Her presenterer vi en gradvis protokoll for å undersøke mitokondrie åndedrett og glycolytic funksjonen i Candida Albicans bruker en ekstra fluks analyserer.
Mitokondrier er viktig organelles for cellenes stoffskifte og overlevelse. En rekke viktige hendelser skje i mitokondrier, som cellular respirasjon, oksidativt metabolisme, signaltransduksjon og apoptose. Følgelig rapporteres mitokondrie dysfunksjon å spille en viktig rolle i soppdrepende narkotika toleranse og virulens av patogene sopp. Nyere data har også ført til anerkjennelse av betydningen av mitokondrier som en viktig bidragsyter til sopp patogenesen. Til tross for betydningen av mitokondrier i fungal biologi, er standardiserte metoder å forstå dens funksjon dårlig utviklet. Her presenterer vi en prosedyre for å studere basale oksygen forbruksraten (OCR), et mål på mitokondrie åndedrett, og ekstracellulære forsuring priser (ECAR), et mål på glycolytic funksjon i C. albicans stammer. Metoden beskrevet her kan brukes på alle Candidaspp. stammer uten å rense mitokondrier fra intakt fungal cellene. Videre denne protokollen kan også tilpasses til skjermen for hemmere av mitokondrie funksjon i C. albicans stammer.
Invasiv soppinfeksjoner drepe over 1,5 millioner mennesker hvert år over hele verden. Dette nummeret er på økningen skyldes en økning i antall mennesker med nedsatt immunitet, inkludert eldre, premature spedbarn, transplantasjon mottakere og kreft pasienter1. C. albicans er en opportunistisk menneskelige fungal patogen som er en del av menneskelig mikroflora. Det bor også mucosal overflater og fordøyelsessystemet som en commensal organisme. C. albicans produserer alvorlig systemisk sykdom i folk som har immun mankoen, som har gjennomgått kirurgi eller som har blitt behandlet med lang kurs av antibiotika. Candida arter rangerer blant topp tre til fire årsakene til nosocomial smittsomme sykdommer (NID) i Human2,3,4,5,6,7. Det årlige globale antallet Candida blodbanen infeksjoner er anslått til ~ 400 000 tilfeller med tilknyttede dødelighet 46-75%1. Den årlige dødeligheten på grunn av candidiasis er omtrent 10 000 i USA alene. Omfanget av NID forårsaket av sopp gjenspeiles i astronomiske pasienten utgifter5. I USA overgår årlige kostnaden for behandlingen av invasiv soppinfeksjoner $2 milliarder, legger en enorm belastning til allerede overbelastet helsevesenet. Foreløpig er tilgjengelig standard soppdrepende terapi begrenset på grunn av toksisitet, stadig mer utbredt resistens og narkotika-interaksjoner. Derfor er det et presserende behov for å identifisere nye soppdrepende narkotika mål som fører til bedre behandlingstilbud for høy-risiko pasienter. Oppdagelsen av nye stoffer opptrer på sopp mål er imidlertid komplisert fordi sopp eukaryoter. Dette begrenser sterkt antall sopp-spesifikke narkotika mål.
Nyere studier har indikert at mitokondrier er en viktig bidragsyter til sopp virulens og toleranse soppdrepende narkotika siden mitochondria er viktig for cellular respirasjon, oksidativt metabolisme, signaltransduksjon og apoptose8 ,9,10,11. Både glycolytic og ikke-glycolytic metabolisme er avgjørende for overlevelse av C. albicans i de pattedyr vert12,13,14,15,16. Videre har flere C. albicans mutanter mangler mitokondrie proteiner, slik som Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. vist seg å være defekt i filamentation, en viktig virulens faktor C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. I tillegg disse mutanter ble også vist å dempes for virulens i en musemodell spres candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Dermed representerer fungal mitokondrier et attraktivt mål for medisiner. Imidlertid er studiet av mitokondrie funksjon i C. albicans utfordrende fordi C. albicans er petite negative23, som betyr at det ikke kan overleve uten mitokondrie genomet.
Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å undersøke mitokondrie og glycolytic funksjon i C. albicans uten å rense mitokondrier. Denne metoden kan også optimeres for å undersøke effekten av genetisk manipulasjon eller kjemiske modulatorer på mitokondrie og glycolytic stier i C. albicans.
Bioenergi ekstra fluks analysen fungerer som et utmerket verktøy for å lese ut funksjonen mitokondrie ved å måle oxidative fosforylering (OXPHOS)-avhengige oksygenforbruk i sanntid. I tillegg kan en glycolytic funksjon som måles som en ekstracellulære forsuring rate (endre i ekstracellulære pH) også undersøkes samtidig i sanntid analyse.
Vellykket plating av C. albicans i analysen platen er en av de viktige trinnene i analysen fordi inkubasjonstiden for cellene i PDL belagt p…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i NC lab støttes av National Institutes of Health (NIH) stipend R01AI24499 og New Jersey Health Foundation (NJHF) stipend, #PC40-18.
RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
KCN | |||
Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
pH meter | Accumet | AR20 | |
Phenol red | Sigma | P5530 | |
Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
SHAM | |||
Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |