Summary
Hier presenteren we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken de mitochondriale ademhaling en de glycolytic functie in Candida Albicans met behulp van een extra flux-analyzer.
Abstract
Mitochondriën zijn essentiële organellen voor het cellulaire metabolisme en het voortbestaan. Een aantal belangrijke gebeurtenissen plaatsvinden in de mitochondriën, zoals cellulaire ademhaling, oxidatieve metabolisme, signaaltransductie en apoptosis. Bijgevolg, mitochondriale dysfunctie wordt gemeld dat een belangrijke rol spelen in de antischimmel drug tolerantie en de virulentie van pathogene schimmels. Recente gegevens hebben ook geleid tot de erkenning van het belang van het mitochondrium als een belangrijke bijdrage geleverd aan schimmel pathogenese. Ondanks het belang van de mitochondriën in de schimmel biologie, zijn gestandaardiseerde methoden om haar functie te begrijpen slecht ontwikkeld. Hier presenteren we een procedure om te bestuderen van de basale zuurstof verbruik tarief (OCR), een maatregel van de mitochondriale ademhaling en extracellulaire verzuring tarieven (ECAR), een maatregel van glycolytic functie bij C. albicans stammen. De hier beschreven methode kan worden toegepast op alle stammen Candidaspp. zonder de noodzaak voor het zuiveren van de mitochondriën van de intact schimmel cellen. Bovendien, dit protocol kan ook worden aangepast aan het scherm voor remmers van mitochondriale functie in C. albicans stammen.
Introduction
Invasieve schimmelinfecties doden meer dan 1,5 miljoen mensen per jaar wereldwijd. Dit nummer is op de stijging te wijten aan een toename in het aantal mensen met gecompromitteerde immuniteit, met inbegrip van de bejaarden, premature zuigelingen, transplantatie ontvangers en kanker patiënten1. C. albicans is een opportunistische menselijke schimmel pathogeen die een deel uitmaakt van de menselijke darmflora. Hij bewoont ook mucosal oppervlakken en het maag-darmkanaal als een commensale organisme. C. albicans produceert ernstige systemische ziekte bij mensen met immuun tekortkomingen, die een operatie hebben ondergaan, of die zijn behandeld met lange cursussen van antibiotica. De Candida soorten behoren tot de top drie tot vier oorzaken van nosocomiale infectieziekten (NID) in mens2,3,4,5,6,7. Het jaarlijkse globale aantal Candida bloedbaan infecties wordt geschat op 400.000 ~ gevallen, met bijbehorende sterfte van 46-75%1. De jaarlijkse sterfte vanwege candidiasis is ongeveer 10.000 in de Verenigde Staten alleen. De omvang van NID veroorzaakt door schimmels wordt ook weerspiegeld in astronomische geduldige kosten5. In de Verenigde Staten overtreft de jaarlijkse kosten voor de behandeling van invasieve schimmelinfecties 2 miljard dollar, een enorme spanning toe te voegen aan de toch al overbelaste systeem van de gezondheidszorg. Momenteel zijn beschikbare standaard antischimmel therapieën beperkt vanwege toxiciteit, steeds meer voorkomende resistentie en interactie van de drug-drug. Daarom is er dringend behoefte aan nieuwe antischimmel drug targets die in betere behandelingsopties voor hoog-risico patiënten resulteren zal identificeren. Echter is de ontdekking van nieuwe drugs op schimmel doelstellingen ingewikkeld omdat schimmels, eukaryoten zijn. Dit beperkt aanzienlijk het aantal schimmel-specifieke drug targets.
Recente studies hebben aangegeven dat de mitochondriën zijn een essentiële bijdrage aan de schimmel virulentie en tolerantie tot antischimmel geneesmiddelen Aangezien mitochondriën belangrijk voor cellulaire ademhaling, oxidatieve metabolisme, signaaltransductie en apoptosis8 zijn ,9,10,11. Zowel de glycolytic als de niet-glycolytic metabolisme zijn essentieel voor het voortbestaan van C. albicans in de zoogdieren host12,13,14,15,16. Bovendien is verschillende C. albicans mutanten ontbreekt mitochondriale eiwitten, zoals Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. gebleken dat defect in filamentation, een belangrijke virulentiefactor van C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bovendien deze mutanten waren ook aangetoond worden verzacht voor virulentie in een muismodel van verspreid candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Dus, schimmel mitochondriën vertegenwoordigen een aantrekkelijk doelwit voor drugontdekking. Echter, de studie van mitochondriale functie in C. albicans is uitdagend omdat C. albicans petite negatieve23, wat betekent is dat het kan niet zonder het mitochondriaal genoom overleven.
Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van mitochondriale en glycolytic functie in C. albicans zonder de noodzaak voor het zuiveren van de mitochondriën. Deze methode kan ook worden geoptimaliseerd voor het onderzoek naar het effect van de genetische manipulatie of chemische modulatoren op mitochondriale en glycolytic trajecten in C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: De gedetailleerde stapsgewijze protocol van de test is hieronder beschreven, en het schematisch protocol is afgebeeld in Figuur 1.
1. C. albicans spanningen en groei-omstandigheden
- Groeien de C. albicans stammen in vloeibare gist Extract-pepton-Dextrose (YPD) medium bij 30 °C in een broedstoof shaker's nachts.
Opmerking: Candida stammen als bevroren voorraden te handhaven en te groeien op YPD agar (gistextract 1%, 2% pepton, dextrose van 2% en 2% agar).
2. bereiding van reagentia
- Het medium assay als volgt voorbereiden:
- Voor mitochondriale functie assay, los 1.04 g Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 poeder en 2 g glucose (2%) in 90 mL steriel water en warm de media tot 37 ° C. Breng de pH op 7.4 met 5 M NaOH en make-up van het volume met steriel water tot 100 mL.
- Voor glycolytic stress assay, los 1.04 g RPMI 1640 poeder alleen in 90 mL steriel water, warm de media tot 37 ° C en breng de pH op 7.4. Waaruit het volume met steriel water tot 100 mL. RPMI 1640 poeder heeft geen bicarbonaat, die essentieel zijn voor het controleren van de pH-verandering als een maatregel van glycolyse tijdens de test.
- Injectie verbindingen.
- Bereiden van 1 M glucose stock in steriel water en winkel bij-20 ° C.
- Bereiden van 100 mM oligomycin voorraad in dimethylsulfoxide (DMSO), aliquoot in kleine volumes en opgeslagen bij-20 ° C.
- 100 mM antimycin A voorraad in DMSO, aliquoot in kleine hoeveelheden voor te bereiden en op te slaan bij-20 ° C.
- 100 mM SHAM (salicylhydroxamic zuur) voorraad in ethanol voorbereiden op de dag van de test.
- Bereiden 1 M KCN op in de steriel water op de dag van de test.
3. coating van de plaat assay met Poly-D-Lysine (PDL)
Opmerking: Alle uitvoeren de onderstaande stappen in een laminaire kap.
- Poly-D-Lysine in weefselkweek rang water zodat 50 µg Mo/mL eindconcentratie ontbinden. Meng het goed en aliquoot in een 1,5 mL microcentrifuge buizen en opgeslagen bij-20 ° C voor de lange termijn.
Opmerking: 50 µL per putje nodig is, en voor 24 putten, 1,2 mL is vereist. Daarom aliquot ten minste 1,3 mL per microcentrifuge buis. - Voeg 50 µL per putje en Incubeer bij kamertemperatuur met het deksel gedekt voor 1-2 h.
- De oplossing gecombineerd en één keer met 500 µL steriele weefselkweek rang water spoelen.
- Open het deksel en laat de putten in de lucht droog. Gebruik de plaat op de dezelfde dag of bewaren bij 4 ° C voor een maximum van 2-3 dagen.
4. de hydratatie van sensor cartridge
Opmerking: Deze stap uitvoeren, één dag voor het experiment.
- Open de extra flux Assay Kit en verwijder de inhoud. Plaats de sensor cartridge ondersteboven naast de utility plaat (Figuur 2).
- Vul elk goed van de utility plaat met 1 mL kalibrant en plaats de sensor cartridge terug. Zorg ervoor dat de sensoren die fluorophores bevatten (voor het meten van de zuurstof en pH) zijn ondergedompeld in de kalibrant.
- Incubeer de sensor cartridge's nachts in een niet-CO2 -incubator bij 37 ° C.
5. het kweken en zaaien van de cellen in de PDL-gecoate platen
- Inoculeer C. albicans in de YPD Bouillon en 's nachts groeien bij 30 ° C in een shaker bij 200 omwentelingen per minuut.
Opmerking: Gebaseerd op het ontwerp van de bepaling en de rente, kunnen C. albicans ook worden gekweekt in YPG of minimaal medium. - Verdun op de dag van de test, een voldoende aantal cellen in de assay middellange tot een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per 100 µL opleveren.
- Voeg 100 µL van de verdunde cellen in elk putje van de plaat assay behalve putten A1, B4, C3 en D6, waarin slechts 100 µL van het medium assay voor achtergrondcorrectie (Figuur 3) toevoegen.
- De plaat overbrengen in een niet-CO2 -incubator bij 37 ° C en incubeer gedurende 60 min, waarmee de cellen die voldoen aan het oppervlak van de plaat.
6. assay Protocol
Opmerking: Het protocol hier geschetst is voor de indeling van de 24-well van het instrument. Volumes zal moeten worden aangepast indien een andere indeling wordt gebruikt.
- Mitochondriale functie assay
- Voorbereiding van verbindingen
- Verbindingen met 10 x concentratie voor mitochondriale functie assay bereiden: bereiden van 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100 mM KCN, en 20 µM Antimycin A in het overeenkomstige assay-medium.
- Voeg 50 µL SHAM in de A-poort, 55 µL Oligomycin op poort B, 62 µL KCN op poort C en 68 µL Antimycin A op poort D (Figuur 4).
- Voorbereiding van verbindingen
- Glycolytic stress test
- Voorbereiding van verbindingen
- Verbindingen met 10 x concentratie voor glycolytic stress assay voor te bereiden. Bereiden van 100 mM glucose, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-Deoxy Glucose (2DG) en 20 µM Antimycin A in het overeenkomstige assay-medium.
- Voeg 50 µL glucose in poort A, 55 µL Oligomycin op poort B, 62 µL 2-DG op poort C en 68 µL Antimycin A op poort overleden
- Voorbereiding van verbindingen
- Dienst extra flux analyzer, die zuurstof verbruik rente (OCR) en extracellulaire verzuring (ECAR) van levende cellen in de indeling van een 24-well plaat meet. Het test protocol vooraf instellen.
- Open de extra flux analyzer en de assay sjabloon instellen met behulp van het tabblad assay wizard en volg stap voor stap instructie om alle informatie die uit tijdens de installatie springt in te vullen. Genereren de groep lay-out zoals gelijkaardig aan afgebeeld in Figuur 5. Het protocol instellen zoals weergegeven in tabel 1. Deze indelingen goed vooruit voordat assay instellen en opslaan in de computer. Op het moment van de test, het opgeslagen protocol te herstellen door het bijbehorende bestand te openen in de optie bestand openen op het tabblad wizard assay (Figuur 5).
- De 10 x-verbindingen in de respectieve havens van het patroon van de gehydrateerd sensor met de kalibrant geladen en geladen in de lade van de drager van de extra flux-analyzer. Start de calibratie door te drukken op de knop Start op het scherm.
- 350 µL van het medium assay zachtjes aan de plaat van de cel langs de kant van de putten om te minimaliseren van de verstoring van de cel om het eindvolume te 450 µL toevoegen.
- Vervang de hulpprogramma-plaat met de kalibrant met de assay-plaat en blijven.
- Verwijder de cartridge sensor en de plaat zodra de test is voltooid. Sla het bestand in de juiste doelmap.
7. de gegevensanalyse
- Het gebied onder de curve - variantieanalyse (AUC-ANOVA) tabblad analyse in de software gebruiken voor het berekenen van het aanzienlijke verschil tussen de groepen door het selecteren van de respectieve parameters (OCR of ECAR) zoals aangegeven in Figuur 6.
- Selekteer de groepen die moeten worden vergeleken.
- Toevoegen aan de groepen van de analyse voor ANOVA en klik op Ok.
Opmerking: Deze AUC ANOVA analyse zal toevoegen een nieuw blad naar het bestand waarin de AUC is berekend voor elke groep en vergeleken tussen hen door ANOVA. Hierdoor wordt een tabel van p-waarden om te laten zien van de betekenis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De focus van dit protocol is het bepalen van de bio-energetische functies van C. albicans beoordeeld door extra flux analyzer. Een C. albicans mutant ontbreekt mitochondriale eiwit Mam33 is ook opgenomen samen met haar aanvulling stam, mam33Δ/Δ::MAM33 te bestuderen van de gevolgen van de schrapping van een mitochondriale eiwit voor OCR en ECAR. MAM33 codeert voor een eiwit putatief mitochondriale zure matrix en zijn functie bij Candida is niet bekend.
Cel nummers voor extra flux assay
Wij werkzaam 1 x 105 C. albicans wild type cellen per putje in de extra flux assay, waaruit bleek een OCR van 145 pmol/min (Figuur 7), die ligt binnen het optimale bereik van 100-300 pmol/min voor elke extracellulaire flux assay. Het is ook belangrijk om het nummer van de cel voor een optimale OCR voor de bepaling of wanneer er een wijziging in de middelgrote samenstelling groei tussen verschillende testen Titreer.
Analyse van gegevens
Het gebied onder de curve - variantieanalyse (AUC-ANOVA) tabblad analyse in de software werd gebruikt voor het berekenen van het aanzienlijke verschil tussen de groepen door het selecteren van de respectieve parameters (OCR of ECAR) zoals aangegeven in Figuur 7. Deze analyse toegevoegd een nieuw blad naar het bestand waarin de AUC was berekend voor elke groep en vergeleken tussen hen door ANOVA automatisch, waardoor een tabel van p-waarden.
Mitochondriale functie assay
In de mitochondriale stress-test begint de test met het meten van de basale zuurstof verbruik tarief (OCR) gevolgd door injectie van remmers van ATP-synthase, een alternatieve oxidase (AOX) en elektronentransport ketencomplexen, IV en III. Naast de klassieke respiratoire keten, C. albicans ook maakt gebruik van de AOX weg voor energie generatie24. Dus onderzochten we het effect van de AOX systeem op OCR door remming van haar activiteiten met behulp van salicylhydroxamic zuur (SHAM)25. De mitochondriale functie, die werd gemeten als een zuurstof verbruik tarief (OCR) in pmol/min op basale en na het injecteren van de respectieve remmers is afgebeeld in Figuur 7. De basale OCR van wild type, mam33Δ/Δ, en mam33Δ/Δ::MAM33 stammen toonde geen verschillen (Figuur 7A en B). Ook werd geen significant verschil in de basale ECAR waargenomen tussen deze stammen (Figuur 7C en D). Echter door remming van complexe IV door KCN, wild type en mam33Δ/Δ::MAM33 toonde een aanzienlijke verschuiving in de richting de glycolyse in tegenstelling tot de mam33Δ/Δ, die aanzienlijk niet aan te tonen een compenserende glycolytic verschuiving (Figuur 7 E), wat suggereert dat C-IV afhankelijke glycolytic traject is geschaad in de mam33Δ/Δ -mutant vergeleken met wild type en mam33Δ/Δ::MAM33 stammen.
Glycolytic stress test
In de glycolytic stress-test, cellen waren uitgehongerd voor glucose voor 1 h en de basale OCR en ECAR werd gemeten. Bij honger, mam33Δ/Δ toonde aanzienlijk lager OCR (Figuur 8A en B) en ECAR (Figuur 8C en D) ten opzichte van de wild type en de spanningen van de mam33Δ/Δ::MAM33 suggereren een verminderde gebruik van glucose voor zowel ademhaling en glycolyse wanneer de cellen worden gedwongen tot de toestand van de honger. Na het injecteren van glucose, toonden alle stammen stimulatie van zowel OCR en ECAR. Hoewel oligomycin minder invloed heeft op zowel de OCR en de ECAR, 2-DG, oftewel een concurrerende inhibitor van glycolyse, remt zowel OCR en ECAR. In het bijzonder remt 2-DG gedeeltelijk OCR, die verder wordt geremd door Antimycin A. 2-DG remt daarentegen bijna volledig ECAR.
Tabel 1. Protocol opdrachten voor de assay
Figuur 1 . Schematische weergave van het experiment Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Sensor cartridge (groen) geplaatst ondersteboven in de buurt van de plaat van het hulpprogramma voor het toevoegen van de kalibrant. Fluorophores worden aangegeven met pijlen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Cel cultuur plaat tonen achtergrond putten A1, B4, C3 en D6. De blauwe mark toont de inkeping, gericht op de linkerbenedenhoek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Het bovenste gedeelte van het patroon van de sensor tonen poorten A, B, C en D. Het merk pijl toont de inkeping, gericht op de linkerbenedenhoek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . De indeling van putten en groepsopdracht zoals in de software gevisualiseerd. WT - wild type; MT - mam33Δ/Δ mutant; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 aanvulling op stam. Mark pijl toont de tab. open bestand Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Het gebied onder de curve (AUC) voor het berekenen van de betekenis tussen de fracties aan de ANOVA-analyse tab. Selekteer de groepen die moeten worden vergeleken en toevoegen aan de groepen analyse voor ANOVA en klik op ok. Deze analyse van de AUC ANOVA zal een nieuw blad toevoegen aan het bestand waarin de AUC is berekend voor elke groep en vergeleken tussen hen door ANOVA. Hierdoor wordt een tabel van p-waarden om te laten zien van de betekenis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. Mitochondriale functie assay in C. albicans. Zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven werden gemeten in het wild type, mam33 Δ/Δ, en mam33 Δ/Δ::MAM33 stammen van C. albicans. A) een real-time grafiek van zuurstof verbruik tempo (OCR) basale ademhaling gevolgd door sequentiële injectie van SHAM (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM), en Antimycin een (2 µM). B) vergelijking van gebied onder de curve (AUC) basale OCR tussen wild type, mam33Δ/Δ, en mam33Δ/Δ::MAM33 stammen van C. albicans blijkt geen significant verschil. C) A real-time grafiek van extracellulaire verzuring tempo (ECAR) basale glycolyse gevolgd door sequentiële injectie van SHAM (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM), en Antimycin een (2 µM). D) vergelijking van gebied onder de curve (AUC) basale ECAR tussen wild type, mam33Δ/Δ, en mam33Δ/Δ::MAM33 stammen van C. albicans blijkt geen significant verschil. E) vergelijking van gebied onder de curve (AUC) ECAR tussen wild type, mam33Δ/Δ en mam33 Δ/Δ::MAM33 stammen van C. albicans na de injectie van C-IV-remmer KCN vertonen aanzienlijke afname van de glycolytic shift mam33Δ/Δ mutant vergeleken met wild type en complementaire stammen waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking betekenen. * p < 0,05, ** p < 0.001 door one-way ANOVA zo belangrijk wordt geacht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 . Glycolytic stress test in C. albicans. Zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring werden in wild type mam33Δ/Δ mutant nadat ze waren uitgehongerd voor glucose, gevolgd door acute injectie van verzadigde glucose concentratie gemeten. A) een real-time grafiek van zuurstof verbruik tarief na cellen werden onderworpen aan basale ECAR gevolgd door sequentiële injectie van glucose (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM), en Antimycin een (2 µM). B) Bar grafiek die het oppervlak onder de kromme ECAR van basale glycolyse tussen wild type, mam33Δ/Δ, en mam33Δ/Δ::MAM33 stammen van C. albicans. C) A real-time grafiek van de glycolytic functie nadat cellen werden onderworpen aan basale ECAR gevolgd door sequentiële injectie van glucose (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM), en Antimycin een (2 µM). D) Bar grafiek die het oppervlak onder de kromme ECAR van basale glycolyse tussen wild type, mam33Δ/Δ, en mam33Δ/Δ::MAM33 stammen van C. albicans waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking betekenen. * p < 0,05, *** p < 0.0005, *** p < 0,0001 door one-way ANOVA zo belangrijk wordt geacht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Bioenergetica extra flux assay dient als een uitstekend middel om het voorlezen van de mitochondriale functie door het meten van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS)-afhankelijke zuurstofverbruik in real-time. Daarnaast kan ook een glycolytic functie die wordt gemeten als een percentage van de extracellulaire verzuring (estafetteovergave in de extracellulaire pH) tegelijkertijd in real-time analyse te worden onderzocht.
Succesvolle beplating van C. albicans in de assay-plaat is een van de kritische stappen in de analyse omdat de incubatie van de cellen in de PDL gecoate platen de cellen zich te houden aan de plaat assay toestaan. Visualisatie van de daaraan vastzittende C. albicans cellen wordt bereikt door de lichte microscopie. Naleving van de onjuiste cel kan leiden tot cellen drijvend in de putten, die de uitkomst van de test met inconsistente lezingen tussen replicatieonderzoeken zal beïnvloeden. Ook is het belangrijk om uit te voeren van de cel nummer titratie als de eerste stap in deze test een OCR tussen 100-300 pmol/min, oftewel een optimaal bereik te verkrijgen. Ook is titrating van de verbindingen met het oog op de optimale concentratie ook cruciaal voor de optimale respons bereiken. Dit kan worden uitgevoerd wanneer er een wijziging in de basale middellange samenstelling.
DMEM is het meest gebruikte Basaal medium in de extra flux assay voor zoogdiercellen. Nochtans, in onze handen, RPMI 1640 medium gaf de optimale resultaten met C. albicans. Dit was voornamelijk te wijten aan de werkzaamheid van mitochondriaal elektronentransport keten complexe remmers die beter in RPMI 1640 medium in vergelijking met DMEM werkte.
In deze test, wild type, werden mam33Δ/Δ, en mam33Δ/Δ::MAM33 stammen van C. albicans gebruikt ter beoordeling van de mitochondriale ademhaling en glycolytic-efficiëntie. De resultaten tonen duidelijk aan dat de verwijdering van MAM33 gen verminderd het vermogen van de C. albicans te verschuiven naar glycolyse onder stress omstandigheden zoals remming van C-IV (Figuur 7C en 7E). Ook wanneer cellen werden onderworpen aan het benadrukken van de aandoening, zoals glucose honger, zowel mitochondriale ademhaling en glycolytic-efficiëntie aanzienlijk in gevaar komt in de mam33Δ/Δ -mutant maar niet in het wild type en aanvulling stammen ( Figuur 8). Daarom, afhankelijk van de experimenten, koolstof bronnen in de RPMI-1640 kunnen ook worden aangepast om glycerol of galactose, waardoor de cellen op OXPHOS in plaats van glycolyse.
De betekenis van het gebruik van de extra flux-bepaling is dat de cellen kunnen gebruik maken van OXPHOS versus glycolyse door diverse substraten en verbindingen die erover mitochondriale functie, kan worden afgeleid. Dit kan worden gebruikt als een informatief instrument te begrijpen van het effect van de eventuele behandelingen of gene de mitochondriale functie en de glycolyse in Candida albicans zonder het isoleren van de mitochondriën. De test meet basale zuurstof verbruik rente (OCR), oftewel een maatregel van de mitochondriale ademhaling, en extracellulaire verzuring (ECAR), oftewel een maatregel van glycolytic functie in zowel de aanwezigheid van glucose en glucose honger. De extra flux cellulaire assay is goed op allerlei soorten zoogdieren modellen26tewerkgesteld. Ondanks het medisch belang van C. albicans, onderzoek naar schimmel mitochondriën enigszins belemmerd als gevolg van het gebrek aan gestandaardiseerde experimentele procedures mitochondriale functie en glycolyse in real-time te studeren.
Deze methode biedt een eenvoudige en handige manier van onderzoek naar de mitochondriale ademhaling en de glycolytic-efficiëntie met behulp van real-time extracellulaire flux assay in C. albicans. Deze test kan in de toekomst ook worden toegepast om te studeren het drug-werkzaamheid te testen met behulp van algemeen werknemer antischimmelmiddelen zoals fluconazol. Daarnaast is een andere potentiële toekomstige toepassing van deze methode in Geneesmiddelenontwikkeling, vooral voor het screenen van verbindingen richten mitochondriale functie van C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Onderzoek in NC lab is gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 en een New Jersey Health Foundation (NJHF)-grant, #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
