つのイメージ図を図 4に示します。哺乳類の脳の場合、定量的に異なるスケール間の統合は、疾患状態を理解し、薬物効果を評価する上で質的に新たな進歩を遂げるでしょう。一般的に、魚類、爬虫類、両生類には適用が難しい。
3D-NEOプロトコルは、この研究によって神経科学または細胞生物学的研究分野に導入され、マクロ学的解剖学と顕微鏡的な神経分布との橋渡しにおいて高精度を実証することに成功した。マクロおよびマイクロコネクトームのトポロジアーキテクチャ。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
大学院医学系研究科医学情報工学科の皆さんのご支援に感謝し、高久和哲也教授、澤本信勝教授、ドリス・ザキアン先生のご支援に感謝申し上げます。コメント。本研究は、研究に対する助成金と、文部科学省の優秀若手研究者育成推進イニシアティブ(LEADER)プログラム(文部科学省)の支援を受けました。本研究におけるMRI実験は、京都大学大学院医学研究科医療研究支援センター小動物MRI部門で行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
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