Summary
Este artigo introduz um protocolo experimental utilizando tecnologia de digitalização 3D que constrói duas escalas espaciais: a escala espacial macroscópica da anatomia do cérebro inteiro imaged por RM a > 100 μm e a escala espacial microscópica de distribuições neuronais utilizando Coloração imuno-histoquímica e um sistema de arranjo multieletrodo e outros métodos (~ 10 μm).
Abstract
O cérebro humano, sendo um sistema multidimensionado, tem sinais elétricos macroscópicos, fluindo globalmente ao longo de feixes de fibras de matéria branca grossas, e picos neuronais microscópicos, propagando-se ao longo de axônios e dendritos. Ambas as escalas complementam diferentes aspectos das funções cognitivas e comportamentais humanas. No nível macroscópico, a RM tem sido a atual tecnologia de imagem padrão, na qual a menor resolução espacial, tamanho de VOXEL, é de 0,1 – 1 mm3. Também, no nível microscópico, os estudos fisiológicos precedentes estavam cientes de arquiteturas neuronal não uniforme dentro de tais voxels. Este estudo desenvolve uma maneira poderosa de incorporar com precisão dados microscópicos em um mapa macroscópico por meio da interface de pesquisa científica biológica com avanços tecnológicos na tecnologia de digitalização 3D. Desde que a tecnologia da exploração 3D tem sido usada na maior parte para a engenharia e o projeto industrial até agora, reaproveitado para a primeira vez incorporar microconnectomes no cérebro inteiro ao preservar o spiking natural em pilhas de cérebro vivas. A fim alcançar esta finalidade, primeiramente, nós construímos um protocolo da exploração para obter imagens 3D exatas dos bio-organismos vivos que desafiam inerentemente à imagem devido às superfícies húmidas e reflexivas. Em segundo, nós treinamos para manter a velocidade para impedir a degradação do tecido vivo do cérebro, que é um factor chave em reter melhores condições e em registrar uns pontos neuronal mais naturais dos neurônios ativos no tecido de cérebro. Duas imagens de superfície corticais, independentemente extraídas de dois módulos de imagem diferentes, ou seja, ressonância magnética e imagens de superfície do scanner 3D, surpreendentemente mostram um erro de distância de apenas 50 μm como valor de modo do histograma. Esta exatidão é comparável na escala à definição microscópica de distâncias intercelular; também, é estável entre diferentes camundongos individuais. Este novo protocolo, o romance 3D incorporando sobreposição (3D-NEO) protocolo, pontes macroscópicas e microscópicos níveis derivados por este protocolo integrativo e acelera novos achados científicos para estudar arquiteturas de conectividade abrangentes (ou seja, microconnectome).
Introduction
Arquiteturas multiescala não uniformes em várias organizações físicas e biológicas são comumente encontradas1,2. O cérebro também é uma organização de rede muito não uniforme e multiescala3,4. As várias funções cognitivas são codificadas em tais organizações da rede, prendendo mudanças temporais de testes padrões elétricos do ponto de populações neuronal em resoluções temporais do de. Historicamente, as complexas redes entre os neurônios foram estruturalmente observadas em detalhes usando as técnicas de coloração por Santiago Ramón y Cajal de mais de 150 anos atrás5. Para observar os comportamentos de grupo de neurônios ativos, pesquisadores desenvolveram várias tecnologias de gravação6,7,8, e os recentes desenvolvimentos significativos de tais tecnologias permitiram-nos gravar atividades elétricas de um grande número de neurônios simultaneamente. Além disso, a partir de tais atividades funcionais, os cientistas conseguiram reconstruir redes de interações causais entre um grande número de neurônios e declararam a arquitetura topológica de suas interações complexas ' microconnectome '9 . As observações macroscópicas do cérebro também permitem a respeito de um cérebro inteiro como uma organização de rede porque muitas regiões cerebrais são conectadas por múltiplos feixes de fibra. A incorporação de microconnectomes no mapa global do cérebro ainda tem limitações claras dentro dos avanços tecnológicos atuais, e é por isso que esse protocolo de incorporação é tão importante. No entanto, há muitos desafios para o desenvolvimento do protocolo de incorporação. Por exemplo, a fim observar atividades de circuitos neuronal locais vivos em regiões puramente isoladas do cérebro, as fatias do cérebro precisam de ser produzidas para gravações in vitro. Além disso, as gravações de fatias cerebrais para gravações in vitro ainda são uma escolha importante por pelo menos duas razões. Em primeiro lugar, ainda não é fácil observar as atividades de muitos neurônios individuais vivos simultaneamente de regiões cerebrais mais profundas do que ~ 1,5 mm e em alta resolução temporal (< 1 ms). Em segundo lugar, quando esperamos conhecer a arquitetura interna de um circuito neuronal local, precisamos parar todas as entradas provenientes de regiões cerebrais externas para eliminar fatores de confundimento. A fim de identificar as direções e posições das fatias cerebrais produzidas, será ainda necessário integrar as posições espaciais dessas fatias cerebrais produzidas usando coordenadas. Há, entretanto, algumas maneiras sistemáticas e confiáveis de fazer fatias do cérebro em uma maneira organizada10,11. Aqui, um novo protocolo de coregistração é introduzido, usando a tecnologia de digitalização 3D para pesquisa neurocientífica, a fim de fornecer um protocolo integrativo. Este protocolo atua para coordenar micro e macroscales e incorporar microdados de matriz multieletrodo (mea)12,13 e dados de coloração em um espaço de ressonância magnética macroscópica através de superfícies de digitalização 3D de cérebros extraídos, bem como de cérebros não invasivamente gravados. Surpreendentemente, isso mostrou um erro de distância de apenas ~ 50 μm como o valor de modo do histograma. Como resultado, os valores de modo de distâncias mínimas entre duas superfícies entre a superfície de ressonância magnética e a superfície 3D digitalizada foram quase 50 μm para todos os seis camundongos, o que é um número adequado quando se verifica a semelhança entre os indivíduos. A largura típica da fatia tinha uma atividade de espiga gravada de cerca de 300 μm.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade de Kyoto.
1. animais (dia 1)
- Prepare camundongos fêmeas C57BL/6J (n = 6, com idades entre 3 − 5 semanas).
Nota: Este protocolo é aplicável a todas as espécies de roedores.
2. ajustes de MRI (dia 1)
- Põr o rato em uma caixa acrílica da anestesia coloc em uma esteira do calefator ajustada a 37 ° c usando um controlador da esteira do calefator.
- Anestesiar o rato com isoflurano a 2% em fluxo aéreo através da caixa a uma vazão de 1,4 L/min utilizando um sistema de anestesia, que é composto por um vaporizador isoflurano, medidor de fluxo de ar e compressor de ar.
- Após a indução da anestesia, coloque o mouse em um berço compatível com RM na posição prona. Verifique se a anestesia é suficiente, cortando um dedo do mouse com pinças para ver se ele não sente dor.
- Fixe a cabeça do rato com a barra de dentes e a máscara protectora equipada com o suporte. Em seguida, manter a anestesia com 1% − 1,5% de isoflurano no ar a 1,4 L/min através da máscara facial.
- Insira uma sonda de temperatura de termistor no reto do mouse e coloque um sensor de respiração sensível à pressão na parte de trás do mouse.
- Transfira o berço para o furo de um ímã de ressonância magnética. Ajuste a concentração de isoflurano para cerca de 1% − 1,5% para garantir uma profundidade de anestesia estável e reprodutível. Monitore se a temperatura corporal é controlada entre 33 − 35 ° c e a taxa de respiração entre 0,5 − 1,3 Hz durante todo o período de experimentos de RM, usando um sistema de monitoramento (tabela de materiais) para os parâmetros fisiológicos de pequenos animais com software dedicado (tabela de materiais).
- Usando o valor medido da temperatura rectal, regule a temperatura de corpo controlando a temperatura do ar morno fornecido no furo do ímã de um sistema do calefator equipado no sistema de monitoração.
3. aquisições de RM (dia 1)
-
Preparações para a alta resolução 3D T2-weighted MRI scan
- Adquira três imagens de ressonância magnética (RM) em três planos ortogonais (axial, coronal e sagital) para verificar a posição do mouse.
- Referindo-se a essas imagens, ajuste a posição do mouse movendo o berço para que o centro do cérebro do mouse é posicionado no centro do ressonador, bem como no centro das bobinas de gradiente em direção axial.
- Ajuste o sistema de ressonância magnética ajustando o ressonador, regulando a homogeneidade estática do campo magnético (shimming) e a frequência básica, e calibrando a potência de radiofrequência (RF).
- Adquira imagens 2D ponderadas em T2 de baixa resolução (T2W) com orientações coronal e sagital. Com base nessas imagens, determine o campo de visão (FOV) para uma varredura 3D T2W MRI de alta resolução.
- Execute a shimming localizada usando um algoritmo de correção automática FASTMAP. Para o protocolo FASTMAP, selecione uma região retangular que cubra todo o cérebro. Após a conclusão do shimming localizado, confirme a inhomogeneidade do campo de B0 dentro da região do cérebro por um espectro localizado de 1H usando a espectroscopia ponto-resolvida (imprensa).
- Adquira imagens 3D T2W de baixa resolução para garantir que as configurações de digitalização para 3D T2W MRI de alta resolução sejam apropriadas verificando a posição apropriada do FOV, a ausência de artefatos envolvente (aliasing) e a eficiente supressão de sinais de gordura.
-
Sequência de impulsos de imagem
- Após as preparações descritas acima, adquira imagens 3D T2W de alta resolução do cérebro inteiro do mouse, usando uma rápida aquisição com a sequência de realce de relaxamento (RARE).
Nota: Neste artigo, os experimentos de RM foram conduzidos em um furo horizontal de 7 T, 210 mm, scanner pré-clínico, equipado com um sistema de gradiente de 440 mT/m no tempo de rampa de 100 μs. Um ressonador do volume da quadratura com um diâmetro interno de 35 milímetros foi usado para a excitação do RF e A recepção do sinal. Os dados de MRI foram adquiridos com um software dedicado da operação. Os parâmetros de aquisição da sequência de pulsos 3D RARE utilizados neste estudo estão resumidos na tabela 1.
- Após as preparações descritas acima, adquira imagens 3D T2W de alta resolução do cérebro inteiro do mouse, usando uma rápida aquisição com a sequência de realce de relaxamento (RARE).
4. preparação de soluções experimentais (dia 2)
- Prepare 500 mL de uma solução de corte gelada (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2po4, 7 mm MgCl2, 15 mm glicose, 25 mM NaHCO3, 0,5 mm CAcl2, 11,6 mm ascorbato de sódio, 3,1 mm piruvato de sódio, e 100 mm cloreto de colina, borbulhou com 95% O2 e 5% co2). Ajuste o pH a 7.3 − 7.4.
- Prepare 1 L do líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2po4, 1 mm MgCl2, 15 mm glicose, 25 mM NaHCO3e 2 mM CAcl2, BORBULHOU com 95% O2 e 5% co2). Ajuste o pH para 7.3 – 7.4.
5. preparação do equipamento (dia 2)
- Prepare uma 6,6 cm2 quadrado, 0,5 cm de espessura ímã "anel" e, primeiro, coloque a fita preta e, em segundo lugar, a fita cirúrgica no anel (Figura 1C-2). Note-se que este material é nomeado um cérebro-bloco base (BBB), e mantê-lo frio em blocos de gelo.
Nota: Mais tarde, as fitas serão anexadas à estação de fatiamento com blocos cerebrais para o vibratome. O anel quadrado é usado como a base inferior do BBB para satisfazer duas finalidades, a saber migrar blocos do cérebro lisamente da estação da varredura 3D a um do e medir exatamente as alturas dos blocos do cérebro na etapa da exploração. - Configure o BBB com uma mesa giratória automática. Ligue o scanner e a mesa giratória. Inicie o software de processamento de imagem.
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Precedendo todos os experimentos, realize calibrações das câmeras e a plataforma giratória conectada de uma projeção de luz estruturada e um scanner 3D tipo desktop.
- Ligue o projetor central, as duas câmeras e a plataforma giratória. Em seguida, abra o software. No software, clique em configuração óptica e selecione a área de imagem como 100 x 80 e os números de grade como 100 x 100. Em seguida, a calibração da câmera começa de acordo com as quatro etapas a seguir.
- Para a configuração do projetor, coloque a folha de calibração na mesa e colocar a placa de calibração na folha de calibração para ajustar o ponto de fixação da área de medição para o centro da folha e a orientação para a frente. Ajuste a distância entre o projetor e a placa para cerca de 200 mm. Solte os parafusos que fixam os dois botões e gire os botões para ajustar a sensibilidade à luz e o foco das duas câmeras. Em seguida, clique em seta para ir para a próxima etapa.
- Para orientar as câmeras, solte os parafusos que fixam as duas câmeras e mova as posições e as rotações para se sobrepor à linha central na placa de calibração, na linha vertical e na Cruz amarela projetada do projetor. Corrija as câmeras e clique em seta novamente. Em seguida, a tela se tornará escura.
- Para focar as câmeras, depois de afrouxar os parafusos de fixação dos botões, aumente a sensibilidade à luz e sintonize o foco novamente. Em seguida, clique em seta para ir para a próxima etapa.
- Para o valor de F e o grau de exposição (da câmera), ajuste a sensibilidade de luz novamente para apenas abaixo onde a região vermelha desaparece. Em seguida, clique em seta novamente e clique em início de calibraçãoe escolha Sim se perguntado você terminou a configuração óptica?
- Clique em inicializar a calibraçãoe verifique se os valores de pixel são normalizados entre 0 – 255. Em seguida, clique em continuar.
- Seguindo as posições sugeridas, registre imagens de nove ângulos relativos diferentes do varredor e da placa da calibração, e termine-o após ter confirmado o processo da calibração, e, finalmente, clique a actualização da calibração.
- Troque a placa de calibração para a mesa giratória e clique na calibração da mesa giratória.
Nota: Agora, todas as calibrações estão terminadas.
- Ligue o projetor central, as duas câmeras e a plataforma giratória. Em seguida, abra o software. No software, clique em configuração óptica e selecione a área de imagem como 100 x 80 e os números de grade como 100 x 100. Em seguida, a calibração da câmera começa de acordo com as quatro etapas a seguir.
6. digitalização de superfície cerebral, fatiamento e gravação MEA (dia 2)
- Anestesiar um rato com 1% − 1,5% de isoflurano e decapitar o rato. Use um bisturi para abrir a pele e expor o crânio.
- Corte o couro cabeludo do rato anestesiado ao longo da sutura sagital usando uma faca cirúrgica, e corte o crânio em direções diagonais do ponto lambda para um ponto um pouco na frente da Bregma usando tesouras cirúrgicas. Em seguida, retire suavemente o crânio do cérebro usando pinças curvas.
- Use uma espátula para levantar o cérebro e transferi-lo para uma placa de Petri (100 mm x 20 mm) com solução de corte gelada (preparada na etapa 4,1). Fluxo de ar contendo 95% O2 e 5% co2 de uma bomba de gás externa com uma velocidade de rotação controlada da bomba (~ 4,0 rpm) para gerar pequenas bolhas na solução de corte de gelo-frio (Figura 1a).
- Após 1 – 2 min, coloque o cérebro em um pano de microfibra cuja superfície é levemente coberta por uma peneira de farinha, e limpe o fluido da superfície do cérebro, usando suavemente o pano de microfibra (Figura 1b).
- Põr o cérebro com seu aspecto dorsal acima no carrinho da amostra no BBB, e põr também o BBB no centro do Turntable automático.
- Escurecer a sala durante a digitalização 3D e realizar uma digitalização 3D na plataforma giratória. Para testar se a digitalização 3D funciona bem, clique em digitalização 3D selecionando o ângulo entre dois tiros como 22,5, o ângulo inicial como 0 e o ângulo final como 360 (Figura 1C-1).
- Mova o cérebro para uma placa de Petri, e Borbulhe o cérebro na solução de corte por aproximadamente 10 s.
- Corte o cérebro em dois blocos no meio do plano coronal usando uma faca cirúrgica, e mova os dois blocos cerebrais suavemente para a superfície plana usando uma espátula cirúrgica.
- Anexar os blocos cerebrais do BBB usando cola instantânea, e suavemente e cuidadosamente Limpe o fluido da superfície do cérebro dentro de 1-2 min, usando um pano de microfibra novamente. Em seguida, realize uma digitalização 3D novamente (Figura 1C-2).
- Anexar a fita preta cobrindo o centro do BBB para o centro do estágio de corte para um do (Figura 1D).
- Derrame a solução do corte no estágio de corte e ajuste o estágio de corte no vibratome. Ajuste a velocidade de corte e a amplitude. Faça 2 – 5 fatias coronais (300 μm de espessura) dos dois blocos cerebrais. Mantenha a solução na fase de corte borbulhando se possível (Figura 1e).
- Prenda uma lâmina ao suporte da lâmina do do e otimize a velocidade de corte, a frequência e a amplitude de vibração do sistema, definindo-as como 12,7 mm/min para a velocidade, 87 – 88 Hz para a frequência e 0,8 – 1,0 mm para a largura do balanço. Quando o corte cuidadoso for necessário, diminua a velocidade para o nível 2 – 3.
- Ao cortar as fatias cerebrais, registre a coordenada cortada no formato, incluindo a coordenada anterior-posterior, hemisfério e outras condições (Figura 2C).
- Transfira delicadamente as fatias do cérebro a um béquer enchido com o pré-aquecido (~ 34 ° c) ACSF usando uma pipeta plástica grossa, e incubar-os no copo em ~ 34 ° c para ~ 1 h. Durante este tempo, realize uma varredura 3D dos restantes blocos cerebrais na fase de corte (Figura 1C-2).
- Defina um chip MEA em uma unidade de gravação. Conecte o chip a uma bomba peristáltica usando dois tubos. Use um tubo para guiar o mesmo ACSF na microplaqueta de MEA e no outro tubo para guiar ACSF fora do chip MEA.
- Prenda duas agulhas (0,60 mm x 19 mm), conectadas nas pontas dos dois tubos, até o topo da parede do chip MEA, e fixar suas posições com suas pontas seguindo a parede interna do chip MEA. Ajuste a taxa de fluxo do ACSF a 4,1 RPM.
- Após 1 h passou, mova uma fatia na microplaqueta usando uma pipeta plástica grossa, e ajuste a posição usando uma escova macia. Em seguida, inicie o processo de gravação de atividades neuronais (Figura 2-d).
7. imunohistoquímica coloração (dias 3 e 4)
- Após a gravação do MEA ser concluída, transfira as fatias para 1,5 mL de tubos preenchidos com paraformaldeído a 4% (PFA) em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Incubar-os durante a noite a 4 ° c. Em seguida, retire a solução de PFA de 4% e lave as fatias 3x com PBS durante 5 min no total.
Nota: Se necessário, incorporar as fatias em 20% gelatina/PBS e ressecção da fatia para torná-lo mais fino do que 50 μm, usando o vibratome. - Prepare a solução de recuperação do antígeno (10 mM de citrato de sódio, pH 6,0). Retire a PBS da última lavagem e adicione a solução de recuperação do antígeno.
- Ferva a água em uma panela térmica elétrica e incubar os tubos com as fatias de 20 min em ~ 95 – 98 ° c no pote, seguido de resfriamento natural.
- Prepare 50 mm de soro fisiológico com tampão Tris e adicione 1% na bissulfito (1% na solução de bissulfito-Tris). Ajuste o pH para 7,5. Em seguida, lave as fatias com 1% na solução de bisulfite-Tris por 5 min à temperatura ambiente (~ 20 – 25 ° c).
- Prepare a solução de bloqueio adicionando 4% de soro de cabra normal e 0,5% de etoxilato de Octilfenol à solução de 1% na bisulfite-Tris.
- Retire a solução de 1% na bisulfite-Tris dos tubos com as fatias e adicione a solução de bloqueio. Incubar por 2 h à temperatura ambiente.
- Prepare a solução de anticorpos primários adicionando 1% de soro de cabra normal e 0,5% Triton X-100 à solução de 1% na bisulfite-Tris e diluindo anticorpos primários. Use as seguintes concentrações de anticorpos primários: 1:800 de mouse anti-GAD67 e 1:500 de coelho anti-NeuN.
- Retire a solução de 1% na bisulfite-Tris dos tubos com as fatias e adicione a solução de anticorpo primário. Incubar-lo durante a noite a 4 ° c.
- Prepare 50 mM de solução salina tampão Tris e adicione 8,5 g/L de NaCl (Tris-NaCl Solution). Titrate o pH a 7,5. Em seguida, lave as fatias 3x com a solução Tris-NaCl (~ 20 – 25 ° c) durante 5 min no total.
- Prepare a segunda solução de anticorpos adicionando 3% de soro de cabra normal e 0,3% Triton X-100 à solução Tris-NaCl e diluindo anticorpos secundários. Use as seguintes concentrações de anticorpos secundários: 1:500 de cabra anti-mouse e 1:500 de cabra anti-coelho.
- Remova a solução de tris-NaCl dos tubos com as fatias e adicione a solução secundária do anticorpo. Incubar por 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, lave as fatias 3x com a solução Tris-NaCl por 5 min no total.
- Coloque as fatias no slide usando um pincel pequeno e aplique suportes de montagem e uma lamínula. Examine as lâminas com um microscópio confocal. Tirar imagens da superfície de uma fatia (Figura 2e).
8. processamento de dados de MRI para extrair volumes corticais
- Instale o software livre FSL (https://FSL.fmrib.Ox.AC.uk/FSL/fslwiki/FslInstallation). Prepare as imagens de ressonância magnética adquiridas na seção 3.
- Altere o formato de imagem usando o comando fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ . Expanda a imagem do cérebro para torná-lo tão grande quanto um cérebro humano usando o comando fslcreatehd e, se necessário, alterar a orientação usando fslorient com a opção -setqformcode 1. Depois disso, recupere o formato de arquivo original usando fslchfiletype NIFTI_GZ. O comando exato é o seguinte.
fslchfiletype NFTI_PAIR [imagem de entrada]. Nii. gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 0 4 [imagem de entrada]. HDR. gz
fslorient – setqformmcode 1 [imagem de entrada]. HDR. gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [imagem de entrada] - Digite FSL para abrir o software FSL. Extraia cérebros usando o comando Bet a partir da interface gráfica do usuário (GUI), mas não descasque muito. Em seguida, controle os limiares de intensidade fracionária,... e as coordenadas do centro da esfera inicial da superfície cerebral com cuidado. Os valores ideais são diferentes para dados individuais.
- Redimensione a imagem cerebral para o tamanho original do cérebro do mouse, usando o mesmo procedimento que na etapa 8,2. O comando exato é como segue:
fslchfiletype NFTI_PAIR [imagem de entrada]. Nii. gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0, 8 0 0 0 0 4 [imagem de entrada]. HDR. gz
fslorient – setqformmcode 1 [imagem de entrada]. HDR. gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [imagem de entrada] - Coregistrate todas as imagens do cérebro usando o comando Flirt , e produza uma imagem média do cérebro usando a opção -Add e a opção -div do comando fslmaths .
fslmaths [imagem do cérebro 1] – Adicionar... – adicionar [imagem do cérebro N] – div N [nome da imagem média] – odt float - Faça o limpador de cérebro em média usando a opção -thr do comando fslmaths . Em seguida, selecione um valor de limite ideal adaptável a casos individuais.
fslmaths [nome da imagem média] – thr [valor thr, por exemplo, 5000] [imagem média thresholded] - Por fim, remodelar a imagem cerebral média na coordenada de um indivíduo usando o comando Flirt novamente. Em seguida, prepare corticais extraídos bastante limpos (Figura 2a).
Nota: Infelizmente, o bulbo e o cerebelo olfactory não serão perfeitos na superfície reconstruída do cérebro dos volumes de MRI por causa das limitações essenciais do software de FSL ao Peal todas as partes do cérebro que incluem o bulbo olfactory e o cerebelo.
9. processamento da imagem de MRI às superfícies corticais da listra
- Baixe outro software livre, slicer 3D (https://download.slicer.org/).
- Abra as imagens de MR dos cérebros extraídos (clique em arquivo e selecione Adicionar dados) produzidos de acordo com a seção 8, usando o volume de renderização e módulos editor em 3D slicer.
- Mude o modo do Editor para a renderização de volumee clique em um botão de destino para fazer a imagem do cérebro chegar ao centro da tela.
- Selecione o modo Mr-T2-Brain e ajuste o limiar movendo a barra de deslocamento . Em seguida, mova para trás da renderização de volume para o Editor e clique no botão efeito de limite .
- Aplique o Label 41. Córtex cerebral e salvar os dados de superfície do cérebro como um arquivo . STL . Em seguida, altere o formato de ficheiro de . VTK para . STLe guarde o ficheiro, verificando o formulário.
10. pré-processamento para dados de digitalização 3D
-
Realize uma coregistração automática entre 8 ou 16 imagens tiradas de 8 ou 16 ângulos diferentes dentro de uma sequência de uma varredura para corrigir pequenos desencontros entre eles, clicando em registro global incluído na opção alinhamento e integrá-los. Repita as varreduras de diferentes ângulos para obter a superfície do cérebro inteiro (Figura 2b).
- Se a integração entre imagens digitalizadas de diferentes ângulos não foi bem-sucedida, clique em alinhamento manual e selecione um par de uma imagem fixa e uma imagem em movimento.
- Clique em Iniciar para iniciar o alinhamento manual das imagens selecionando três ou quatro pontos comuns em imagens diferentes. Em seguida, clique em OK. O algoritmo de otimização é o algoritmo de ponto mais próximo iterativo (ICP)10. Não inclui uma deformação não linear.
- Faça uma malha de todas as imagens alinhadas (ou seja, dos conjuntos de dados de pontos) selecionando todas as imagens e clicando no botão de geração de malha . Em seguida, selecione a opção pequeno objeto artístico para obter a malha como a resolução mais alta. Em seguida, guarde a imagem como. STL binário ou no formato ASCII.
11. coregistração da superfície de ressonância magnética e da superfície de digitalização 3D
-
Abra a superfície de ressonância magnética e combine-a com a superfície de digitalização 3D usando o software de processamento de superfície. Em seguida, execute um processo de alinhamento manual usando o mesmo procedimento descrito nas etapas 10.1.1 e 10.1.2. Em seguida, guarde estas imagens de superfície coregistered novamente (Figura 2a, b).
- Se necessário, limpe os dados de superfície individuais, por exemplo, apagando pequenos ruídos em torno da região do cérebro, especialmente no caso dos dados de RM, e preenchendo buracos se existirem, especialmente no caso dos dados de digitalização 3D.
- Por fim, abra os dados de superfície com um software de análise de dados, por exemplo, MATLAB, e realize e avalie os histogramas das distâncias mínimas entre as duas superfícies.
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Representative Results
Foram avaliadas as distâncias entre as superfícies corticais, produzidas pela remoção do volume de RM e superfícies obtidas a partir de varreduras 3D de cérebros extraídos. Os valores de modo do histograma das distâncias são apenas 55 μm (Figura 3a). Adicionalmente, ao acumular o histograma a partir do ponto em que a distância é igual a zero, o valor acumulado atinge 90% do total de números de amostra em ~ 300 μm (Figura 3B). O histograma final das distâncias entre duas superfícies mostrou um pico típico em torno de 50 μm. Se interpretamos esse valor a partir de um ponto de vista macroscópico, curiosamente, a acurácia, o valor de modo ~ 50 μm, corresponde à limitação geométrica, que era esperada a partir do tamanho do VOXEL de MRIs (Figura 3a), ou seja, 100 μm. Este ponto sugere indiretamente que o algoritmo de sobreposição, ICP, entre o MRI e a varredura 3D funcionou soberbamente bem e que os níveis de ruído do MRI e da varredura 3D foram suprimidos como o baixo valor (Figura 2a, b)14.
Figura 1: o fluxo experimental. (a) primeiro, depois de extrair um cérebro de um rato, o cérebro foi deixado cair em uma solução de corte borbulhou. (b) depois de limpar a solução de corte com uma toalha macia e altamente absorvente, (c) o cérebro foi escaneado em uma mesa giratória. (d) em fazer fatias (etapa 8 do processo), os blocos do cérebro foram digitalizados em um BBB porque é fácil mover blocos do cérebro à base para um do (etapas 7 e 8 do processo). (e) depois de obter fatias suficientes para a gravação de atividades elétricas ou para manchar as distribuições celulares e outros métodos, os blocos cerebrais restantes foram digitalizados novamente (etapa 10 do processo). A espessura dos blocos cerebrais restantes forneceu informações de suporte importantes adicionais de onde as fatias foram tiradas. (f) finalmente, registramos as atividades funcionais ou arquiteturas estruturais usando mea ou métodos de coloração e outros métodos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o pipeline de processamento de dados. (a) um exemplo de uma superfície cortical produzida pelos corticais de descascamento dos volumes de MRI como explicado nas seções 8 e 9 do protocolo. (b) um exemplo de uma superfície cortical diretamente digitalizada por um sistema de scanner 3D. (c) um exemplo de um memorando usado para resumir a região do cérebro de onde as fatias individuais do cérebro foram extraídas. (d) um exemplo de quando a fatia cortical está em um prato de eletrodo. (e) um exemplo de uma fatia cortical cerebral manchada por Neun (vermelho) e GAD67 (verde). Todas as informações agora vão ser reunidas em um banco de dados unificado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: precisão de sobreposição entre MRIs e varreduras 3D. (a) histogramas de distâncias entre superfícies extraídas por peeling a partir de volumes de RM. As superfícies vieram de gravações de digitalização 3D. O gráfico de barras principal é o histograma de média para todos os indivíduos, e outras linhas coloridas são resultados para camundongos individuais (N = 6, com idades entre 21 e 40 dias, todos eram camundongos femininos). Uma tendência geral, estável para todos os indivíduos, poderia ser encontrada. (b) o valor acumulado do histograma é mostrado como um gráfico de barras. A percentagem acumulada atingiu 90% em ~ 300 μm (linhas pontilhadas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagem conceitualizada de duas escalas de informação integradas em uma interface gráfica do usuário (GUI). A anatomia macroscópica do cérebro e a informação microscópica do circuito neuronal foram integradas em um sistema representado por uma correia fotorreceptora. O alto grau de acurácia, mostrado na Figura 3, permitiu-nos integrar essas duas escalas de forma realista. A imagem macroscópica aqui apresentada é de um Atlas evolutivo do cérebro15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetros | Valores |
| Tempo de repetição (TR) | 2.000 MS |
| Tempo de eco (TE) | 9 MS |
| TE eficaz: | 45 MS |
| Fator raro | 16 |
| Tamanho da matriz de aquisição | 196 x 144 x 144 |
| Campo de visão (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 mm3 |
| Largura de banda de aquisição | 75 kHz |
| Orientação | Axial (orientação coronal na configuração do scanner) |
| Paramímetros de supressão de gordura | |
| freqüência gorda | 2,6 ms-Gaussian-shaped π/2 pulso com 1051 Hz largura de banda |
| gradiente de spoiler | |
| varreduras dummy | 2 vezes |
| Número de médias | 3 |
| Tempo de aquisição | 2 h 42 min |
Tabela 1: os parâmetros de aquisição da sequência de pulsos 3D RARE utilizados neste estudo.
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Discussion
Nós desenvolvemos um protocolo novo chamado o protocolo 3D-NEO para colmatar escalas espaciais macroscópicas e microscópicas sobrepondo duas superfícies do cérebro mais exatamente do que antes. Originalmente, havia dois desafios em criar este protocolo que fêz possível a sobreposição exata de duas imagens de superfície do cérebro e de gravar atividades neuronal saudáveis dos organismos vivos. Primeiramente, era necessário limpar eficazmente a solução do corte que circunda o cérebro extraído após a extração dele do crânio sem ferir o organismo do cérebro (etapa 6,2 do protocolo). Em segundo lugar, uma vez que a primeira e terceira condições de secura e tempo de atraso são potenciais fatores negativos para o organismo vivo, terminando todas as etapas do processo de digitalização da extração cerebral para as preparações de fatia dentro de 10 – 15 min também foi necessário para manter os neurônios ativos.
A capacidade de registrar com sucesso as atividades cerebrais usando este protocolo tornou possível a coordenação não só de organizações estruturais, mas também de atividades funcionais no mapa do cérebro inteiro. Outro aspecto positivo deste protocolo é que desde que um BBB foi preparado, a calibração do scanner para a base do vibratoma tornou-se muito mais suave.
Como mencionado nos resultados representativos, o histograma de distâncias entre duas superfícies mostrou um pico em torno de 50 μm. Embora tenhamos realizado o processo de sobreposição, como se por ver a partir do ponto de vista macroscópico. Se interpretamos o resultado do ponto de vista microscópico, o 50 μm é uma escala espacial comparável na distribuição de neurônios, uma vez que as probabilidades de conectividade entre pares de neurônios corticais se deterioram dentro de ~ 100 μm16,17, mesmo dentro de vários milímetros18. Praticamente, os estudos de imagiologia de MEA ou cálcio costumam usar fatias grossas de 300 – 400 μm. Assim, a técnica apresentada aqui fornecerá a evidência objetiva forte se as fatias são encaixadas corretamente em mapas originais do todo-cérebro. Depois que a sobreposição é conseguida exatamente, a exatidão adicional será adquirida puramente da informação local observada um microscópio. Portanto, ao realizar um processo de otimização em duas etapas consistindo em passos de otimização globais e locais, será possível alcançar uma resolução espacial igualando semi-automaticamente ao tamanho típico de um neurônio no futuro.
Este protocolo de integração precisa fornece tecnologia básica para gerar vários Atlas cerebrais18,20,21 e até mesmo para estudar mais em profundidade a RM de outros primatas22,23 e humanos cérebros pós-morte (embora o cérebro humano tem sulcos, é possível obter um número suficiente de pontos de gravação de gyri). Agora, também estamos desenvolvendo uma interface visual para integrar muitas amostras de dados gravados em uma coordenada espacial comum. Uma figura de imagem como esta é mostrada na Figura 4. Nos casos de cérebros de mamíferos, a integração entre escalas quantitativamente diferentes também fará novos avanços qualitativamente na compreensão dos Estados da doença e na avaliação dos efeitos da droga. Geralmente, isso será difícil de aplicar a peixes, répteis e anfíbios, porque os pesquisadores vão achar que é difícil manter a forma do cérebro extraído fino estável à sua forma pré-extraída, e imagens de ressonância magnética de seus cérebros menores também será relativamente mais noisier.
O protocolo 3D-NEO foi introduzido por esta pesquisa em um campo de pesquisa neurocientific ou de célula biológica, demonstrando com sucesso a exatidão elevada na ponte entre a anatomia macroscópica e a distribuição neuronal microscópica, incluindo o arquiteturas topológicas de macro e microconnectomes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
M.S. é grato pelo apoio de todos os funcionários do curso de engenharia de informação médica na Graduate School of Medicine e faculdade de medicina, e quer agradecer ao Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto, e Doris Zakian por sua útil Comentários. Este estudo foi apoiado por um Grant-in-Aid para a pesquisa exploratória desafiante e pela iniciativa principal para o programa excelente dos investigadores novos (líder) a M.S. de MEXT (o Ministry da instrução, da cultura, do esporte, da ciência, e da tecnologia). As experiências de MRI neste trabalho foram executadas na divisão para o animal pequeno MRI, centro médico da sustentação da pesquisa, escola graduada da medicina, Universidade de Kyoto, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
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