Summary
이 기사에서는 두 개의 공간 척도를 연결하는 3D 스캐닝 기술을 사용하여 실험 프로토콜을 소개합니다: MRI에 의해 이미지된 전체 뇌 해부학의 거시적 공간 척도 >100 μm 및 이를 사용하는 뉴런 분포의 현미경 공간 스케일 면역히스토화학 염색 및 다중전극 어레이 시스템 및 기타 방법(~10 μm).
Abstract
다중 스케일 시스템인 인간의 뇌는 거시적 전기 신호를 모두 가지고 있으며, 전 세계적으로 두꺼운 백색 물질 섬유 번들을 따라 흐르고 있으며, 미세한 뉴런 스파이크는 축색과 모수석을 따라 전파됩니다. 두 척도 인간의 인지 및 행동 기능의 다른 측면을 보완. 거시적 수준에서 MRI는 가장 작은 공간 해상도인 복셀 크기가 0.1-1 mm3인현재의 표준 이미징 기술입니다. 또한, 현미경 수준에서, 이전 생리학 연구는 복셀 내의 불균일한 신경 구조의 알고 있었다. 이 연구는 3D 스캐닝 기술의 기술 적 진보와 생물학적 과학 연구를 상호 결합하여 미세 한 데이터를 거시적지도에 정확하게 포함시키는 강력한 방법을 개발합니다. 3D 스캐닝 기술은 지금까지 주로 엔지니어링 및 산업 설계에 사용되어 왔기 때문에 살아있는 뇌 세포에서 자연 스며드는 유지하면서 전체 뇌에 미세 커넥톰을 내장하는 데 처음으로 용도가 변경되었습니다. 이러한 목적을 달성하기 위해 먼저 습하고 반사되는 표면으로 인해 이미지에 본질적으로 어려움을 겪고 있는 살아있는 생물체로부터 정확한 3D 이미지를 얻기 위한 스캐닝 프로토콜을 구축했습니다. 둘째, 우리는 살아있는 뇌 조직의 저하를 방지하기 위해 속도를 유지하기 위해 훈련, 이는 더 나은 조건을 유지하고 뇌 조직의 활성 뉴런에서 더 많은 자연 신경 스파이크를 기록하는 핵심 요소입니다. 두 개의 서로 다른 이미징 모듈, 즉 MRI 및 3D 스캐너 표면 이미지에서 독립적으로 추출된 두 개의 피질 표면 이미지는 놀랍게도 히스토그램의 모드 값으로 50 μm의 거리 오차를 보여줍니다. 이 정확도는 세포 간 거리의 현미경 해상도와 규모에 필적; 또한, 그것은 다른 개별 마우스 중 안정. 이 새로운 프로토콜, 3D 소설 포함 중첩 (3D-NEO) 프로토콜, 이 통합 프로토콜에 의해 파생 된 거시적 및 현미경 수준을 브리지 하 고 포괄적인 연결 아키텍처를 공부 하는 새로운 과학적 결과 가속화 (즉, 마이크로 커넥톰)을 클릭합니다.
Introduction
다양한 물리적 및 생물학적 조직에서 불균일한 다중 스케일 아키텍처는 일반적으로1,2. 뇌는 또한 매우 균일하고 다중규모 네트워크 조직 3,4. 다양한 인지 기능은 이러한 네트워크 조직에서 코딩되어 서브 밀리초 시간적 해상도에서 신경 인구의 전기 스파이크 패턴의 시간적 변화를 유지합니다. 역사적으로, 뉴런 들 간의 복잡한 네트워크는 150 년 전5에서 산티아고 라몬 y Cajal에 의해 염색 기술을 사용하여 구조적으로 관찰되었다. 활성 뉴런의 그룹 행동을 관찰하기 위해 연구자들은다양한 기록 기술을 개발했습니다 6,7,8,이러한 기술의 최근 중요한 발전은 우리가 기록 할 수 있게 동시에 뉴런의 거대한 숫자에서 전기 활동. 또한, 이러한 기능적 활동으로부터 과학자들은 수많은 뉴런 들 사이에서 인과 상호 작용의 네트워크를 재구성하는 데 성공했으며 복잡한 상호 작용의 위상 구조를 '마이크로 커넥톰'9로 선언했습니다. . 많은 두뇌 지구가 다중 섬유 묶음에 의해 연결되기 때문에 두뇌의 거시적인 관측은 또한 네트워크 조직으로 전체 두뇌에 관하여 허용합니다. 글로벌 뇌 지도에 마이크로 커넥톰을 포함시키는 것은 여전히 현재의 기술 발전 내에서 명확한 한계를 가지고 있으며, 이 때문에 이 포함 프로토콜이 매우 중요합니다. 그러나 포함 프로토콜의 개발에는 많은 과제가 있습니다. 예를 들어, 순수하게 고립 된 뇌 영역에서 살아있는 국소 신경 회로의 활동을 관찰하기 위해, 뇌 조각은 시험관 내 기록을 위해 생산될 필요가있다. 또한, 생체 외에서 기록에 대 한 뇌 조각에서 기록은 여전히 적어도 두 가지 이유로 중요 한 선택. 첫째, ~1.5 mm보다 깊은 뇌 영역과 높은 시간적 해상도 (&1 ms)에서 동시에 많은 살아있는 개별 뉴런의 활동을 관찰하는 것은 쉽지 않습니다. 둘째, 로컬 뉴런 회로의 내부 아키텍처를 알고자 할 때, 우리는 혼란스러운 요인을 제거하기 위해 외부 뇌 영역에서 오는 모든 입력을 중지해야합니다. 생성된 뇌 조각의 방향과 위치를 식별하기 위해서는 좌표를 사용하여 생성된 뇌 조각의 공간 위치를 통합하는 것이 더욱 필요합니다. 그러나, 조직 된 방법으로 뇌 조각을 만드는 몇 가지 체계적이고 신뢰할 수있는 방법이 있습니다10,11. 여기서, 통합 프로토콜을 제공하기 위해 신경 과학 연구를 위한 3D 스캐닝 기술을 사용하여 새로운 공동 등록 프로토콜이 도입된다. 이 프로토콜은 마이크로 및 매크로 스케일을 조정하고 추출 된 뇌의 3D 스캔 표면을 통해 거시적 MRI 공간에 데이터를 염색하는 다중 전극 어레이 (MEA) 마이크로 데이터 (MEA) 마이크로 데이터12및13및 염색 을 하는 역할을 합니다. 비침습적으로 기록 된 뇌. 놀랍게도, 이것은 히스토그램의 모드 값으로 ~ 50 μm의 거리 오차를 보였다. 그 결과, MRI 표면과 스캔된 3D 표면 사이의 두 표면 사이의 최소 거리의 모드 값은 6마리의 마우스 모두에 대해 거의 50 μm에 달했으며, 이는 개인 간의 공통성을 확인할 때 적합한 수치이다. 전형적인 슬라이스 폭은 약 300 μm의 스파이크 활성을 기록하였다.
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Protocol
교토대학 동물관리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물 (1일차)
- 암컷 C57BL/6J 마우스(n = 6, 숙성 된 3-5 주)를 준비하십시오.
참고: 이 프로토콜은 모든 설치류 종에 적용 할 수 있습니다.
2. MRI 설정 (1일차)
- 히터 매트에 놓인 아크릴 마취 상자에 마우스를 넣고 히터 매트 컨트롤러를 사용하여 37°C로 조정하였다.
- 이소플루란 기화기, 공기 유량계 및 공기 압축기로 구성된 마취 시스템을 사용하여 상자를 통해 흐르는 공기 중 2%의 이소플루란으로 마우스를 마취시면 됩니다.
- 마취의 유도 후, MRI 호환 거치대에 마우스를 놓습니다. 핀셋으로 마우스의 발가락을 잘라서 마취가 충분한지 확인하여 통증을 느끼지 않는지 확인하십시오.
- 요람이 장착된 치아 바 및 얼굴 마스크로 마우스 의 머리를 고정합니다. 그런 다음, 얼굴 마스크를 통해 1%-1.5% 이소플루란을 공기 중에서 1.4 L/min으로 유지합니다.
- 서미스터 온도 프로브를 마우스 의 직장에 삽입하고 마우스 뒷면에 압력에 민감한 호흡 센서를 놓습니다.
- 크래일을 MRI 자석의 구멍으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 이소플루란 농도를 약 1%-1.5%로 조정하여 안정적이고 재현 가능한 마취 깊이를 보장합니다. MRI 실험의 전체 기간 동안 체온이 33-35°C에서 0.5~1.3Hz 사이의 호흡 속도를 조절하는지 모니터링하고, 작은 동물의 생리학적 파라미터에 대한 모니터링 시스템(재료 표)을 사용하여 모니터링합니다. 전용 소프트웨어(재료 표)를 참조하십시오.
- 직장 온도의 측정 값을 사용하여 모니터링 시스템에 장착 된 히터 시스템에서 자석 보어에 공급되는 따뜻한 공기의 온도를 제어하여 체온을 조절합니다.
3. MRI 취득 (1일차)
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고해상도 3D T2 가중 MRI 스캔 준비
- 마우스의 위치를 확인하기 위해 세 개의 직교 (축, 관상 및 시상) 평면에서 세 개의 자기 공명 (MR) 이미지를 획득합니다.
- 이러한 이미지를 참조하면 마우스 뇌의 중심이 공진기의 중심과 축 방향으로 그라데이션 코일의 중심에 위치하도록 거치대를 이동하여 마우스의 위치를 조정합니다.
- 공진기 조정, 정적 자기장 균질성(shimming) 및 기본 주파수 조정, 무선 주파수(RF) 전력 보정을 통해 MRI 시스템을 조정합니다.
- 코로나 및 시상 방향의 저해상도 2D 멀티슬라이스 T2 가중치(T2W) 이미지를 수집합니다. 이러한 이미지를 기반으로 고해상도 3D T2W MRI 스캔을 위한 시야(FOV)를 결정합니다.
- FASTMAP 자동 심 알고리즘을 사용하여 지역화된 쉬밍을 수행합니다. FASTMAP 프로토콜의 경우 전체 뇌를 덮는 직사각형 영역을 선택합니다. 국소화 된 쉬밍이 완료 된 후, 점 해결 분광법 (PRESS)을 사용하여 국부화 된 1H 스펙트럼에 의해 뇌 영역 내의 B0 필드 불균일성을 확인하십시오.
- 고해상도 3D T2W MRI에 대한 스캔 설정이 FOV의 적절한 위치, 랩어라운드(앨리어싱) 아티팩트의 부재 및 지방 신호의 효율적인 억제를 확인하여 저해상도 3D T2W 이미지를 수집합니다.
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이미징 펄스 시퀀스
- 위에서 설명한 제제 후, 마우스 전체의 고해상도 3D T2W 이미지를 획득하고, 이완 향상(RARE) 시퀀스를 이용한 신속한 획득을 이용하여 마우스 전체의 이미지를 획득한다.
참고: 이 기사에서 MRI 실험은 경사로 시간 100 μs에서 440 mT/m의 그라데이션 시스템을 갖춘 7 T, 210 mm 수평 보어, 전임상 스캐너에서 수행되었다. 내경 35 mm의 사분면 부피 공진기는 RF 여기 및 신호 수신에 사용되었다. MRI 데이터는 전용 작동 소프트웨어로 획득되었습니다. 본 연구에 사용된 3D RARE 펄스 서열의 획득 파라미터는 표1에 요약되어 있다.
- 위에서 설명한 제제 후, 마우스 전체의 고해상도 3D T2W 이미지를 획득하고, 이완 향상(RARE) 시퀀스를 이용한 신속한 획득을 이용하여 마우스 전체의 이미지를 획득한다.
4. 실험용액 준비(2일차)
- 얼음 냉기 절삭 용액 500 mL 준비 (2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4,7 mM MgCl2,15 mM 포도당, 25 mM NaHCO3,0.5 mM CaCl2,11.6 mM 나트륨 아스코르바테, 3.1 mM 나트륨 피루바테, 및 100 mm 95% O2 및 5% CO 2). pH를 7.3-7.4로 조정합니다.
- 인공 뇌척수액 1L(ACSF; 127 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2,15 mM GHCO 3, 2mM CaCl2,95% O2 및 5% CO2)를 준비한다. pH를 7.3-7.4로 조정합니다.
5. 장비 준비 (2일차)
- 6.6 cm2 정사각형, 0.5 cm 두께의 자석 "링"을 준비하고, 먼저 검은 테이프를 놓고, 둘째, 수술 용 테이프를 링에 놓습니다 (그림1c-2). 이 물질은 뇌 블록 베이스 (BBB)라는 이름으로 얼음 블록에 차가운 유지합니다.
참고: 나중에, 테이프는 진동에 대한 뇌 블록슬라이싱 스테이션에 부착됩니다. 사각형 링은 BBB의 하단 베이스로 사용되며, 즉 3D 스캔 스테이션에서 진동으로 원활하게 뇌 블록을 마이그레이션하고 스캐닝 단계에서 뇌 블록의 높이를 정확하게 측정하는 두 가지 목적을 충족시다. - 자동 턴테이블로 BBB를 설정합니다. 스캐너와 턴테이블을 켭니다. 이미지 처리 소프트웨어를 시작합니다.
-
모든 실험에 앞서 카메라 의 교정과 구조형 조명 프로젝션 및 데스크탑 형 3D 스캐너의 연결된 턴테이블을 수행합니다.
- 중앙 프로젝터, 두 대의 카메라 및 턴테이블을 켭니다. 그런 다음 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어에서 광학 설정을 클릭하고 이미지 영역을 100 x 80으로 선택하고 그리드 번호를 100 x 100으로 선택합니다. 그런 다음 다음 다음 네 단계에 따라 카메라 교정이 시작됩니다.
- 프로젝터 셋업을 위해 교정 시트를 책상 위에 놓고 교정 시트에 교정 보드를 놓아 측정 영역의 고정 지점을 시트 중앙으로 조정하고 앞쪽으로 방향을 조정합니다. 프로젝터와 보드 사이의 거리를 약 200mm로 조정합니다. 두 개의 노브를 고정하는 나사를 풀고 노브를 회전하여 두 카메라의 빛 감도와 초점을 조정합니다. 그런 다음 화살표를 클릭하여 다음 단계로 이동합니다.
- 카메라의 방향을 지정하려면 두 대의 카메라를 고정하는 나사를 느슨하게 하고 보정 보드의 중심선, 수직 선 및 프로젝터에서 투영된 노란색 십자가와 겹치도록 위치와 회전을 이동합니다. 카메라를 수정하고 화살표를 다시 클릭합니다. 그런 다음 화면이 어두워집니다.
- 카메라의 초점을 맞추기 위해 노브의 고정 나사를 풀고 조명 감도를 높이고 초점을 다시 조정하십시오. 그런 다음 화살표를 클릭하여 다음 단계로 이동합니다.
- F 값과 카메라의 노출 정도(카메라)의 경우 라이트 감도를 빨간색 영역이 사라지는 바로 아래까지 다시 조정합니다. 그런 다음 화살표를 다시 클릭하고 보정 시작을클릭하고 광학 설정을 완료했느냐고 묻는 메시지가 있으면 예를 선택합니까?
- 보정 초기화를클릭하고 픽셀 값이 0-255 사이에서 정규화되었는지 확인합니다. 그런 다음 계속을 클릭합니다.
- 제안된 위치를 따라 스캐너와 교정 보드의 9개의 서로 다른 상대 각도의 이미지를 기록하고 교정 프로세스를 확인한 후 완료하고 마지막으로 교정 업데이트를클릭합니다.
- 턴테이블에 대한 교정 보드를 교환하고 턴테이블보정을 클릭합니다.
참고: 이제 모든 교정이 완료됩니다.
- 중앙 프로젝터, 두 대의 카메라 및 턴테이블을 켭니다. 그런 다음 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어에서 광학 설정을 클릭하고 이미지 영역을 100 x 80으로 선택하고 그리드 번호를 100 x 100으로 선택합니다. 그런 다음 다음 다음 네 단계에 따라 카메라 교정이 시작됩니다.
6. 뇌 표면 스캔, 슬라이스 및 MEA 기록 (2 일차)
- 1%-1.5% 이소플루란으로 마우스를 마취시키고 마우스를 참수합니다. 메스를 사용하여 피부를 열고 두개골을 노출하십시오.
- 수술용 칼을 사용하여 시상 봉합사를 따라 마취된 마우스의 두피를 자르고, 두개골을 람다 지점에서 대각선 방향으로 절단하여 수술용 가위를 사용하여 브레그마 앞의 지점으로 약간 자른다. 그런 다음 곡선 핀셋을 사용하여 뇌에서 두개골을 부드럽게 벗깁니다.
- 주걱을 사용하여 뇌를 들어 올리고 얼음 차가운 절단 용액 (4.1 단계에서 준비)으로 페트리 접시 (100mm x 20mm)로 옮김하십시오. 펌프의 제어된 회전 속도를 가진 외부 가스 폭탄으로부터 95% O2 및 5% CO2를 함유하는 유동 공기(~4.0 rpm)는 얼음-냉기 절삭 용액에서 작은 기포를 생성한다(도 1a).
- 1-2 분 후, 표면이 밀가루 체로 약간 덮여있는 마이크로 화이버 천에 뇌를 넣고 미세 화이버 천을 사용하여 뇌 표면에서 액체를 부드럽게 닦으십시오 (그림1b).
- BBB의 샘플 스탠드에 등지 측면으로 뇌를 올려 놓고 BBB를 자동 턴테이블의 중앙에 놓습니다.
- 3D 스캔 중에 방을 어둡게 하고 턴테이블에서 3D 스캔을 수행합니다. 3D 스캔이 잘 작동하는지 테스트하려면 두 샷 사이의 각도를 22.5로, 시작 각도를 0으로, 최종 각도를 360(그림 1c-1)으로 선택하여 3D 스캔을 클릭합니다.
- 페트리 접시에 뇌를 이동하고, 약 10 s에 대한 절단 솔루션에 뇌를 거품.
- 수술용 칼을 사용하여 관상면 중앙에 있는 두 개의 블록으로 뇌를 자르고, 수술용 주걱을 사용하여 두 개의 뇌 블록을 평평한 표면으로 부드럽게 옮습니다.
- 인스턴트 접착제를 사용하여 BBB의 뇌 블록을 부착하고, 마이크로 화이버 천을 사용하여 1-2 분 이내에 뇌 표면에서 액체를 부드럽고 조심스럽게 닦아냅니다. 그런 다음 3D 스캔을 다시 수행합니다(그림1c-2).
- BBB의 중심을 덮는 검은색 테이프를 비브라토메의 절단 스테이지중앙에 부착합니다(그림 1d).
- 절단 단계에 절삭 용액을 붓고 진동에 절단 단계를 설정합니다. 절삭 속도와 진폭을 조정합니다. 두 개의 뇌 블록에서 2-5 개의 관상 조각 (두께 300 μm)을 만듭니다. 가능하면 절삭 단계에서 용액을버블링하십시오(그림 1e).
- 비브라토메의 블레이드 홀더에 블레이드를 부착하고 속도의 경우 12.7mm/min, 주파수의 경우 87~88Hz, 스윙 폭의 경우 0.8~1.0mm로 설정하여 시스템의 절삭 속도, 주파수 및 진동 진폭을 최적화합니다. 조심스럽게 절단해야 할 때는 속도를 2-3레벨로 느리게 합니다.
- 뇌 조각을 절단하는 동안 전방 후방 좌표, 반구 및 기타 조건(그림 2c)을포함하여 슬라이스된 좌표를 형식으로 기록합니다.
- 두꺼운 플라스틱 파이펫을 사용하여 미리 따뜻 (~34 °C) ACSF로 채워진 비커로 뇌 슬라이스를 부드럽게 옮기고 ~ 1 시간 동안 ~ 34 °C에서 비커에 배양하십시오. 이 시간 동안, 절단 단계(도 1c-2)에서남은 뇌 블록의 3D 스캔을 수행한다.
- 녹음 단위에 MEA 칩을 설정합니다. 두 개의 튜브를 사용하여 칩을 연동 펌프에 연결합니다. 하나의 튜브를 사용하여 동일한 ACSF를 MEA 칩으로 유도하고 다른 튜브를 사용하여 MEA 칩에서 ACSF를 유도합니다.
- 두 개의 튜브 끝에 연결된 두 개의 바늘(0.60mm x 19mm)을 MEA 칩의 벽 상단에 부착하고 MEA 칩의 내벽을 따라 팁으로 위치를 고정합니다. ACSF의 유량을 4.1rpm으로 설정합니다.
- 1시간 경과 후 두꺼운 플라스틱 파이펫을 사용하여 칩의 슬라이스를 이동하고 부드러운 브러시를 사용하여 위치를 설정합니다. 이어서, 신경 활동의 기록 과정을시작한다(도 2-d).
7. 면역화학 염색 (3일 및 4일)
- MEA 기록이 완료된 후, 인산완식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)로 채워진 1.5 mL 튜브로 슬라이스를 옮니다. 4 °C에서 밤새 배양. 그런 다음 4% PFA 용액을 제거하고 PBS로 슬라이스를 3x로 총 5분 동안 세척합니다.
참고: 필요한 경우, 20% 젤라틴/PBS에 슬라이스를 포함하고 조각을 절제하여 진동체를 사용하여 50 μm보다 얇게 만듭니다. - 항원 회수 용액 (구연산 나트륨 10 mM, pH 6.0)을 준비합니다. 마지막 세척에서 PBS를 제거하고 항원 회수 용액을 추가합니다.
- 전기 보온병에 물을 끓이고 냄비에 ~ 95-98 °C에서 20 분 동안 슬라이스로 튜브를 인큐베이션한 다음 자연 냉각을 합니다.
- 50 mM 트리스 완충 식염수를 준비하고 1 % Na bisulfite (1 % Na bisulfite- Tris 용액)을 추가합니다. pH를 7.5로 조정합니다. 이어서, 슬라이스를 실온(~20-25°C)에서 5분 동안 1% 나비설핏-트리스 용액으로 세척한다.
- 1% Na bisulfite-Tris 용액에 4% 정상 염소 혈청 및 0.5% 옥틸페놀 에톡실레이트를 첨가하여 차단 용액을 준비한다.
- 슬라이스와 튜브에서 1 % Na bisulfite-Tris 용액을 제거하고 차단 용액을 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 1% Na bisulfite-Tris 용액에 1% 정상 염소 혈청 및 0.5% 트리톤 X-100을 첨가하고 1차 항체를 희석시킴으로써 1차 항체 용액을 준비한다. 1차 항체의 농도: 마우스 항-GAD67의 1:800 및 토끼 항-NeuN의 1:500을 사용한다.
- 슬라이스와 튜브에서 1% Na bisulfite-Tris 용액을 제거하고 1 차 항체 용액을 추가합니다. 4 °C에서 하룻밤 배양.
- 50 mM Tris 버퍼링 식염수를 준비하고 8.5 g / L NaCl (Tris-NaCl 솔루션)을 추가하십시오. pH를 7.5로 적대합니다. 그런 다음 트리스-NaCl 용액(~20-25°C)으로 슬라이스를 총 5분 동안 3회 세척합니다.
- Tris-NaCl 용액에 3% 정상 염소 혈청 및 0.3% 트리톤 X-100을 첨가하고 이차 항체를 희석시킴으로써 제2 항체 용액을 준비한다. 이차 항체의 다음 농도를 사용: 염소 안티 마우스의 1:500 염소 안티 토끼의 1:500.
- 슬라이스가 있는 튜브에서 Tris-NaCl 용액을 제거하고 이차 항체 용액을 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 Tris-NaCl 용액으로 슬라이스를 3x 로 총 5분 동안 세척합니다.
- 작은 브러시를 사용하여 슬라이드에 슬라이스를 놓고 마운팅 미디어와 커버슬립을 적용합니다. 공초점 현미경으로 슬라이드를 검사합니다. 슬라이스 표면의 이미지를 가져다보입니다(그림 2e).
8. MRI 데이터 처리하여 피질 볼륨 추출
- 무료 소프트웨어 FSL(https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation)을설치합니다. 섹션 3에서 획득한 MRI 이미지를 준비합니다.
- fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ 명령을 사용하여 이미지 형식을 변경합니다. fslcreatehd 명령을 사용하여 인간의 뇌만큼 큰 만들기 위해 뇌 이미지를 확장하고, 필요한 경우, 옵션 -setqformcode1florient를 사용하여 방향을 변경합니다 . 그 후 fslchfiletype NIFTI_GZ를사용하여 원본 파일 형식을 복구합니다. 정확한 명령은 다음과 같습니다.
fslchfiletype NFTI_PAIR [입력 이미지].nii.gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 4 [입력 이미지].hdr.gz
fslorient –setqformmcode 1 [입력 이미지].hdr.gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [입력 이미지] - FSL 소프트웨어를 열려면 fsl을 입력합니다. 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)에서 내기 명령을 사용하여 뇌를 추출하지만 너무 많이 벗기지 마십시오. 그런 다음 분수 강도 임계값, 및 초기 뇌 표면 구의 중심 좌표를 신중하게 제어합니다. 최적의 값은 개별 데이터에 대해 다릅니다.
- 8.2단계에서와 동일한 절차를 사용하여 뇌 이미지의 크기를 원래 마우스 뇌 크기로 조정합니다. 정확한 명령은 다음과 같습니다.
fslchfiletype NFTI_PAIR [입력 이미지].nii.gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 4 [입력 이미지].hdr.gz
fslorient –setqformmcode 1 [입력 이미지].hdr.gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [입력 이미지] - flirt 명령을 사용하여 모든 뇌 이미지를 공동 등록하고 -add 옵션과 fslmaths 명령의 -div 옵션을 사용하여 평균 뇌 이미지를 생성합니다.
fslmaths [뇌 이미지 1] – 추가 ... – [뇌 이미지 N] – div N [평균 이미지 이름] – odt 플로트 - fslmaths 명령의 -thr 옵션을 사용하여 평균 뇌 클리너를 만듭니다. 그런 다음 개별 사례에 맞게 적합한 최적의 임계값을 선택합니다.
fslmaths [평균 이미지 이름] – thr [thr 값, 예를 들어, 5000] [임계값 평균 이미지] - 마지막으로, 평균 된 뇌 이미지를 다시 바람둥이 명령을 사용하여 개인의 좌표로 바조합니다. 그런 다음 추출 된 피질을상당히 깨끗하게 준비하십시오 (그림 2a).
참고 : 불행하게도, 후각 전구와 소뇌 때문에 후각 전구와 소뇌를 포함한 모든 뇌 부분을 pealFSL 소프트웨어의 필수적인 제한으로 인해 MRI 볼륨에서 재건 된 뇌 표면에 완벽하지 않습니다.
9. 스트라이프 피질 표면에 MRI 이미지 처리
- 다른 무료 소프트웨어, 3D슬라이서 (https://download.slicer.org/)를 다운로드합니다.
- 3D 슬라이서의 볼륨 렌더링 및 편집기 모듈을 사용하여 섹션 8에 따라 생성된 추출된 뇌의 MR 이미지(파일 클릭 및 데이터 추가선택)를 엽니다.
- 편집기에서 볼륨 렌더링으로모드를 변경하고 대상 버튼을 클릭하여 뇌의 이미지가 화면 중앙으로 이동하도록 합니다.
- MR-T2-브레인 모드를 선택하고 Shift 막대를 이동하여 임계값을 조정합니다. 그런 다음 볼륨 렌더링에서 편집기로 다시 이동하고 임계값 효과 단추를 클릭합니다.
- 라벨 41을 적용합니다. 대뇌 피질 및 .stl 파일로 뇌 표면 데이터를 저장합니다. 그런 다음 파일 형식을 .vtk에서 .stl로변경하고 양식을 확인하여 파일을 저장합니다.
10. 3D 스캔 데이터를 위한 전처리
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정렬 옵션에 포함된 전역 등록을 클릭하여 스캔 시퀀스 내에서 8개 또는 16개의 서로 다른 각도에서 촬영한 8개 또는 16개의 이미지 간에 자동 공동 등록을 수행하고 통합합니다. 다른 각도에서 스캔을 반복하여 전체 뇌표면을 얻습니다(그림 2b).
- 다른 각도에서 스캔한 이미지 간의 통합이 성공하지 못하면 수동 정렬을 클릭하고 고정 이미지 와 움직이는 이미지쌍을 선택합니다.
- 시작을 클릭하여 다른 이미지에서 3개 또는 4개의 공통점을 선택하여 이미지의 수동 정렬을 시작합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 최적화 알고리즘은 반복적 근접 점(ICP) 알고리즘(10)입니다. 비선형 변형은 포함되지 않습니다.
- 모든 이미지를 선택하고 메시 생성 버튼을 클릭하여 정렬된 모든 이미지(예: 도트 데이터 세트)의 메시를 만듭니다. 그런 다음 작은 예술 오브젝트 옵션을 선택하여 메시를 가장 높은 해상도로 가져옵니다. 그런 다음 이미지를 .stl 바이너리 또는 ASCII 형식으로 저장합니다.
11. MRI 표면 및 3D 스캔 표면의 공동 등록
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MRI 표면을 열고 표면 처리 소프트웨어를 사용하여 3D 스캔 표면과 병합합니다. 이어서, 10.1.1 및 10.1.2 단계에 설명된 것과 동일한 절차를 사용하여 수동 정렬 과정을 수행한다. 그런 다음 이러한 공동 등록된 표면 이미지를 다시 저장합니다(그림 2a,b).
- 필요한 경우, 예를 들어, 뇌 영역을 둘러싼 작은 소음, 특히 MRI 데이터의 경우, 특히 3D 스캔 데이터의 경우 구멍을 채우는 방식으로 개별 표면 데이터를 청소합니다.
- 마지막으로, MATLAB과 같은 데이터 분석 소프트웨어로 지표면 데이터를 열고 두 서피스 사이의 최소 거리의 히스토그램을 수행하고 평가합니다.
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Representative Results
우리는 MRI 부피를 제거하여 생성 된 피질 표면과 추출 된 뇌의 3D 스캔에서 얻은 표면 사이의 거리를 평가했습니다. 거리의 히스토그램의 모드 값은 55 μm (그림 3a)입니다. 또한 거리가 0인 지점에서 히스토그램을 축적할 때 누적된 값은 ~300 μm(그림 3b)에서총 샘플 수의 90%에 도달합니다. 두 표면 사이의 거리의 최종 히스토그램은 약 50 μm의 전형적인 피크를 보였다. 우리가 거시적 관점에서이 값을 해석하는 경우, 흥미롭게도, 정확도, 모드 값 ~ 50 μm, MRI의 복셀 크기에서 예상 된 기하학적 한계에 해당 (그림3a),즉, 100 μm. 이 점은 간접적으로 MRI와 3D 스캔 사이의 중첩 알고리즘ICP가 훌륭하게 작동했으며 MRI와 3D 스캔 모두의 노이즈 레벨이 낮은 값으로 억제되었음을 시사합니다(도2a,b)14.
그림 1: 실험 흐름. (a) 먼저, 마우스로부터 뇌를 추출한 후, 뇌를 버블링 커팅 용액으로 떨어뜨렸다. (b) 부드럽고 흡수성이 높은 수건으로 절단 용액을 닦은 후, (c) 뇌를 턴테이블에서 스캔하였다. (d) 슬라이스를 만드는 과정에서(공정의 8단계) 뇌 블록을 BBB상에서 스캔한 것은 뇌 블록을 비브라토메(공정의 7단계 및 8단계)를 위해 기저부로 이동하기 쉽기 때문이다. (e) 전기 적 활동을 기록하거나 세포 분포 및 기타 방법을 염색하기위한 충분한 조각을 얻은 후, 나머지 뇌 블록을 다시 스캔하였다 (프로세스의 10 단계). 나머지 뇌 블록의 두께는 슬라이스가 어디에서 가져온 지에 대한 추가적인 중요한 지원 정보를 제공했습니다. (f) 마지막으로, 우리는 MEA 또는 염색 방법 및 기타 방법을 사용하여 기능 적 활동 또는 구조 아키텍처를 기록했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 데이터 처리 파이프라인입니다. (a) 프로토콜의 섹션 8 및 9에 설명된 바와 같이 MRI 부피로부터 피질을 제거하여 생성된 피질 표면의 예. (b) 3D 스캐너 시스템에 의해 직접 스캔된 피질 표면의 예. (c) 개별 뇌 조각이 추출된 곳에서 뇌 영역을 요약하는 데 사용되는 메모의 예입니다. (d) 피질 슬라이스가 전극 접시에 있을 때의 예이다. (e) NeuN(적색) 및 GAD67(녹색)에 의한 스테인드 된 뇌 피질 슬라이스의 예. 이제 모든 정보가 통합 데이터베이스에 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MRI와 3D 스캔 간의 정확도 가 겹칩니다. (a) MRI 부피에서 벗겨내어 추출된 표면 사이의 거리 히스토그램. 표면은 3D 스캔 기록에서 나왔습니다. 메인 바 그래프는 모든 개인에 대한 평균 히스토그램이고, 다른 색깔의 선은 개별 마우스(N=6, 21-40일, 모두 암컷 마우스)에 대한 결과이다. 일반적인 추세, 모든 개인에 대 한 안정, 찾을 수 있습니다. (b) 히스토그램의 누적 값은 막대 그래프로 표시됩니다. 누적 비율은 ~ 300 μm (점선)에서 90 %에 도달했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 개념화된 이미지 하나의 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)에 통합된 두 가지 정보 스케일. 거시적인 뇌 해부학과 현미경 신경 회로 정보는 모두 웹으로 표현되는 하나의 시스템에 통합되었습니다. 그림3에 표시된 높은 정확도덕분에 이 두 축척을 사실적으로 통합할 수 있었습니다. 여기에 제시 된 거시 적 이미지는 확장 가능한뇌 아틀라스 15에서입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수 | 값 |
| 반복 시간 (TR) | 2,000 ms |
| 에코 시간(TE) | 9 ms |
| 유효 TE: | 45 ms |
| 희귀 인자 | 16세 |
| 수집 행렬 크기 | 196 x 144 x 144 |
| 시야(FOV) | 19.6 x 14.4 x 14.4 mm3 |
| 수집 대역폭 | 75 kHz의 |
| 방향 | 축방향(스캐너 설정의 관상 방향) |
| 지방 억제 보람계 | |
| 지방 주파수 | 1051 Hz 대역폭을 가진 2.6 ms-gaussian 모양π/2 펄스 |
| 스포일러 그라데이션 | |
| 더미 스캔 | 2회 |
| 평균 수 | 3개 |
| 취득 시간 | 2 시간 42 분 |
표 1: 본 연구에 사용된 3D 희귀 펄스 서열의 획득 파라미터.
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Discussion
우리는 이전보다 더 정확하게 두 개의 뇌 표면을 중첩하여 거시적 및 현미경 공간 스케일을 연결하는 3D-NEO 프로토콜이라는 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 원래, 가능한 두 개의 뇌 표면 이미지의 정확한 중첩을 만든이 프로토콜을 만드는 두 가지 도전이 있었다 살아있는 유기체에서 건강한 신경 활동을 기록. 첫째, 뇌 유기체를 손상시키지 않고 두개골에서 추출 한 후 추출 된 뇌를 둘러싼 절단 용액을 효과적으로 닦아야합니다 (프로토콜의 6.2 단계). 둘째, 건조및 시간 지연의 첫 번째 및 세 번째 조건이 살아있는 유기체에 대한 잠재적 인 부정적인 요인이기 때문에, 뇌 추출에서 슬라이스 제제에 이르기까지 스캐닝 과정의 모든 단계를 10-15 분 이내에 완료하는 것도 유지가 필요했습니다. 뉴런이 활성화됩니다.
이 프로토콜을 사용하여 뇌 활동을 성공적으로 기록할 수 있는 능력은 이제 구조 조직뿐만 아니라 전체 뇌 지도의 기능 적 활동의 조정을 가능하게했습니다. 이 프로토콜의 또 다른 긍정적인 측면은 BBB가 준비된 이후 스캐너에서 진동기까지의 교정이 훨씬 원활해졌다는 것입니다.
대표적인 결과에서 언급했듯이, 두 표면 사이의 거리의 히스토그램은 약 50 μm에서 피크를 보였다. 우리는 겹치는 과정을 수행하지만, 마치 거시적 관점에서 보는 것처럼. 우리가 현미경 관점에서 결과를 해석하는 경우에, 50 μm는 타락한 뉴런의 쌍 사이 연결 확률이 ~100 μm16,17,17, 17, 도 내에서 부패하기 때문에, 뉴런의 분포에 있는 비교가능한 공간 규모입니다 몇 밀리미터 이내18. 실질적으로, MEA 또는 칼슘 화상 진찰 연구 결과는 수시로 300-400 μm 두꺼운 조각을 이용합니다. 따라서 여기에 제시된 기술은 조각이 원래의 전체 뇌 맵에 제대로 내장되어 있는 경우 강력한 객관적인 증거를 제공합니다. 중첩이 정확하게 달성되면 현미경으로 관찰된 로컬 정보에서 순전히 추가 정확도를 얻을 수 있습니다. 따라서, 글로벌 및 국부적 최적화 단계로 구성된 2단계 최적화 프로세스를 수행함으로써, 향후 뉴런의 전형적인 크기에 반자동적되는 공간 해상도에 도달할 수 있을 것이다.
이 정확한 통합 프로토콜은 다양한 뇌 지도력18,20,21을 생성하는 기본 기술을 제공하며 심지어 다른 영장류22,23 및 인간의 MRI를 보다 심층적으로 연구할 수 있습니다. 사후 뇌 (인간의 뇌는 황치가 있지만, gyri에서 기록 포인트의 충분한 수를 얻을 수있다). 이제 우리는 또한 하나의 공통 공간 좌표에 많은 기록 된 데이터 샘플을 통합하는 시각적 인터페이스를 개발하고있다. 이와 같은 하나의 이미지 그림은 그림4에 나와 있습니다. 포유류 두뇌의 경우에, 정량적으로 다른 규모 사이 통합은 또한 질병 상태를 이해하고 약 효력 평가에 질적으로 새로운 어드밴스를 만들 것입니다. 일반적으로, 이것은 물고기에 적용 하기 어려울 것 이다, 파충류, 그리고 양서류, 연구원은 어려운 추출 된 얇은 두뇌의 형태를 유지 하기 어려운 그것의 사전 추출 된 형태로 안정, 그리고 그들의 작은 두뇌의 MRI 이미지 또한 상대적으로 시끄러운 될 것입니다.
3D-NEO 프로토콜은 신경 과학 또는 세포 생물학적 연구 분야에 이 연구에 의해 도입되었으며, 거시적 해부학과 현미경 신경 분포 사이의 브리징에서 높은 정확도를 성공적으로 입증했습니다. 매크로 및 마이크로 커넥톰의 위상 학적 아키텍처.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
M.S.는 의과대학 의과대학 의학정보공학과의 모든 스태프의 성원에 감사드리며, 다카쿠와 데츠야 교수님, 사와모토 노부카쓰 교수, 도리스 자키안 교수님의 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 코멘트. 이 연구는 MEXT (문부과학성)에서 석사까지 의 외래 연구 (LEADER) 프로그램을 위한 이니셔티브와 도전적인 탐사 연구를위한 보조금 지원에 의해 지원되었습니다. 이 작품의 MRI 실험은 일본 교토대학 의학연구센터, 의학연구지원센터, 소동물MRI학과에서 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
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