Summary
Denne artikkelen introduserer en eksperimentell protokoll ved hjelp av 3D-skanning teknologi som bygger bro over to romlige skalaer: den makroskopisk romlige skalaen av hele hjernen anatomi fotografert av MRI på > 100 μm og mikroskopisk romlig skala av neuronal distribusjoner ved hjelp av immunhistokjemi farging og en multielectrode array system og andre metoder (~ 10 μm).
Abstract
Den menneskelige hjerne, som er et multiscale system, har både makroskopisk elektriske signaler, globalt strømmer langs tykt hvitt-materie fiber bunter, og mikroskopiske neuronal pigger, spre langs axons og dendrites. Begge skalaer utfyller ulike aspekter av menneskelig kognitive og atferdsmessige funksjoner. På makroskopisk nivå har MRI vært den nåværende standard bildeteknologien, der den minste romlige oppløsningen, Voxel størrelsen, er 0,1 – 1 mm3. På mikroskopisk nivå var også tidligere fysiologiske studier klar over uniformt neuronal arkitekturer i slike voxels. Denne studien utvikler en effektiv måte å nøyaktig legge inn mikroskopiske data i et makroskopisk kart ved å grensesnitt biologisk vitenskapelig forskning med teknologiske fremskritt i 3D skanning teknologi. Siden 3D skanning teknologien har for største delen blitt anvendt for ingeniørvitenskap og industriell tegning til nå, det er en repurposed for det første gang å legge ned i microconnectomes inn i hele hjerne stund bevarer naturlig skyter inne lever hjerneceller. For å oppnå dette formålet, først, konstruerte vi en skanning protokoll for å få nøyaktige 3D-bilder fra levende bio-organismer iboende utfordrende å image på grunn av fuktige og reflekterende overflater. For det andre har vi trent til å holde hastigheten for å hindre nedbrytning av levende hjernevev, som er en nøkkelfaktor i å beholde bedre forhold og opptak mer naturlig neuronal pigger fra aktive neurons i hjernevevet. To kortikale overflate bilder, uavhengig Hentet fra to forskjellige Imaging moduler, nemlig MRI og 3D skanner overflaten bilder, overraskende viser en avstand feil på bare 50 μm som modus verdien av histogrammet. Denne nøyaktigheten er sammenlignbar i skala til mikroskopisk oppløsning av intercellulære avstander; Det er også stabilt blant forskjellige individuelle mus. Denne nye protokollen, 3D romanen embedding overlappende (3D-NEO) protokoll, broer makroskopisk og mikroskopiske nivåer avledet av denne integrerende protokollen og akselererer nye vitenskapelige funn for å studere omfattende tilkobling arkitekturer (dvs. microconnectome).
Introduction
Uniformt multiscale arkitekturer på ulike fysiske og biologiske organisasjoner er vanligvis funnet1,2. Hjernen er også en svært uniformt og multiscale nettverk organisasjon3,4. Ulike kognitive funksjoner er kodet i slike nettverk organisasjoner, holde timelige endringer av elektriske pigg mønstre av neuronal populasjoner i submillisecond timelige oppløsninger. Historisk, de komplekse nettverkene blant neurons ble strukturelt observert i detalj ved hjelp av farging teknikker av Santiago Ramón y Cajal fra over 150 år siden5. For å observere gruppe oppførsel av aktive neurons, har forskere utviklet ulike opptaks teknologier6,7,8, og den nylige betydelige utviklingen av slike teknologier har gjort oss i stand til å spille inn elektriske aktiviteter fra store antall neurons samtidig. Videre, fra slike funksjonelle aktiviteter, har forskere lyktes å rekonstruere nettverk av årsakssammenheng interaksjoner blant store antall neurons og har erklært den topologisk arkitekturen av deres komplekse interaksjoner ' microconnectome '9 . Makroskopisk observasjoner av hjernen også tillate for om en hel hjerne som en nettverksorganisasjon fordi mange hjernen regioner er forbundet med flere fiber-bunter. Innebygging av microconnectomes i den globale hjernen kartet har fortsatt klare begrensninger innen dagens teknologiske fremskritt, og det er derfor denne embedding protokollen er så viktig. Det er imidlertid mange utfordringer for utviklingen av innebygging protokollen. For eksempel, for å observere aktiviteter for å leve lokale neuronal kretser i rent isolerte hjerneområder, må hjerne skiver produseres for in vitro innspillinger. I tillegg er opptak fra hjerne skiver for in vitro-innspillinger fortsatt et viktig valg for minst to grunner. Først er det fortsatt ikke lett å observere aktiviteter av mange levende individuelle neurons samtidig fra hjernen regioner dypere enn ~ 1,5 mm og i høy Temporal oppløsning (< 1 MS). For det andre, når vi håper å vite den interne arkitekturen i en lokal neuronal krets, må vi stoppe alle innganger som kommer fra eksterne hjernen regioner for å eliminere forvirrende faktorer. For å identifisere retninger og posisjoner av produserte hjerne skiver, vil det være ytterligere nødvendig å integrere den romlige plasseringen av disse produserte hjerne skiver ved hjelp av koordinater. Det er imidlertid noen systematiske og pålitelige måter å lage hjerne skiver på en organisert måte10,11. Her introduseres en ny coregistration-protokoll ved hjelp av 3D-skannings teknologi for neuroscientific forskning for å gi en integrerende protokoll. Denne protokollen fungerer å koordinere mikro-og macroscales og legge multielectrode array (Mea) mikrodata12,13 og farging data på en makroskopisk MRI plass gjennom 3D Scan overflater av utpakkede hjerner, samt av invasivt registrert hjerner. Overraskende, dette viste en avstand feil på bare ~ 50 μm som modus verdien av histogrammet. Som følge av dette var modus verdiene for minimums avstander mellom to overflater mellom MRI-overflaten og den skannede 3D-overflaten nesten 50 μm for alle de seks musene, som er et passende tall når man ser etter felles blant enkeltpersoner. Den typiske skive bredde hadde en innspilt Spike aktivitet på rundt 300 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet her er godkjent av Kyoto University Animal Care Committee.
1. dyr (dag 1)
- Forbered kvinnelige C57BL/6J-mus (n = 6, i alderen 3 − 5 uker).
Merk: Denne protokollen gjelder for alle gnagerarter.
2. MRI-innstillinger (dag 1)
- Sett musen i en akryl anestesi boks plassert på en varmematte justert til 37 ° c ved hjelp av en varmematte kontrolleren.
- Bedøve musen med 2% isoflurane i luft som strømmer gjennom boksen ved en strømningshastighet på 1,4 L/min ved hjelp av en anestesi system, som er sammensatt av en isoflurane fordamper, luft strømningsmåler, og luftkompressor.
- Etter induksjon av anestesi, Plasser musen i en MRI-kompatibel vugge i liggende stilling. Sjekk om anestesi er tilstrekkelig ved klipping en tå av musen med pinsett for å se om det ikke føles smerte.
- Fest musen hode med tann bar og ansiktsmaske utstyrt med holderen. Deretter opprettholder anestesi med 1% − 1,5% isoflurane i luft ved 1,4 L/min via ansiktsmasken.
- Sett inn en termistor temperatur sonde i endetarmen på musen og Plasser en trykkfølsom respirasjons sensor på baksiden av musen.
- Overfør holderen til boringen av en MRI-magnet. Juster isoflurane konsentrasjon til rundt 1% − 1,5% for å sikre en stabil og reproduserbar dybde av anestesi. Monitor hvis kroppstemperatur styres mellom 33 − 35 ° c og respirasjons raten mellom 0,5 − 1,3 Hz under hele perioden Mr-eksperimenter, ved bruk av et overvåkningssystem (materialfortegnelsen) for de fysiologiske parametrene til små dyr med dedikert programvare (tabell av materialer).
- Ved hjelp av den målte verdien av rektal temperatur, regulere kroppstemperaturen ved å kontrollere temperaturen på varm luft som følger med magneten bore fra et Varmeapparat system utstyrt i overvåkingssystemet.
3. MRI-oppkjøp (dag 1)
-
Forberedelser for høyoppløselig 3D T2-vektet MRI-skanning
- Erverve tre magnetisk resonans (MR) bilder i tre ortogonale (aksial, koronale og sagittal) fly for å sjekke musen posisjon.
- Med henvisning til disse bildene, justere plasseringen av musen ved å flytte holderen slik at midten av musen hjernen er plassert i midten av Resonator så vel som i midten av gradient spoler i aksial retning.
- Juster MRI-systemet ved å stille inn Resonator, justere det statiske magnetfeltets homogenitet (shimming) og grunn frekvensen, og kalibrere radiofrekvens strømmen (RF).
- Tilegne seg lav oppløsning 2D-multisnitt T2-vektet (T2W) bilder med koronale og sagittal orientering. Basert på disse bildene, kan du bestemme synsfeltet (FOV) for en høyoppløselig 3D T2W MRI-skanning.
- Utføre lokaliserte shimming ved hjelp av en FASTMAP automatisk SHIM algoritme. For FASTMAP-protokollen velger du et rektangulært område som dekker hele hjernen. Etter at de lokaliserte shimming er fullført, bekrefter du B0 -feltet inhomogeneity i hjerne området ved hjelp av et lokalisert 1H-spektrum ved å bruke punkt løst spektroskopi (trykk).
- Skaff bilder med lav oppløsning på 3D T2W for å sikre at skanneinnstillingene for 3D T2W Mr med høy oppløsning er hensiktsmessige ved å kontrollere den aktuelle posisjonen til FOV, fraværet av wraparound (aliasing) artefakter og effektiv undertrykkelse av fett signaler.
-
Puls sekvens for bildebehandling
- Etter forberedelsene beskrevet ovenfor, erverve høyoppløselig 3D T2W bilder av musen hele hjernen, ved hjelp av en rask oppkjøp med avslapping ekstrautstyr (RARE) sekvens.
Merk: I denne artikkelen ble Mr eksperimenter utført på en 7 T, 210 mm horisontal bore, prekliniske scanner, utstyrt med en gradient system av 440 mT/m på rampen tid 100 μs. En Quadrature volum Resonator med en indre diameter på 35 mm ble brukt til RF-eksitasjon og signalmottak. Mr-data ble anskaffet med en dedikert driftsprogram vare. Anskaffelses parametrene for den 3D-SJELDNE puls sekvensen som brukes i denne studien, er oppsummert i tabell 1.
- Etter forberedelsene beskrevet ovenfor, erverve høyoppløselig 3D T2W bilder av musen hele hjernen, ved hjelp av en rask oppkjøp med avslapping ekstrautstyr (RARE) sekvens.
4. utarbeidelse av eksperimentelle løsninger (dag 2)
- Forbered 500 mL av en iskald skjære løsning (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 7 mm MgCl2, 15 mm glukose, 25 mm NaHCO3, 0,5 mm CaCl2, 11,6 mM natrium ascorbate, 3,1 mm natrium pyruvat og 100 mm kolin klorid, boblet med 95% O2 og 5% co2). Juster pH til 7.3 − 7.4.
- Forbered 1 L av den kunstige spinalvæsken (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mm MgCl2, 15 mm glukose, 25 mM NaHCO3, og 2 mm CaCl2, boblet med 95% O2 og 5% co2). Juster pH til 7.3 – 7.4.
5. utarbeidelse av utstyr (dag 2)
- Forbered en 6,6 cm2 kvadrat, 0,5 cm tykk magnet "Ring" og, først, plasser svart tape og, andre, kirurgisk tape på ringen (figur 1C-2). Merk at dette materialet er oppkalt en hjerne-blokk Base (BBB), og holde det kaldt på blokker av is.
Merk: Senere vil båndene festes til skjære stasjonen med hjerne blokker for vibratome. Plassen ringen brukes som bunnen base av BBB å tilfredsstille to formål, nemlig å migrere hjernen blokker jevnt fra 3D-skanning stasjonen til en vibratome og å måle nøyaktig høydene av hjernen blokkene i skanningen trinn. - Sett opp BBB med en automatisk platespiller. Slå på skanneren og dreieskiven. Start bildebehandlingsprogrammet.
-
Før alle eksperimenter, utføre kalibreringer av kameraene og den tilkoblede dreieskiven av en strukturert lysprojeksjon og desktop-type 3D scanner.
- Slå på senter projektoren, de to kameraene og dreieskiven. Deretter åpner du programvaren. I programvaren, klikker du optisk oppsett og velg bildet området som 100 x 80 og rutenettet tall som 100 x 100. Deretter starter kamera kalibreringen i henhold til følgende fire trinn.
- For projektorens oppsett legger du kalibreringsarket på skrivebordet og setter kalibreringskortet på kalibreringsarket for å justere festepunktet for måleområdet til midten av arket og retningen til fronten. Juster avstanden mellom projektoren og styret til rundt 200 mm. løsne skruene som fester de to knottene, og roter bryterne for å justere lysfølsomheten og fokus for de to kameraene. Deretter klikker du pilen for å gå til neste trinn.
- For å orientere kameraene, løsne skruene feste de to kameraene selv og flytte posisjoner og rotasjoner å overlappe med midtlinjen på kalibreringskortet, den vertikale linjen, og det gule korset projisert fra projektoren. Fiks kameraene, og klikk på pil igjen. Deretter blir skjermen mørk.
- Å fokusere kameraene, etter å løsne festeskruene på knottene, øke lysfølsomhet og tune fokus igjen. Deretter klikker du pilen for å gå til neste trinn.
- For F-verdien og graden av eksponering (av kameraet), justerer du lysfølsomheten igjen til like under der det røde området forsvinner. Klikk deretter pil igjen, og klikk kalibrering Start, og velg Ja hvis du blir spurt har du fullført den optiske innstillingen?
- Klikk Initialiser kalibreringen, og kontroller om pikselverdiene er normalisert mellom 0 – 255. Deretter klikker du Fortsett.
- Ved å følge foreslåtte posisjoner, ta opp bilder av ni forskjellige relative vinkler av skanneren og kalibreringskortet, og avslutt etter å ha bekreftet kalibreringsprosessen, og til slutt klikker du på Oppdater av kalibreringen.
- Utveksle kalibreringskortet for dreieskiven, og klikk på dreieskiven kalibrering.
Merk: Nå er alle kalibreringer ferdig.
- Slå på senter projektoren, de to kameraene og dreieskiven. Deretter åpner du programvaren. I programvaren, klikker du optisk oppsett og velg bildet området som 100 x 80 og rutenettet tall som 100 x 100. Deretter starter kamera kalibreringen i henhold til følgende fire trinn.
6. Brain Surface Scan, kutting, og MEA Recording (dag 2)
- Bedøve en mus med 1% − 1,5% isoflurane og halshugge musen. Bruk en skalpell for å åpne huden og utsett skallen.
- Skjær hodebunnen av anesthetized musen langs sagittal Sutur ved hjelp av en kirurgisk kniv, og kutt skallen i diagonal retninger fra lambda peker til et punkt litt foran bregma ved hjelp av kirurgisk saks. Deretter forsiktig skrelle av skallen fra hjernen ved hjelp av buet pinsett.
- Bruk en slikkepott til å løfte hjernen og overføre den til en Petri parabol (100 mm x 20 mm) med iskald skjæring løsning (utarbeidet i trinn 4,1). Flow luft som inneholder 95% O2 og 5% co2 fra en ekstern gass bombe med en kontrollert roterende hastighet på pumpen (~ 4,0 RPM) for å generere små bobler i iskald skjæring løsning (figur 1a).
- Etter 1 – 2 min, Legg hjernen på en mikrofiber klut hvis overflate er litt dekket av en mel sil, og tørk væske fra hjernen overflaten, forsiktig ved hjelp av mikrofiber klut (figur 1B).
- Sett hjernen med rygg aspektet opp på prøven stå på BBB, og også sette BBB i sentrum av den automatiske dreieskiven.
- Gjør rommet mørkere under 3D-skanningen, og utfør en 3D-skanning på dreieskiven. Hvis du vil teste om 3D-skanningen fungerer bra, klikker du 3D-skanning ved å velge vinkelen mellom to bilder som 22,5, start vinkelen som 0 og den endelige vinkelen som 360 (figur 1C-1).
- Beveg hjernen til en Petri parabol, og boble hjernen i skjæring løsning for ca 10 s.
- Skjær hjernen i to blokker på midten av koronale flyet ved hjelp av en kirurgisk kniv, og flytte de to hjernen blokkene forsiktig til den flate overflaten ved hjelp av en kirurgisk slikkepott.
- Fest hjernen blokkene av BBB ved hjelp av Instant lim, og mykt og forsiktig tørke væsken fra hjernen overflaten innen 1-2 min, ved hjelp av en mikrofiber klut igjen. Deretter utfører du en 3D-skanning på nytt (figur 1C-2).
- Fest den sorte tapen som dekker midten av BBB til midten av skjære fasen for en vibratome (figur 1d).
- Hell skjære løsningen inn i skjære fasen og sett skjære fasen på vibratome. Juster skjærehastighet og amplitude. Lag 2 – 5 koronale skiver (300 μm tykke) fra de to hjerne blokkene. Hold løsningen i skjære fasen bobler om mulig (figur 1e).
- Fest et blad til bladholderen på vibratome og Optimaliser Skjærehastigheten, frekvensen og vibrasjons amplituden til systemet ved å sette dem som 12,7 mm/min for hastigheten, 87 – 88 Hz for frekvensen og 0,8 – 1,0 mm for sving bredden. Når forsiktig skjæring er nødvendig, tregere hastigheten til nivå 2-3.
- Mens kutte hjerne skiver, ta opp snittet koordinat i formatet, inkludert fremre bakre koordinat, halvkule, og andre forhold (figur 2C).
- Overfør forsiktig hjerne skiver til et beger fylt med prewarmed (~ 34 ° c) ACSF ved hjelp av en tykk plast pipette, og ruge dem i begeret ved ~ 34 ° c for ~ 1 h. I løpet av denne tiden utfører du en 3D-skanning av de resterende hjerne blokkene på skjære trinnet (figur 1C-2).
- Sett en MEA-chip på en opptaksenhet. Koble brikken til en peristaltisk pumpe ved hjelp av to rør. Bruk ett rør for å veilede den samme ACSF i MEA-brikken og den andre slangen for å veilede ACSF ut av MEA-brikken.
- Fest to pinner (0,60 mm x 19 mm), koblet til tuppen av de to rørene, til toppen av veggen på MEA-brikken, og fest posisjonene deres med tipsene deres etter den indre veggen til MEA-brikken. Sett strømningshastigheten til ACSF til 4,1 RPM.
- Etter 1 h har passert, flytte en skive på brikken ved hjelp av en tykk plast pipette, og angi posisjonen ved hjelp av en myk børste. Deretter starter innspillingen prosessen med neuronal aktiviteter (figur 2-d).
7. immunhistokjemi farging (dager 3 og 4)
- Etter at MEA-opptaket er ferdig, overfører du skivene til 1,5 mL rør fylt med 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfat-bufret saltvann (PBS). Ruge dem over natten ved 4 ° c. Deretter fjerner du 4% PFA løsning, og vask skivene 3x med PBS i 5 min totalt.
Merk: Om nødvendig, bygge inn skiver i 20% gelatin/PBS og reseksjon stykket for å gjøre det tynnere enn 50 μm, ved hjelp av vibratome. - Forbered antigen henting løsning (10 mM natrium citrate, pH 6,0). Fjern PBS fra siste vask og tilsett antigen henting løsning.
- Kok vann i en elektrisk termos gryte og ruge rørene med skiver i 20 min ved ~ 95 – 98 ° c i potten, etterfulgt av naturlig kjøling.
- Forbered 50 mM Tris-bufret saltvann og tilsett 1% na bisulfite (1% na bisulfite-Tris-løsning). Juster pH til 7,5. Vask deretter skivene med 1% na bisulfite-Tris-løsning i 5 minutter ved romtemperatur (~ 20 – 25 ° c).
- Klargjør blokkerings løsningen ved å legge til 4% normal geit serum og 0,5% octylphenol ethoxylate til 1% na bisulfite-Tris-løsningen.
- Fjern 1% na bisulfite-Tris-løsningen fra rørene med sektorene og Legg til blokkerings løsning. Ruge for 2 timer ved romtemperatur.
- Forbered den primære antistoff løsningen ved å tilsette 1% normal geit serum og 0,5% Triton X-100 til 1% na bisulfite-Tris løsning og fortynning primære antistoffer. Bruk følgende konsentrasjoner av primære antistoffer: 1:800 av mus anti-GAD67 og 1:500 av kanin anti-NeuN.
- Fjern 1% na bisulfite-Tris-løsningen fra rørene med skiver og tilsett den primære antistoff løsningen. Ruge den over natten ved 4 ° c.
- Forbered 50 mM Tris-bufret saltvann og tilsett 8,5 g/L NaCl (Tris-NaCl-løsning). Titrere pH-verdien til 7,5. Deretter vaskes skivene 3x med Tris-NaCl-oppløsning (~ 20 – 25 ° c) i 5 min totalt.
- Klargjør den andre antistoff løsningen ved å tilsette 3% normal geit serum og 0,3% Triton X-100 til Tris-NaCl-løsningen og fortynning av sekundære antistoffer. Bruk følgende konsentrasjoner av sekundære antistoffer: 1:500 av geit anti-mus og 1:500 av geit anti-kanin.
- Fjern Tris-NaCl-løsningen fra rørene med skiver og tilsett den sekundære antistoff løsningen. Ruge den i 2 timer ved romtemperatur. Deretter vaskes skiver 3x med Tris-NaCl løsning for 5 min totalt.
- Plasser sektorene på lysbildet ved hjelp av en liten pensel, og bruk monterings medier og en dekkglass. Undersøk lysbildene med et konfokalmikroskopi mikroskop. Ta bilder av overflaten av et stykke (figur 2e).
8. MRI data Processing å trekke kortikale volumer
- Installere det ledig programvare FSL (https://fsl.fmrib.Ox.ac.uk/FSL/fslwiki/FslInstallation). Klargjør MRI-bildene ervervet i avsnitt 3.
- Endre bildeformatet ved hjelp av kommandoen FSLCHFILETYPE NIFTI_PAIR_GZ . Utvid hjernen bildet for å gjøre det så stor som en menneskelig hjerne ved hjelp av fslcreatehd kommandoen, og, om nødvendig, endre orientering ved hjelp fslorient med alternativet -setqformcode 1. Etter dette, gjenopprette det opprinnelige filformatet ved hjelp FSLCHFILETYPE NIFTI_GZ. Det pressepenger av kommandere er som følger.
fslchfiletype NFTI_PAIR [Input Image]. NII. gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 0 4 [Input Image]. HDR. gz
fslorient – setqformmcode 1 [Input Image]. HDR. gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [inn data bilde] - Type FSL å åpen det FSL programvare. Pakk hjernen ved hjelp av Bet kommandoen fra det grafiske brukergrensesnittet (GUI), men ikke skrelle for mye. Deretter kontroll av brøk intensitet terskler,... og koordinater for sentrum av første hjernen overflaten sfære nøye. De optimale verdiene er forskjellige for individuelle data.
- Endre størrelsen på hjernen bildet til den opprinnelige musen hjernens størrelse, ved hjelp av samme fremgangsmåte som i trinn 8,2. Det pressepenger av kommandere er som følger:
fslchfiletype NFTI_PAIR [Input Image]. NII. gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0,08 0 0 0 0 4 [Input Image]. HDR. gz
fslorient – setqformmcode 1 [Input Image]. HDR. gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [inn data bilde] - Coregistrate alle hjernen bilder ved hjelp av flørt kommandoen, og produsere en gjennomsnittlig hjernen bildet ved hjelp av -Legg til alternativ og -div alternativet for fslmaths kommandoen.
fslmaths [hjernen bilde 1]-legge...-Legg [hjernen bilde N]-div N [gjennomsnitt bilde navn]-ODT float - Gjør gjennomsnittlig hjernen renere ved hjelp av -THR alternativet til fslmaths kommandoen. Deretter velger du en optimal terskelverdi tilpasset individuelle saker.
fslmaths [gjennomsnitt bilde navn]-THR [THR verdi, for eksempel, 5000] [thresholded gjennomsnittlig bilde] - Til slutt omforme den gjennomsnittlige hjernen bildet i en individuell ' s koordinere med flørt kommandoen igjen. Deretter forbereder ganske ren ekstrahert cortexes (figur 2a).
Merk: Dessverre, den olfactory pære og lillehjernen vil ikke være perfekt i rekonstruert hjernen overflaten fra MRI-volumer på grunn av FSL programvare er viktige begrensninger for å skrallende alle hjerne deler inkludert olfactory pære og lillehjernen.
9. MRI bildebehandling til stripe kortikale overflater
- Last ned en annen fri programvare, 3D slicer (https://download.slicer.org/).
- Åpne MR-bilder av den utpakkede hjernen (Klikk på fil og velg Legg til data) produsert i henhold til § 8, ved hjelp av volum rendering og Editor moduler i 3D slicer.
- Endre modus fra Editor til volum rendering, og klikk på en mål knapp for å gjøre bildet av hjernen kommer til midten av skjermen.
- Velg Mr-T2-Brain- modus og Juster terskelen ved å flytte SKIFT -linjen. Så, bevege rygg fra kvantum oversettelse å Editor og falle i staver terskelen bevirke knapp.
- Bruk etikett 41. Cerebral cortex og lagre hjernens overflate data som en STL -fil. Deretter endrer du filformatet fra . VTK til . STL, og lagre filen ved å merke av for skjemaet.
10. forbehandling for 3D Scan data
-
Utfør en automatisk coregistration mellom 8 eller 16 bilder tatt fra 8 eller 16 forskjellige vinkler innenfor en sekvens av et søk for å korrigere små uoverensstemmelser mellom dem ved å klikke global registrering inkludert i justering alternativet, og integrere dem. Gjenta skanninger fra forskjellige vinkler for å få tak i hele hjerne overflaten (figur 2b).
- Hvis integreringen mellom bilder som er skannet fra forskjellige vinkler ikke var vellykket, klikker du Manuell justering og velger et par av et fast bilde og et bevegeligbilde.
- Klikk Start for å starte den manuelle justeringen av bildene ved å velge tre eller fire vanlige punkt i forskjellige bilder. Deretter klikker du OK. Algoritmen for optimalisering er den gjentakende algoritmen for nærmeste punkt (ICP)10. Det inkluderer ikke en ikke-lineær deformasjon.
- Lag en maske av alle de justerte bildene (dvs. av prikkene datasett) ved å velge alle bilder og ved å klikke på mesh generasjon knappen. Deretter velger du alternativet små kunstneriske objektet for å få mesh som den høyeste oppløsningen. Deretter lagrer du bildet som STL-binær eller i ASCII-format.
11. Coregistration av MRI-overflaten og 3D Scan-overflaten
-
Åpne MRI-overflaten og slå den sammen med 3D Scan-overflaten ved hjelp av overflate behandlingsprogramvaren. Utfør deretter en manuell justerings prosess ved hjelp av samme fremgangsmåte som beskrevet i trinn 10.1.1 og 10.1.2. Deretter lagrer du disse coregistered overflate bildene på nytt (figur 2a, b).
- Om nødvendig, rengjør de enkelte overflate data, for eksempel ved å slette små lyder rundt hjernen regionen, spesielt i tilfelle av MRI-data, og ved å fylle hullene hvis det finnes, spesielt i tilfelle av 3D-skanning data.
- Til slutt åpner du overflate dataene med en dataanalyse programvare, for eksempel MATLAB, og utfører og evaluerer histogrammer for minimums avstandene mellom de to overflatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi evaluerte avstander mellom kortikale overflater, produsert av stripping MRI-volum, og overflater Hentet fra 3D-skanninger av utpakkede hjerner. Modus verdiene til histogrammet for avstandene er bare 55 μm (figur 3a). I tillegg når du samler histogrammet fra punktet der avstanden lik null, den akkumulerte verdien når 90% av totalt antall eksempel tall på ~ 300 μm (figur 3b). Det siste histogrammet av avstandene mellom to flater viste en typisk topp rundt 50 μm. Hvis vi tolker denne verdien fra en makroskopisk synspunkt, interessant, nøyaktigheten, modus verdien ~ 50 μm, tilsvarer den geometriske begrensningen, som var forventet fra Voxel størrelsen på MRIs (figur 3a), nemlig 100 μm. Dette punktet indirekte tyder på at overlappende algoritme, ICP, mellom Mr og 3D Scan fungerte utmerket godt og at støynivået av både MRI og 3D Scan ble undertrykt som lav verdi (figur 2a, b)14.
Figur 1: den eksperimentelle flyten. (a) først, etter utpakking av en hjerne fra en mus, ble hjernen droppet inn i en boblet cutting løsning. (b) etter å ha tørket skjære løsningen av med et mykt og svært absorberende håndkle, (c) ble hjernen skannet på en platespiller. (d) i å gjøre skiver (trinn 8 i prosessen), ble hjernen blokkene skannet på en BBB fordi det er lett å flytte hjernen blokker til basen for en vibratome (trinn 7 og 8 av prosessen). (e) etter å få nok skiver for opptak elektriske aktiviteter eller for farging av celle distribusjoner og andre metoder, de resterende hjernen blokkene ble skannet på nytt (trinn 10 av prosessen). Tykkelsen av de resterende hjernen blokkene gitt ytterligere viktig støtteinformasjon om hvor skiver ble tatt fra. (f) til slutt, vi registrerte funksjonelle aktiviteter eller strukturelle ARKITEKTURER med Mea eller farging metoder og andre metoder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: databehandlings forløpet. (a) et eksempel på en kortikale overflate produsert av stripping CORTEXES fra MRI-volumer som forklart i avsnittene 8 og 9 i protokollen. (b) et eksempel på en kortikale overflate som skannes direkte av et 3D-skanner system. (c) et eksempel på et memo som brukes til å oppsummere hjerne regionen hvor de enkelte hjerne stykkene ble trukket ut. (d) et eksempel på når kortikale skive er på en elektrode rett. (e) et eksempel på en farget hjerne kortikale skive av NeuN (rød) og GAD67 (grønn). All informasjon er nå kommer til å være samlet i en enhetlig database. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: overlappende nøyaktighet mellom MRIs og 3D-skanninger. (a) histogrammer av avstander mellom overflater utvunnet av peeling fra Mr-volumer. Overflatene kom fra 3D skanning innspillinger. Hovedfeltet er det gjennomsnittlige histogrammet for alle individer, og andre fargede linjer er resultater for individuelle mus (N = 6, alderen 21 – 40 dager, alle var kvinnelige mus). En generell trend, stabil for alle individer, kan bli funnet. (b) den akkumulerte verdien av histogrammet vises som et stolpediagram. Akkumulert prosentandel nådde 90% ved ~ 300 μm (prikkede linjer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: begrepsfestet bilde av to skalaer med informasjon integrert i ett grafisk brukergrensesnitt (GUI). Både den makroskopisk hjerne anatomien og den mikroskopiske neuronal krets informasjonen ble integrert i ett system representert av en Web. Den høye nøyaktighetsgraden, vist i Figur 3, gjorde det mulig for oss å integrere disse to vektene realistisk. Den makroskopisk bildet som presenteres her er fra en skalerbar hjernen Atlas15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Parametere | Verdier |
| Repetisjons tid (TR) | 2 000 MS |
| Ekko tid (TE) | 9 MS |
| Effektiv TE: | 45 MS |
| SJELDEN faktor | 16 |
| Størrelse på anskaffelses matrise | 196 x 144 x 144 |
| Synsfelt (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 mm3 |
| Båndbredde for oppkjøp | 75 kHz |
| Retning | Aksial (koronale retning i skanner innstilling) |
| Fat undertrykkelse parammeters | |
| fett frekvens | 2,6 MS-Gaussian-formet π/2-puls med 1051 Hz båndbredde |
| spoiler gradient | |
| dummy skanner | to ganger |
| Antall gjennomsnitt | 3 |
| Anskaffelsestid | 2 h 42 min |
Tabell 1: anskaffelses parametrene for den 3D-SJELDNE puls sekvensen som brukes i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utviklet en ny protokoll kalt 3D-NEO-protokollen til å bygge bro over makroskopisk og mikroskopiske romlige vekter ved å overlappe to hjerne flater mer nøyaktig enn før. Opprinnelig var det to utfordringer i å skape denne protokollen som gjorde det mulig nøyaktig overlapping av to hjernen overflaten bilder og opptak sunne neuronal aktiviteter fra levende organismer. Først var det nødvendig å effektivt tørke kutte løsning rundt utdraget hjernen etter utpakking det fra skallen uten å skade hjernen organisme (trinn 6,2 av protokollen). For det andre, siden den første og tredje betingelser for tørrhet og tidsforsinkelsen er potensielle negative faktorer for den levende organismen, etterbehandling alle trinnene i skanneprosessen fra hjernen utvinning til stykket forberedelser innen 10-15 min var også nødvendig å holde nevroner aktive.
Evnen til å kunne registrere hjernens aktiviteter ved hjelp av denne protokollen har nå gjort det mulig koordinering ikke bare av strukturelle organisasjoner, men også av funksjonelle aktiviteter på hele hjernen kartet. En annen positiv del av denne protokollen er at siden en BBB var forberedt, ble kalibreringen fra skanneren til bunnen av vibratome mye jevnere.
Som nevnt i representative resultatene, histogrammet av avstander mellom to flater viste en topp på rundt 50 μm. Selv om vi utførte overlappende prosessen, som ved å se fra makroskopisk synspunkt. Hvis vi tolker resultatet fra det mikroskopiske synspunktet, er 50 μm en sammenlignbar romlig skala i fordelingen av neurons, siden tilkobling sannsynligheter mellom par av kortikale neurons Decay innen ~ 100 μm16,17, selv innen flere millimeter18. Praktisk talt, MEA eller kalsium Imaging studier ofte bruker 300-400 μm tykke skiver. Så teknikken som presenteres her vil gi sterke objektive bevis dersom skiver er riktig innebygd i originale hele hjernen kart. Etter overlapping er nøyaktig oppnådd, vil ytterligere nøyaktighet oppnås rent fra den lokale informasjonen observert under et mikroskop. Derfor, ved å utføre en to-trinns optimaliseringsprosessen bestående av globale og lokale optimaliserings trinn, vil det være mulig å nå en romlig oppløsning likhetstegn mellom semi-automatisk til den typiske størrelsen på en Nevron i fremtiden.
Denne nøyaktige integrerings protokollen gir grunnleggende teknologi for å generere ulike Brain Atlas18,20,21 og til og med å studere mer i dybden Mr av andre primater22,23 og menneskelig postmortem hjerner (selv om den menneskelige hjerne har sulci, er det mulig å få et tilstrekkelig antall opptaks poeng fra Gyri). Nå utvikler vi også et visuelt grensesnitt for å integrere mange registrerte data prøver i én felles romlig koordinat. Ett bilde figur som dette er vist i Figur 4. I tilfeller av pattedyr hjerner, vil integrasjonen mellom kvantitativt forskjellige skalaer også gjøre nye fremskritt kvalitativt i å forstå sykdomstilstander og vurdere narkotika effekter. Vanligvis vil dette være vanskelig å gjelde for fisk, reptiler og amfibier, fordi forskerne vil finne det vanskelig å holde formen på den utpakkede tynne hjernen stabilt til sin pre-utpakkede form, og MRI-bilder av deres mindre hjerner vil også være relativt mer støyende.
3D-NEO-protokollen har blitt innført av denne forskningen til et neuroscientific eller celle biologisk forskningsfelt, vellykket demonstrere høy nøyaktighet i å bygge bro mellom makroskopisk anatomi og mikroskopisk neuronal distribusjon, inkludert topologisk arkitekturer av makro-og microconnectomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
M.S. er takknemlig for støtte fra alle de ansatte i medisinsk informasjon engineering kurs i Graduate School of Medicine og fakultet for medisin, og ønsker å takke Prof Tetsuya Takakuwa, Prof Huzioka Sawamoto, og Doris Zakian for deres hjelpsomme Kommentarer. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for utfordrende undersøkende forskning og av ledende initiativ for Excellent unge forskere (LEADER) program til M.S. fra MEXT (departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi). Mr eksperimenter i dette arbeidet ble utført i divisjonen for små dyr MRI, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , Oxford University Press. (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of Neural Science. , McGraw-Hill. New York, NY. (2013).
- Pine, J. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. Taketani, M., Baudry, M. , Springer. New York, NY. 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. , Springer-Verlag. 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
