Summary
Este artículo presenta un protocolo experimental que utiliza la tecnología de escaneo 3D que une dos escalas espaciales: la escala espacial macroscópica de la anatomía de todo el cerebro fotográfica a >100 m y la escala espacial microscópica de las distribuciones neuronales utilizando inmunohistoquímica y un sistema de matriz de multielectrodos y otros métodos (10 m).
Abstract
El cerebro humano, al ser un sistema multiescala, tiene señales eléctricas macroscópicas, que fluyen globalmente a lo largo de gruesos haces de fibra de materia blanca, y picos neuronales microscópicos, que se propagan a lo largo de axónes y dendritas. Ambas escalas complementan diferentes aspectos de las funciones cognitivas y conductuales humanas. A nivel macroscópico, la RMN ha sido la tecnología de imagen estándar actual, en la quela resolución espacial más pequeña, el tamaño de los vóxeles, es de 0,1-1 mm 3. Además, a nivel microscópico, estudios fisiológicos previos eran conscientes de las arquitecturas neuronales no uniformes dentro de estos vóxeles. Este estudio desarrolla una poderosa manera de integrar con precisión los datos microscópicos en un mapa macroscópico mediante la interconexión de la investigación científica biológica con los avances tecnológicos en la tecnología de escaneo 3D. Dado que la tecnología de escaneo 3D se ha utilizado principalmente para la ingeniería y el diseño industrial hasta ahora, se reutiliza por primera vez para incrustar microconnectomes en todo el cerebro mientras se preserva el pico natural en las células cerebrales vivas. Para lograr este propósito, primero, construimos un protocolo de escaneo para obtener imágenes 3D precisas de bioorganismos vivos inherentemente desafiantes a la imagen debido a superficies húmedas y reflectantes. En segundo lugar, nos entrenamos para mantener la velocidad para prevenir la degradación del tejido cerebral vivo, que es un factor clave en la retención de mejores condiciones y el registro de picos neuronales más naturales de las neuronas activas en el tejido cerebral. Dos imágenes de superficie cortical, extraídas independientemente de dos módulos de imágenes diferentes, a saber, imágenes de rmny y de superficie del escáner 3D, muestran sorprendentemente un error de distancia de sólo 50 m como valor de modo del histograma. Esta precisión es comparable en escala a la resolución microscópica de distancias intercelulares; también, es estable entre diferentes ratones individuales. Este nuevo protocolo, el nuevo protocolo 3D que incorpora la superposición (3D-NEO), une los niveles macroscópicos y microscópicos derivados de este protocolo integrador y acelera los nuevos hallazgos científicos para estudiar arquitecturas de conectividad integrales (es decir, microconecto).
Introduction
Las arquitecturas multiescala no uniformes en variasorganizaciones físicas y biológicas se encuentran comúnmente 1,2. El cerebro es también una organización de red muy no uniforme y multiescala3,4. Varias funciones cognitivas se codifican en tales organizaciones de la red, manteniendo cambios temporales de patrones de picos eléctricos de poblaciones neuronales en resoluciones temporales de submilisegundos. Históricamente, las complejas redes entre las neuronas se observaron estructuralmente en detalle utilizando las técnicas de tinción de Santiago Ramón y Cajal de hace más de 150 años5. Para observar los comportamientos grupales de las neuronas activas, los investigadores han desarrollado varias tecnologías de grabación6,7,8, y los recientes desarrollos significativos de estas tecnologías nos han permitido registrar actividades eléctricas de un gran número de neuronas simultáneamente. Además, a partir de estas actividades funcionales, los científicos han logrado reconstruir redes de interacciones causales entre un gran número de neuronas y han declarado la arquitectura topológica de sus complejas interacciones 'microconnectome'9 . Observaciones macroscópicas del cerebro también permiten considerar todo un cerebro como una organización de red porque muchas regiones cerebrales están conectadas por múltiples paquetes de fibra. La incorporación de microconectos en el mapa cerebral global todavía tiene limitaciones claras dentro de los avances tecnológicos actuales, por lo que este protocolo de incrustación es tan importante. Sin embargo, hay muchos desafíos para el desarrollo del protocolo de inserción. Por ejemplo, con el fin de observar las actividades de los circuitos neuronales locales vivos en regiones cerebrales puramente aisladas, las rebanadas de cerebro deben ser producidas para las grabaciones in vitro. Además, las grabaciones de rebanadas cerebrales para grabaciones in vitro siguen siendo una opción importante por al menos dos razones. En primer lugar, todavía no es fácil observar las actividades de muchas neuronas individuales vivas simultáneamente desde regiones cerebrales más profundas que 1,5 mm y en alta resolución temporal (<1 ms). En segundo lugar, cuando esperamos conocer la arquitectura interna de un circuito neuronal local, necesitamos detener todas las entradas procedentes de regiones cerebrales externas para eliminar los factores de confunción. Con el fin de identificar las direcciones y posiciones de las rebanadas cerebrales producidas, será necesario integrar las posiciones espaciales de estas rebanadas cerebrales producidas utilizando coordenadas. Hay, sin embargo, algunas formas sistemáticas y confiables de hacer rebanadas cerebrales de una manera organizada10,11. Aquí, se introduce un nuevo protocolo de registro de coregistro, utilizando tecnología de escaneo 3D para la investigación neurocientífica con el fin de proporcionar un protocolo integrador. Este protocolo actúa para coordinar micro y macroescalas e incrustar microdatos de matriz de multielectrodos (MEA)12,13 y tinción de datos en un espacio de RMN macroscópico a través de superficies de exploración 3D de cerebros extraídos, así como de cerebros no registrados de manera no invasiva. Sorprendentemente, esto mostró un error de distancia de sólo 50 m como el valor de modo del histograma. Como resultado, los valores de modo de distancias mínimas entre dos superficies entre la superficie de RMN y la superficie 3D escaneada eran de casi 50 m para los seis ratones, lo que es un número adecuado al comprobar la uniformidad entre los individuos. El ancho típico de la rebanada tenía una actividad de pico registrada de alrededor de 300 m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos experimentales descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Kioto.
1. Animales (Día 1)
- Preparar ratones hembra C57BL/6J (n.o 6, de 3 a 5 semanas de edad).
NOTA: Este protocolo es aplicable a todas las especies de roedores.
2. Ajustes de RMN (Día 1)
- Coloque el ratón en una caja de anestesia acrílica colocada en una alfombra de calentador ajustada a 37 oC utilizando un controlador de estera de calentador.
- Anestetizar el ratón con 2% de isoflurano en el aire que fluye a través de la caja a un caudal de 1,4 L/min utilizando un sistema de anestesia, que se compone de un vaporizador de isoflurano, un medidor de flujo de aire y un compresor de aire.
- Después de la inducción de la anestesia, coloque el ratón en una cuna compatible con RMN en la posición propensa. Compruebe si la anestesia es suficiente cortando un dedo del ratón con pinzas para ver si no siente dolor.
- Fije la cabeza del ratón con la barra de dientes y la máscara facial equipada con la base. A continuación, mantener la anestesia con 1% -1,5% de isoflurano en el aire a 1,4 L/min a través de la mascarilla facial.
- Inserte una sonda de temperatura del termistor en el recto del ratón y coloque un sensor de respiración sensible a la presión en la parte posterior del ratón.
- Transfiera la base al orificio de un imán de RMN. Ajustar la concentración de isoflurano a alrededor de 1% a 1,5% para asegurar una profundidad estable y reproducible de la anestesia. Controlar si la temperatura corporal se controla entre 33 o 35 oC y la velocidad de respiración entre 0,5 x 1,3 Hz durante todo el período de experimentos de RMN, utilizando un sistema de monitoreo (Tablade Materiales)para los parámetros fisiológicos de animales pequeños con software dedicado (Tablade Materiales).
- Utilizando el valor medido de la temperatura rectal, regular la temperatura corporal controlando la temperatura del aire caliente suministrado en el orificio del imán desde un sistema de calentador equipado en el sistema de monitoreo.
3. Adquisiciones de RMN (Día 1)
-
Preparativos para la resonancia magnética 3D t2 de alta resolución
- Adquirir tres imágenes de resonancia magnética (RM) en tres planos ortogonales (axiales, coronales y sagitales) con el fin de comprobar la posición del ratón.
- Refiriéndose a estas imágenes, ajuste la posición del ratón moviendo la base para que el centro del cerebro del ratón se coloque en el centro del resonador, así como en el centro de las bobinas de gradiente en dirección axial.
- Ajuste el sistema de RMN ajustando el resonador, ajustando la homogeneidad del campo magnético estático (shimming) y la frecuencia básica, y calibrando la potencia de radiofrecuencia (RF).
- Adquiera imágenes 2D multislice t2 ponderadas (T2W) de baja resolución con orientaciones coronales y sagitales. Basándose en estas imágenes, determine el campo de visión (FOV) para un análisis de RMN 3D T2W de alta resolución.
- Realice shimming localizadoutilizando utilizando un algoritmo de shim automático FASTMAP. Para el protocolo FASTMAP, seleccione una región rectangular que cubra todo el cerebro. Después de la finalización del shimming localizado, confirme la inhomogeneidad del campo B0 dentro de la región cerebral mediante un espectro localizado de 1H mediante espectroscopía de puntos resueltos (PRESS).
- Adquiera imágenes 3D T2W de baja resolución para asegurarse de que los ajustes de escaneado para la RMN 3D T2W de alta resolución son apropiados comprobando la posición adecuada del FOV, la ausencia de artefactos envolventes (aliasing) y la supresión eficiente de señales de grasa.
-
Secuencia de pulsos de imágenes
- Después de los preparativos descritos anteriormente, adquirir imágenes 3D T2W de alta resolución de todo el cerebro del ratón, utilizando una rápida adquisición con la secuencia de mejora de relajación (RARE).
NOTA: En este artículo, se llevaron a cabo experimentos de RMN en un orificio horizontal de 7 T, 210 mm, escáner preclínico, equipado con un sistema de gradiente de 440 mT/m en el tiempo de rampa 100 s. Se utilizó un resonador de volumen de cuadratura con un diámetro interno de 35 mm para la excitación de RF y la recepción de señal. Los datos de RMN se adquirieron con un software de operación dedicado. Los parámetros de adquisición de la secuencia de pulsos 3D RARE utilizada en este estudio se resumen en el Cuadro1.
- Después de los preparativos descritos anteriormente, adquirir imágenes 3D T2W de alta resolución de todo el cerebro del ratón, utilizando una rápida adquisición con la secuencia de mejora de relajación (RARE).
4. Preparación de soluciones experimentales (Día 2)
- Preparar 500 ml de una solución de corte en frío (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 7 mM MgCl2, 15 mM de glucosa, 25 mM de NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 11,6 mM de ascorbato sódico, 3,1 mM de piruvato sódico y cloruro de colina de 100 mM, con 95% O2 y 5% CO2). Ajuste el pH a 7,3 x 7,4.
- Preparar 1 L del líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 15 mM de glucosa, 25 mM NaHCO3y 2 mM de CaCl2, burbujeante con 95% O2 y 5% CO2). Ajuste el pH a 7.3–7.4.
5. Preparación del equipo (Día 2)
- Preparar un imán de 6,6 cm2 cuadrados, 0,5 cm de espesor "anillo" y, en primer lugar, colocar cinta negra y, en segundo lugar, cinta quirúrgica en el anillo (Figura1c-2). Tenga en cuenta que este material se llama una base de bloqueo cerebral (BBB), y mantenerlo frío en bloques de hielo.
NOTA: Más tarde, las cintas se unirán a la estación de corte con bloques cerebrales para el vibratome. El anillo cuadrado se utiliza como la base inferior del BBB para satisfacer dos propósitos, a saber, migrar los bloques cerebrales suavemente desde la estación de escaneo 3D a un vibratome y medir con precisión las alturas de los bloques cerebrales en el paso de escaneo. - Configure el BBB con un tocadiscos automático. Encienda el escáner y el tocadiscos. Inicie el software de procesamiento de imágenes.
-
Antes de todos los experimentos, realice calibraciones de las cámaras y el tocadiscos conectado de una proyección de luz estructurada y un escáner 3D de tipo escritorio.
- Encienda el proyector central, las dos cámaras y el tocadiscos. A continuación, abra el software. En el software, haga clic la configuración óptica y seleccione el área de la imagen como 100 x 80 y los números de cuadrícula como 100 x 100. A continuación, la calibración de la cámara se inicia de acuerdo con los cuatro pasos siguientes.
- Para la configuración del proyector, coloque la hoja de calibración en el escritorio y coloque la placa de calibración en la hoja de calibración para ajustar el punto de fijación del área de medición al centro de la hoja y la orientación al frente. Ajuste la distancia entre el proyector y la placa a alrededor de 200 mm. Afloje los tornillos que fijan las dos perillas y gire las perillas para ajustar la sensibilidad a la luz y el enfoque de las dos cámaras. A continuación, haga clic en Flecha para ir al paso siguiente.
- Para orientar las cámaras, afloje los tornillos que fijan las dos cámaras y mueva las posiciones y las rotaciones para superponerse con la línea central en la placa de calibración, la línea vertical y la cruz amarilla proyectada desde el proyector. Corrija las cámaras y vuelva a hacer clic en Flecha. Entonces, la pantalla se oscurecerá.
- Para enfocar las cámaras, después de aflojar los tornillos de fijación de las perillas, aumente la sensibilidad a la luz y ajuste el enfoque de nuevo. A continuación, haga clic en Flecha para ir al paso siguiente.
- Para el valor F y el grado de exposición (de la cámara), ajuste la sensibilidad de la luz de nuevo justo por debajo de donde desaparece la región roja. A continuación, haga clic en Flecha de nuevo y, a continuación, haga clic en Inicio de calibracióny elija Sí si se le preguntó ¿Terminó la configuración óptica?
- Haga clic en Inicializar la calibracióny compruebe si los valores de píxel están normalizados entre 0 y 255. A continuación, haga clic en Continuar.
- Siguiendo las posiciones sugeridas, grabe imágenes de nueve ángulos relativos diferentes del escáner y la placa de calibración, y termine después de confirmar el proceso de calibración y, finalmente, haga clic en Actualizar de la calibración.
- Cambie la placa de calibración por el tocadiscos y haga clic en Calibración de plato giratorio.
NOTA: Ahora, todas las calibraciones han terminado.
- Encienda el proyector central, las dos cámaras y el tocadiscos. A continuación, abra el software. En el software, haga clic la configuración óptica y seleccione el área de la imagen como 100 x 80 y los números de cuadrícula como 100 x 100. A continuación, la calibración de la cámara se inicia de acuerdo con los cuatro pasos siguientes.
6. Escaneo de superficie cerebral, corte y grabación MEA (día 2)
- Anestetiza un ratón con 1% a 1,5% de isoflurano y decapita el ratón. Use un bisturí para abrir la piel y exponer el cráneo.
- Corta el cuero cabelludo del ratón anestesiado a lo largo de la sutura sagital usando un cuchillo quirúrgico, y corta el cráneo en direcciones diagonales desde el punto lambda hasta un punto un poco delante del bregma usando tijeras quirúrgicas. Luego, despegue suavemente el cráneo del cerebro usando pinzas curvas.
- Utilice una espátula para levantar el cerebro y transferirlo a una placa Petri (100 mm x 20 mm) con solución de corte en frío (preparada en el paso 4.1). Aire de flujo que contiene 95% O2 y 5% CO2 de una bomba de gas externa con una velocidad de rotación controlada de la bomba (4,0 rpm) para generar pequeñas burbujas en la solución de corte en frío (Figura1a).
- Después de 1-2 min, poner el cerebro en un paño de microfibra cuya superficie está ligeramente cubierta por un tamiz de harina, y limpiar el líquido de la superficie del cerebro, utilizando suavemente el paño de microfibra (Figura1b).
- Ponga el cerebro con su aspecto dorsal en el soporte de muestra en el BBB, y también coloque el BBB en el centro del plato giratorio automático.
- Oscurezca la habitación durante el escaneo 3D y realice un escaneo 3D en el tocadiscos. Para probar si el escaneo 3D funciona bien, haga clic en Escaneo 3D seleccionando el ángulo entre dos tomas como 22.5, el ángulo inicial como 0 y el ángulo final como 360 (Figura1c-1).
- Mover el cerebro a un plato de Petri, y burbuja el cerebro en la solución de corte durante aproximadamente 10 s.
- Corta el cerebro en dos bloques en el centro del plano coronal usando un cuchillo quirúrgico, y mueve los dos bloques cerebrales suavemente a la superficie plana usando una espátula quirúrgica.
- Fije los bloques cerebrales del BBB usando pegamento instantáneo, y limpie suave y cuidadosamente el líquido de la superficie del cerebro dentro de 1-2 min, usando un paño de microfibra de nuevo. A continuación, realice un análisis 3D de nuevo (Figura1c-2).
- Fije la cinta negra que cubre el centro del BBB al centro de la etapa de corte para un vibratome (Figura1d).
- Vierta la solución de corte en la etapa de corte y ajuste la etapa de corte en el vibratome. Ajuste la velocidad de corte y la amplitud. Hacer de 2 a 5 rodajas coronales (300 m de espesor) a partir de los dos bloques cerebrales. Mantenga la solución en la etapa de corte burbujeando si es posible (Figura1e).
- Fije una cuchilla al soporte de la hoja del vibratome y optimice la velocidad de corte, la frecuencia y la amplitud de vibración del sistema estableciéndolos como 12,7 mm/min para la velocidad, 87-88 Hz para la frecuencia y 0,8–1,0 mm para el ancho de oscilación. Cuando sea necesario un corte cuidadoso, reduzca la velocidad al nivel 2-3.
- Mientras corta las rebanadas cerebrales, registre la coordenada rebanada en el formato, incluida la coordenada anterior-posterior, el hemisferio y otras condiciones (Figura 2c).
- Transfiera suavemente las rodajas cerebrales a un vaso de precipitados lleno de ACSF precalentado (34 oC) con una pipeta de plástico gruesa, e incubarlas en el vaso de precipitados a 34 oC durante 1 h. Durante este tiempo, realice una exploración 3D de los bloqueos cerebrales restantes en la etapa de corte (Figura1c-2).
- Establezca un chip MEA en una unidad de grabación. Conecte el chip a una bomba peristáltica utilizando dos tubos. Utilice un tubo para guiar el mismo ACSF en el chip MEA y el otro tubo para guiar a ACSF fuera del chip MEA.
- Coloque dos agujas (0,60 mm x 19 mm), conectadas en las puntas de los dos tubos, en la parte superior de la pared del chip MEA, y fije sus posiciones con sus puntas siguiendo la pared interior del chip MEA. Ajuste el caudal del ACSF a 4,1 rpm.
- Después de 1 h ha pasado, mueva una rebanada en el chip usando una pipeta de plástico gruesa, y establezca la posición con un cepillo suave. A continuación, inicie el proceso de registro de las actividades neuronales (Figura2-d).
7. Mancha inmunohistoquímica (días 3 y 4)
- Una vez finalizada la grabación mea, transfiera las rodajas a tubos de 1,5 ml llenos de 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con búfer de fosfato (PBS). Incubarlos durante la noche a 4oC. A continuación, retire la solución de PFA al 4% y lave las rodajas 3 veces con PBS durante 5 minutos en total.
NOTA: Si es necesario, incruste las rodajas en un 20% de gelatina/PBS y resección la rebanada para hacerla más delgada que 50 m, utilizando el vibratomo. - Preparar la solución de recuperación de antígenos (10 mM de citrato de sodio, pH 6.0). Retire el PBS del último lavado y agregue la solución de recuperación de antígenos.
- Hervir el agua en una olla de termo eléctrico e incubar los tubos con las rodajas durante 20 minutos a 95-98 oC en la olla, seguido de enfriamiento natural.
- Prepare 50 mM Solución salina tris tamponada y agregue 1% de Na bisulfito (1% Solución de Na bisulfite-Tris). Ajuste el pH a 7,5. A continuación, lave las rodajas con una solución de Na bisulfite-Tris al 1% durante 5 minutos a temperatura ambiente (20–25 oC).
- Prepare la solución de bloqueo añadiendo un 4% de suero normal de cabra y un etoxilato de octilfenol al 1% de na bisulfito-Tris.
- Retire la solución de 1% Na bisulfite-Tris de los tubos con las rodajas y agregue la solución de bloqueo. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente.
- Preparar la solución primaria de anticuerpos añadiendo un 1% de suero normal de cabra y un 0,5% de Triton X-100 a la solución de 1% Na bisulfite-Tris y diluyendo anticuerpos primarios. Utilice las siguientes concentraciones de anticuerpos primarios: 1:800 de ratón anti-GAD67 y 1:500 de conejo anti-NeuN.
- Retire la solución de Na bisulfite-Tris al 1% de los tubos con las rodajas y agregue la solución primaria de anticuerpos. Incubarlo durante la noche a 4oC.
- Prepare una solución salina tris-buffered de 50 mM y agregue 8,5 g/L NaCl (solución Tris-NaCl). Valorar el pH a 7,5. A continuación, lave las rodajas 3veces con la solución Tris-NaCl (20–25 oC) durante 5 min en total.
- Preparar la segunda solución de anticuerpos añadiendo un 3% de suero normal de cabra y un 0,3% de Triton X-100 a la solución Tris-NaCl y diluyendo anticuerpos secundarios. Utilice las siguientes concentraciones de anticuerpos secundarios: 1:500 de cabra anti-ratón y 1:500 de cabra anticonejo.
- Retire la solución Tris-NaCl de los tubos con las rodajas y agregue la solución secundaria de anticuerpos. Incubarlo durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, lave las rodajas 3x con la solución Tris-NaCl durante 5 min en total.
- Coloque las rodajas en la corredera con un cepillo pequeño y aplique un soporte de montaje y un cubreobjetos. Examine las diapositivas con un microscopio confocal. Tome imágenes de la superficie de un sector (Figura 2e).
8. Procesamiento de datos de RMN para extraer volúmenes corticales
- Instale el software libre FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Prepare las imágenes de RMN adquiridas en la sección 3.
- Cambie el formato de imagen mediante el comando fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ. Expanda la imagen cerebral para hacerla tan grande como un cerebro humano usando el comando fslcreatehd y, si es necesario, cambie la orientación usando fslorient con la opción -setqformcode 1. Después de esto, recupere el formato de archivo original utilizando fslchfiletype NIFTI_GZ. El comando exacto es el siguiente.
fslchfiletype NFTI_PAIR [imagen de entrada].nii.gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 4 [imagen de entrada].hdr.gz
fslorient –setqformmcode 1 [imagen de entrada].hdr.gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [imagen de entrada] - Escriba fsl para abrir el software FSL. Extrae cerebros usando el comando bet de la interfaz gráfica de usuario (GUI), pero no pele demasiado. Luego, controla cuidadosamente los umbrales de intensidad fraccional, ... y las coordenadas del centro de la esfera inicial de la superficie cerebral. Los valores óptimos son diferentes para los datos individuales.
- Cambiar el tamaño de la imagen cerebral al tamaño original del cerebro del ratón, utilizando el mismo procedimiento que en el paso 8.2. El comando exacto es el siguiente:
fslchfiletype NFTI_PAIR [imagen de entrada].nii.gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,0008 0 0 0 4 [imagen de entrada].hdr.gz
fslorient –setqformmcode 1 [imagen de entrada].hdr.gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [imagen de entrada] - Coregistra todas las imágenes cerebrales usando el comando flirt, y produce una imagen cerebral promediada usando la opción -add y la opción -div del comando fslmaths.
fslmaths [imagen cerebral 1] –añadir ... –añadir [imagen cerebral N] –div N [nombre de imagen promediado] –odt float - Haga el limpiador de cerebros promediado usando la opción -thr del comando fslmaths. A continuación, seleccione un valor de umbral óptimo adaptable a casos individuales.
fslmaths [nombre de imagen promediado] –thr [thr valor, por ejemplo, 5000] [imagen media umbral] - Finalmente, remodela la imagen cerebral promediada en la coordenada de un individuo usando el comando de coqueteo de nuevo. A continuación, prepare las cortezas extraídas bastante limpias (Figura2a).
NOTA: Desafortunadamente, la bombilla olfativa y el cerebelo no serán perfectos en la superficie cerebral reconstruida a partir de los volúmenes de RMN debido a las limitaciones esenciales del software FSL para peal todas las partes del cerebro, incluyendo la bombilla olfativa y el cerebelo.
9. Procesamiento de imágenes por RMN a superficies corticales de rayas
- Descargar otro software gratuito, 3D Slicer (https://download.slicer.org/).
- Abra las imágenes MR de los cerebros extraídos (haga clic en Archivo y seleccione Agregar datos) producidas de acuerdo con la sección 8, utilizando los módulos Detención de volumen y Editor en 3D Slicer.
- Cambie el modo de Editor a Procesamiento de volumeny haga clic en un botón de destino para hacer que la imagen del cerebro llegue al centro de la pantalla.
- Seleccione el modo MR-T2-brain y ajuste el umbral moviendo la barra mayús. A continuación, vuelva de La representación de volumen al Editor y haga clic en el botón Efecto umbral.
- Aplique la etiqueta 41. Cortex cerebral y guardar los datos de la superficie del cerebro como un archivo .stl. A continuación, cambie el formato de archivo de .vtk a .stly guarde el archivo comprobando el formulario.
10. Preprocesamiento de datos de escaneo 3D
-
Realice un registro automático entre 8 o 16 imágenes tomadas desde 8 o 16 ángulos diferentes dentro de una secuencia de un escaneo para corregir pequeñas discrepancias entre ellas haciendo clic en Registro global incluido en la opción Alineación e integrarlas. Repita los escaneos desde diferentes ángulos para obtener la superficie del cerebro entero (Figura2b).
- Si la integración entre las imágenes escaneadas desde diferentes ángulos no se realizó correctamente, haga clic en Alineación manual y seleccione un par de una imagen fija y una imagen en movimiento.
- Haga clic en Iniciar para iniciar la alineación manual de las imágenes seleccionando tres o cuatro puntos comunes en diferentes imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar. El algoritmo de optimización es el algoritmo iterativo de punto más cercano (ICP)10. No incluye una deformación no lineal.
- Haga una malla de todas las imágenes alineadas (es decir, de los conjuntos de datos de puntos) seleccionando todas las imágenes y haciendo clic en el botón Generación de malla. A continuación, seleccione la opción Objeto artístico pequeño para obtener la malla como la resolución más alta. A continuación, guarde la imagen como binaria .stl o en formato ASCII.
11. Registro de la superficie de RMN y la superficie de escaneado 3D
-
Abra la superficie de RMN y combínela con la superficie de escaneado 3D utilizando el software de procesamiento de superficie. A continuación, realice un proceso de alineación manual utilizando el mismo procedimiento descrito en los pasos 10.1.1 y 10.1.2. A continuación, guarde estas imágenes de superficie coregistradas de nuevo (Figura 2a, b).
- Si es necesario, limpie los datos de superficie individuales, por ejemplo, borrando pequeños ruidos que rodean la región cerebral, especialmente en el caso de los datos de RMN, y rellenando agujeros si existen, especialmente en el caso de los datos de escaneo 3D.
- Por último, abra los datos de superficie con un software de análisis de datos, por ejemplo, MATLAB, y realice y evalúe los histogramas de las distancias mínimas entre las dos superficies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluamos las distancias entre las superficies corticales, producidas por la eliminación del volumen de RMN, y las superficies obtenidas a partir de escaneos 3D de cerebros extraídos. Los valores de modo del histograma de las distancias son de sólo 55 m (Figura3a). Además, al acumular el histograma desde el punto en el que la distancia es igual a cero, el valor acumulado alcanza el 90% de los números totales de la muestra a 300 m (Figura3b). El histograma final de las distancias entre dos superficies mostró un pico típico de alrededor de 50 m. Si interpretamos este valor desde un punto de vista macroscópico, curiosamente, la precisión, el valor de modo de 50 m, corresponde a la limitación geométrica, que se esperaba a partir del tamaño de voxel de las RESONANCIAs magnéticas (figura3a),es decir, 100 m. Este punto sugiere indirectamente que el algoritmo superpuesto, ICP, entre la RMN y la exploración 3D funcionó muy bien y que los niveles de ruido tanto de la RMN como de la exploración 3D se suprimieron como valor bajo (Figura2a,b)14.
Figura 1: El flujo experimental. (a) En primer lugar, después de extraer un cerebro de un ratón, el cerebro se dejó caer en una solución de corte burbujeante. (b) Después de limpiar la solución de corte con una toalla suave y altamente absorbente, (c) el cerebro fue escaneado en un plato giratorio. (d) Al hacer rebanadas (paso 8 del proceso), los bloques cerebrales fueron escaneados en un BBB porque es fácil mover los bloques cerebrales a la base para un vibratome (pasos 7 y 8 del proceso). (e) Después de obtener suficientes rebanadas para registrar actividades eléctricas o para manchar las distribuciones celulares y otros métodos, los bloques cerebrales restantes fueron escaneados de nuevo (paso 10 del proceso). El grosor de los bloques cerebrales restantes proporcionó información de apoyo importante adicional de dónde se tomaron las rebanadas. (f) Por último, registramos las actividades funcionales o arquitecturas estructurales utilizando MEA o métodos de tinción y otros métodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La canalización de procesamiento de datos. (a) Un ejemplo de una superficie cortical producida por la eliminación de cortezas de volúmenes de RMN como se explica en las secciones 8 y 9 del protocolo. (b) Un ejemplo de una superficie cortical escaneada directamente por un sistema de escáner 3D. (c) Un ejemplo de un memorándum utilizado para resumir la región cerebral de donde se extrajeron las rebanadas cerebrales individuales. (d) Un ejemplo de cuando la rebanada cortical está en una placa de electrodos. (e) Un ejemplo de una rebanada cortical del cerebro manchado por NeuN (rojo) y GAD67 (verde). Toda la información se va a recopilar ahora en una base de datos unificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Precisión superpuesta entre RMN y exploraciones 3D. (a) Histogramas de distancias entre superficies extraídas por el pelado de volúmenes de RMN. Las superficies provenían de grabaciones de escaneo 3D. El gráfico de barras principal es el histograma promediado para todos los individuos, y otras líneas de color son resultados para ratones individuales (N a 6 años, de 21 a 40 días de edad, todos eran ratones hembras). Se podría encontrar una tendencia general, estable para todos los individuos. (b) El valor acumulado del histograma se muestra como un gráfico de barras. El porcentaje acumulado alcanzó el 90% a 300 m (líneas punteadas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen conceptualizada de dos escalas de información integradas en una interfaz gráfica de usuario (GUI). Tanto la anatomía del cerebro macroscópico como la información microscópica del circuito neuronal se integraron en un sistema representado por una red. El alto grado de precisión, que se muestra en la Figura3, nos permitió integrar estas dos escalas de forma realista. La imagen macroscópica presentada aquí es de un atlas cerebral escalable15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetros | Valores |
| Tiempo de repetición (TR) | 2.000 ms |
| Tiempo de eco (TE) | 9 ms |
| TE eficaz: | 45 ms |
| Factor RARE | 16 |
| Tamaño de la matriz de adquisición | 196 x 144 x 144 |
| Campo de visión (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 mm3 |
| Ancho de banda de adquisición | 75 kHz |
| Orientación | Axial (orientación coronal en el ajuste del escáner) |
| Parámetros de supresión de grasa | |
| frecuencia de grasa | Pulso de 2,6 ms-gaussian-forma de 2 con ancho de banda de 1051 Hz |
| gradiente spoiler | |
| escaneos ficticios | 2 veces |
| Número de promedios | 3 |
| Tiempo de adquisición | 2 h 42 min |
Tabla 1: Los parámetros de adquisición de la secuencia de pulsos 3D RARE utilizada en este estudio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Desarrollamos un nuevo protocolo llamado protocolo 3D-NEO para unir escalas espaciales macroscópicas y microscópicas superponiendo dos superficies cerebrales con mayor precisión que antes. Originalmente, había dos desafíos en la creación de este protocolo que hizo posible la superposición precisa de dos imágenes de la superficie del cerebro y el registro de actividades neuronales saludables de organismos vivos. En primer lugar, era necesario limpiar eficazmente la solución de corte que rodea el cerebro extraído después de extraerlo del cráneo sin dañar el organismo cerebral (paso 6.2 del protocolo). En segundo lugar, dado que la primera y tercera condiciones de sequedad y retraso de tiempo son factores negativos potenciales para el organismo vivo, terminar todos los pasos del proceso de escaneo desde la extracción del cerebro hasta las preparaciones de la rebanada dentro de 10-15 minutos también fue necesario para mantener las neuronas activas.
La capacidad de registrar con éxito las actividades cerebrales utilizando este protocolo ha hecho posible la coordinación no sólo de las organizaciones estructurales, sino también de las actividades funcionales en el mapa de todo el cerebro. Otro aspecto positivo de este protocolo es que desde que se preparó un BBB, la calibración desde el escáner hasta la base del vibratome se hizo mucho más suave.
Como se mencionó en los resultados representativos, el histograma de distancias entre dos superficies mostró un pico de alrededor de 50 m. Aunque realizamos el proceso de superposición, como si viera desde el punto de vista macroscópico. Si interpretamos el resultado desde el punto de vista microscópico, el 50 m es una escala espacial comparable en la distribución de las neuronas, ya que las probabilidades de conectividad entre pares de neuronas corticales se descomponen dentro de 100 m16,17,incluso dentro de varios milímetros18. Prácticamente, los estudios de imágenes de MEA o calcio a menudo utilizan rodajas de 300 a 400 m de espesor. Por lo tanto, la técnica presentada aquí proporcionará pruebas objetivas sólidas si las rebanadas están correctamente incrustadas en los mapas originales de todo el cerebro. Después de que la superposición se logra con precisión, la precisión adicional se obtendrá puramente de la información local observada bajo un microscopio. Por lo tanto, mediante la realización de un proceso de optimización de dos pasos que consta de pasos de optimización global y local, será posible alcanzar una resolución espacial que equivale semiautomáticamente al tamaño típico de una neurona en el futuro.
Este preciso protocolo de integración proporciona tecnología básica para generar diversos atlas cerebrales18,20,21 e incluso para estudiar más en profundidad la RMN de otros primates22,23 y humanos cerebros postmortem (aunque el cerebro humano tiene sulci, es posible obtener un número suficiente de puntos de registro de gyri). Ahora, también estamos desarrollando una interfaz visual para integrar muchas muestras de datos grabadas en una coordenada espacial común. Una figura de imagen tal como esto se muestra en el cuadro4. En los casos de cerebros de mamíferos, la integración entre escalas cuantitativamente diferentes también hará nuevos avances cualitativamente en la comprensión de los estados de la enfermedad y en la evaluación de los efectos farmacológicos. Generalmente, esto será difícil de aplicar a peces, reptiles y anfibios, porque los investigadores encontrarán difícil mantener la forma del cerebro delgado extraído estable a su forma pre-extraída, y las imágenes de resonancia magnética de sus cerebros más pequeños también serán relativamente más ruidosos.
El protocolo 3D-NEO ha sido introducido por esta investigación en un campo de investigación biológica neurocientífica o celular, demostrando con éxito una alta precisión en el puente entre la anatomía macroscópica y la distribución neuronal microscópica, incluyendo el arquitecturas topológicas de macro y microconnectomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
M.S. agradece el apoyo de todo el personal en el curso de ingeniería de información médica en la Escuela de Posgrado de Medicina y Facultad de Medicina, y quiere agradecer a la Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto, y Doris Zakian por su útil Comentarios. Este estudio fue apoyado por una Beca en Ayuda para la Investigación Exploratoria Desafiante y por el programa Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) a M.S. from MEXT (Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología). Los experimentos de RMN en este trabajo se realizaron en la División de RMN de Animales Pequeños, Centro de Apoyo a la Investigación Médica, Escuela de Medicina de Posgrado, Universidad de Kioto, Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , Oxford University Press. (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of Neural Science. , McGraw-Hill. New York, NY. (2013).
- Pine, J. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. Taketani, M., Baudry, M. , Springer. New York, NY. 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. , Springer-Verlag. 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
