Summary
Nous présentons ici un protocole par étapes pour étudier la respiration mitochondriale et la fonction glycolytique chez Candida Albicans à l’aide d’un analyseur de flux supplémentaires.
Abstract
Les mitochondries sont des organites essentiels pour le métabolisme cellulaire et la survie. Une variété d’événements importants se déroulent dans les mitochondries, telles que la respiration cellulaire, métabolisme oxydatif, transduction du signal et l’apoptose. Par conséquent, dysfonctionnement mitochondrial est signalé à jouer un rôle important dans la tolérance des médicaments antifongiques et la virulence des champignons pathogènes. Des données récentes ont également conduit à la reconnaissance de l’importance des mitochondries comme un important contributeur à la pathogénèse fongique. Malgré l’importance des mitochondries en biologie fongique, des méthodes normalisées pour comprendre sa fonction sont peu développés. Nous présentons ici une procédure afin d’étudier le taux de consommation d’oxygène basale (OCR), une mesure de la respiration mitochondriale et taux d’acidification extracellulaire (ECAR), une mesure de la fonction glycolytique chez les souches de c. albicans . La méthode décrite ci-après peut être appliquée à n’importe quel Candidaspp. souches sans la nécessité de purifier les mitochondries des cellules fongiques intacts. En outre, ce protocole peut également être personnalisé pour dépister les inhibiteurs de la fonction mitochondriale chez les souches de c. albicans .
Introduction
Infections fongiques invasives tuent plus 1,5 millions de personnes par an dans le monde entier. Ce chiffre est en hausse en raison d’une augmentation du nombre de personnes vivant avec l’immunité compromise, y compris les nourrissons prématurés âgés, receveurs et cancer patients1. C. albicans est un pathogène opportuniste qui fait partie de la microflore humaine. Il habite également les surfaces muqueuses et le système gastro-intestinal comme un organisme commensal. C. albicans produit une maladie systémique grave chez les personnes ayant des déficiences immunitaires, qui ont subi une chirurgie, ou qui ont été traités avec longs cours des antibiotiques. Le rang d’espèce Candida parmi les causes de trois à quatre premiers nosocomiales maladies infectieuses (NID) sur les êtres humains2,3,4,5,6,7. Le nombre global annuel des septicémies à Candida est estimé à ~ 400 000 cas, avec des taux de mortalité associé de 46 à 75 %1. La mortalité annuelle à cause de la candidose est d’environ 10 000 dans les seuls États-Unis. L’ampleur du NID causée par des champignons se reflète également dans astronomique dépenses patient5. Aux États-Unis, les dépenses annuelles pour le traitement des infections fongiques invasives dépasse $ 2 milliards, ajoutant une énorme souche au système de santé déjà surchargé. Actuellement, les traitements antifongiques standards disponibles sont limitées en raison de la toxicité, la résistance aux médicaments de plus en plus répandue et interactions médicament-médicament. Par conséquent, il y a un besoin urgent d’identifier de nouvelles cibles de médicaments antifongiques qui seront traduira par meilleures options de traitement pour les patients à haut risque. Toutefois, la découverte de nouveaux médicaments agissant sur les cibles fongiques est compliquée car les champignons sont des eucaryotes. Ce qui limite considérablement le nombre de cibles thérapeutiques spécifiques fongiques.
Des études récentes ont montré que les mitochondries sont un facteur critique de la virulence fongique et la tolérance aux médicaments antifongiques puisque les mitochondries sont importants pour la respiration cellulaire, métabolisme oxydatif, transduction du signal et l’apoptose8 ,9,10,11. Le métabolisme glycolytique et non-glycolytiques sont essentiels pour la survie de c. albicans dans le mammifère hôte12,13,14,15,16. En outre, plusieurs mutants de c. albicans , manque de protéines mitochondriales, tels que Goa1, Srr1, Gem1, etc. Sam37 montrent défectueux dans la filamentation, un facteur de virulence important de c. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. en outre, ces mutants ont été également montrés pour être atténuée pour virulence dans un modèle murin de diffusé la candidose17,18,19,20,21 ,,22. Ainsi, des mitochondries fongiques représentent une cible attractive pour la découverte de médicaments. Cependant, l’étude de la fonction mitochondriale chez c. albicans est difficile parce que c. albicans est petite négative23, ce qui signifie qu’il ne peut survivre sans le génome mitochondrial.
Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour étudier la fonction mitochondriale et glycolytique chez c. albicans sans la nécessité de purifier des mitochondries. Cette méthode peut également être optimisée pour étudier l’effet de la manipulation génétique ou les modulateurs chimiques sur des voies mitochondriales et glycolytiques chez c. albicans.
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Protocol
Remarque : Le protocole détaillé par étape du dosage est décrit ci-dessous, et le protocole schématique est illustré à la Figure 1.
1. les souches de c. albicans et de conditions de croissance
- Cultiver les souches de c. albicans dans un milieu liquide levure extrait-Peptone-Dextrose (DPJ) à 30 °C dans un agitateur incubateur du jour au lendemain.
Remarque : Maintenir des souches de Candida comme stocks congelés et croître sur gélose YPD (1 % d’extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de dextrose et 2 % d’agar).
2. préparation des réactifs
- Préparer le milieu comme suit :
- Pour l’analyse de la fonction mitochondriale, dissoudre la poudre de 1640 de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g et 2 g de glucose (2 %) dans 90 mL d’eau stérile et l’accueil chaleureux des médias à 37 ° C. Ajuster le pH à 7.4 à l’aide de 5 M NaOH et compléter le volume à 100 mL avec de l’eau stérile.
- Pour l’analyse de stress glycolytique, dissoudre 1,04 g poudre RPMI 1640 seul dans 90 mL d’eau stérile, réchauffer les médias à 37 ° C et ajuster le pH à 7,4. Compléter le volume à 100 mL avec de l’eau stérile. La poudre de RPMI 1640 a sans bicarbonate, qui est indispensable pour surveiller le changement de pH en guise de glycolyse pendant le test.
- Composés de l’injection.
- Préparer le stock de glucose 1 M dans l’eau stérile et conserver à-20 ° C.
- Préparer 100 mM oligomycine stock dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), aliquot dans de petits volumes et conserver à-20 ° C.
- Préparation 100 mM l’antimycine A stock dans le DMSO, aliquote dans de petits volumes et conserver à-20 ° C.
- Préparer 100 mM stock (acide salicylhydroxamique) SHAM dans de l’éthanol sur le jour du test.
- Préparer 1 M KCN dans l’eau stérile, le jour du test.
3. revêtement de la plaque de test avec le Poly-D-Lysine (PDL)
Remarque : Effectuez toutes les étapes dans une hotte laminaire ci-dessous.
- Dissoudre la Lysine de Poly-D dans l’eau de la culture de tissus qualité afin de rendre la concentration finale de 50 µg/mL. Mélangez-le bien et aliquotes dans des tubes de microcentrifuge 1,5 mL et conserver à-20 ° C pour le long terme.
Remarque : 50 µL / puits est nécessaire, et pour 24 puits, 1,2 mL est nécessaire. Par conséquent, partie aliquote au moins 1,3 mL par tube microcentrifuge. - Ajouter 50 µL / puits et incuber à température ambiante avec le couvercle couvert pendant 1-2 h.
- Aspirer la solution et rincer une fois avec l’eau la qualité des vitroplants stérile des 500 µL.
- Ouvrez le couvercle et laissez les puits à l’air sec. Utilisez la plaque sur le jour même ou le conserver à 4 ° C pendant un maximum de 2 ou 3 jours.
4. l’hydratation de la cartouche de sonde
Remarque : Exécutez cette étape un jour avant l’expérience.
- Ouvrir le flux supplémentaire Kit de dosage et de retirer le contenu. Placez la cartouche de capteur à l’envers à côté de la plaque de l’utilitaire (Figure 2).
- Remplir chaque puits de la plaque de l’utilitaire avec 1 mL de calibrant et placez la cartouche de capteur retour. Veillez à ce que les capteurs qui contiennent des fluorophores (pour mesurer l’oxygène et du pH) sont submergées dans le degré.
- Incuber la cartouche de sonde du jour au lendemain dans une étuve de non-CO2 à 37 ° C.
5. de plus en plus et l’ensemencement des cellules dans les plaques de revêtement PDL
- Ensemencer c. albicans dans le bouillon de la DPJ et croître durant la nuit à 30 ° C dans un agitateur à 200 tr/min.
NOTE : Basé sur la conception de l’essai et l’intérêt, c. albicans peut également être cultivé dans GPJ ou un milieu minimal. - Le jour du test, diluer un nombre adéquat de cellules dans le milieu pour donner une concentration finale de 100 000 cellules / µL 100.
- Ajouter 100 µL de cellules dilués dans chaque puits de la plaque d’essai sauf puits A1, B4, C3 et D6, dans lequel ajouter seulement 100 µL de milieu dosage pour une correction de fond (Figure 3).
- Transférer la plaque dans une étuve à non-CO2 à 37 ° C et laisser incuber pendant 60 min, ce qui laissera les cellules adhèrent à la surface de la plaque.
6. protocole
Remarque : Le protocole décrit ici est pour le format 24-puits de l’instrument. Volumes devront être ajustées si l'on utilise un autre format.
- Test de la fonction mitochondriale
- Préparation de composés
- Préparer les composés à concentration de x 10 pour l’analyse de la fonction mitochondriale : 20 mM SHAM, 100 µM de préparer l’Oligomycine, 100 mM KCN et 20 µM l’Antimycine A dans le milieu d’essai correspondant.
- Ajouter 50 µL SHAM dans le port A, 55 µL Oligomycine au port B, 62 µL de KCN dans port C et 68 µL l’Antimycine A port D (Figure 4).
- Préparation de composés
- Test de stress glycolytiques
- Préparation de composés
- Préparer les composés à concentration de x 10 pour l’analyse de stress glycolytique. Préparer 100 mM glucose, 100 µM l’Oligomycine, 500 mM 2-désoxy Glucose (2DG) et 20 µM l’Antimycine A dans le milieu d’essai correspondant.
- Ajouter 50 glucose µL dans le port A, 55 µL Oligomycine au port B, 62 µL 2-DG dans port C et 68 µL l’Antimycine A port D.
- Préparation de composés
- Employer l’analyseur de flux supplémentaires, qui mesure le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) de cellules vivantes dans un format de plaque 24 puits. Mettre en place le protocole d’essai à l’avance.
- Ouvrez l’analyseur de flux supplémentaires et mis en place le modèle de test en utilisant l’onglet assistant de dosage et suivre les instructions étape par étape pour remplir toutes les informations qui saute dehors pendant l’installation. Générer la mise en page de groupe comme semblable à illustré à la Figure 5. Mettre en place le protocole tel qu’illustré dans le tableau 1. Mis en place ces mises en page très avancée avant le dosage et l’enregistrer dans l’ordinateur. Au moment du test, restaurer le protocole sauvé en ouvrant le fichier correspondant à l’option ouvrir le fichier dans l’onglet assistant de dosage (Figure 5).
- Charger les composés 10 x dans les ports respectifs de la cartouche de capteur hydraté contenant le degré et la charger dans le bac de transporteur de l’analyseur de flux supplémentaires. Commencer le calibrage en appuyant sur le bouton Start à l’écran.
- Ajouter 350 µL du milieu dosage doucement jusqu'à la tôle de la cellule le long du côté des puits pour minimiser la perturbation de la cellule pour porter le volume final à 450 µL.
- Replacez la plaque de l’utilitaire contenant le degré avec la plaque de test et continuer.
- Retirez la cartouche de la sonde et la plaque une fois le test terminé. Enregistrez le fichier dans le dossier de destination approprié.
7. analyse de données
- L’aire sous la courbe - analyse de variance (ANOVA-AUC) analyse tab dans le logiciel permet de calculer la différence significative entre les groupes en sélectionnant les paramètres respectifs (OCR ou ECAR) comme illustré à la Figure 6.
- Sélectionnez les groupes qui doivent être comparées.
- Ajouter à des groupes d’analyse pour l’analyse de la variance, puis cliquez sur Ok.
Remarque : Cette analyse ANOVA AUC ajoutera une nouvelle feuille au fichier dans lequel les AUC est calculé pour chaque groupe et comparé entre eux par l’analyse de la variance. Cela vous donnera une table des valeurs de p pour montrer l’importance.
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Representative Results
L’objectif de ce protocole consiste à déterminer les fonctions bioénergétiques c. albicans , évaluée par l’analyseur de flux supplémentaires. Un mutant de c. albicans dépourvus de protéines mitochondriales Mam33 est également inclus avec sa souche de complément, mam33Δ/Δ::MAM33 pour étudier les effets de la suppression d’une protéine mitochondriale sur OCR et ECAR. MAM33 code pour une protéine de la matrice acides mitochondriale putatif et sa fonction à Candida n’est pas connue.
Nombre de cellules pour l’analyse des flux supplémentaires
Nous avons utilisé des cellules de type sauvage c. albicans 1 x 105 / puits dans l’analyse des flux supplémentaires, qui ont montré un OCR de 145 pmol/min (Figure 7), qui est dans la fourchette optimale de 100-300 pmol/min pour l’analyse de n’importe quel flux extracellulaire. Il est également important d’ajuster le nombre de cellules pour obtenir un OCR optimale avant le dosage, ou lorsqu’il y a un changement dans la composition du milieu croissance entre différents dosages.
Analyse des données
L’aire sous la courbe - analyse de variance (ANOVA-AUC) analyse tab dans le logiciel a été utilisé pour calculer la différence significative entre les groupes en sélectionnant les paramètres respectifs (OCR ou ECAR) comme illustré à la Figure 7. Cette analyse a ajouté une nouvelle feuille au fichier dans lequel les AUC a été calculé pour chaque groupe et comparé entre eux par ANOVA automatiquement, ce qui a donné une table des valeurs de p.
Test de la fonction mitochondriale
Dans le test de stress mitochondrial, l’analyse commence par mesurer le taux de consommation d’oxygène basale (OCR) suivi par l’injection d’inhibiteurs de l’oxydase alternative (AOX), ATP synthase et complexes de la chaîne de transport d’électrons, IV et III. En plus de la chaîne respiratoire classique, c. albicans utilise également la voie AOX pour énergie génération24. Par conséquent, nous avons étudié l’effet du système AOX sur OCR en inhibant son activité à l’aide de salicylhydroxamique, acide (SHAM)25. La fonction mitochondriale, qui a été mesurée un taux de consommation d’oxygène (OCR) en pmol/min à basal et après l’injection des inhibiteurs respectifs est illustrée à la Figure 7. L’OCR basale des souches sauvages de type, mam33Δ/Δ et mam33Δ/Δ::MAM33 ne montre aucune différence (Figure 7A et B). De même, aucune différence significative dans l’ECAR basale a été observée entre ces souches (Figure 7C et D). Cependant, en inhibant le complexe IV de KCN, type sauvage et mam33Δ/Δ::MAM33 ont montré une évolution importante vers la glycolyse contrairement à mam33Δ/Δ, qui a échoué nettement montrer un changement compensatoire glycolytique (Figure 7 ( E), ce qui suggère que glycolyse dépendant de C-IV est altérée chez le mutant mam33Δ/Δ par rapport au type sauvage et les souches de mam33Δ/Δ::MAM33 .
Test de stress glycolytiques
Dans le test de stress glycolytique, cellules ont été privées de glucose pendant 1 h et l’OCR et les ECAR basale a été mesurée. À la famine, mam33Δ/Δ a montré significativement plus faible OCR (Figure 8A et B) et ECAR (Figure 8C et D) par rapport au type sauvage et les souches de mam33Δ/Δ::MAM33 ce qui laisse supposer une utilisation altérée de glucose pour la respiration et la glycolyse lorsque les cellules sont forcées à l’état de famine. Après l’injection de glucose, toutes les souches ont montré une stimulation des OCR et ECAR. Bien que l’oligomycine a moins d’effet sur les OCR et ECAR, 2-DG, qui est un inhibiteur compétitif de la glycolyse, inhibe les OCR et les ECAR. Plus précisément, 2-DG inhibe partiellement OCR, qui est également inhibée par l’Antimycine A. En revanche, 2-DG inhibe presque totalement ECAR.
Le tableau 1. Commandes de protocole pour le dosage
Figure 1 . Représentation schématique de l’expérience s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Cartouche (vert) de la sonde placé tête en bas près de la plaque de l’utilitaire avant d’ajouter le calibrant. Fluorophores sont indiqués par des flèches. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Plaque de culture cellulaire montrant des puits de fond A1, B4, C3 et D6. La marque bleue indique l’encoche, orienté vers le bas à gauche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . La partie supérieure de la cartouche de sonde affichage des ports A, B, C et D. La flèche montre l’encoche, orienté vers le bas à gauche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . L’aménagement de puits et de classement dans un groupe comme visualisés dans le logiciel. WT - type sauvage ; MT - mutant mam33Δ/Δ ; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 complémenter la souche. Marque de la flèche montre l’onglet ouvrir le fichier s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . La zone située sous l’onglet d’analyse ANOVA courbe (AUC) pour calculer l’importance entre les groupes. Sélectionnez les groupes qui doivent être comparées et ajouter les groupes d’analyse pour l’analyse de la variance et cliquez sur OK. Cette analyse ANOVA AUC ajoutera une nouvelle feuille au fichier dans lequel les AUC est calculé pour chaque groupe et comparé entre eux par l’analyse de la variance. Cela vous donnera une table des valeurs de p pour montrer l’importance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 7. Essai sur la fonction mitochondriale C. albicans. Consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire ont été mesurés chez les souches sauvages de type, mam33 Δ/Δ et mam33 Δ/Δ::MAM33 de c. albicans. A) un graphique en temps réel des taux de consommation d’oxygène (OCR) à la respiration de base suivie d’une injection séquentielle de SHAM (2 mM), l’Oligomycine (10 µM), KCN (10 mM) et l’Antimycine A (2 µM). B) comparaison de l’aire sous la courbe (AUC) de OCR basale entre les souches sauvages de type, mam33Δ/Δ et mam33Δ/Δ::MAM33 de c. albicans ne montrent aucune différence significative. Graphique en temps réel C) A des taux d’acidification extracellulaire (ECAR) à la glycolyse basale suivie d’une injection séquentielle de SHAM (2 mM), l’Oligomycine (10 µM), KCN (10 mM) et l’Antimycine A (2 µM). D) comparaison de l’aire sous la courbe (AUC) ECAR basale entre les souches sauvages de type, mam33Δ/Δ et mam33Δ/Δ::MAM33 de c. albicans ne montrent aucune différence significative. E) comparaison de l’aire sous la courbe (ASC) ECAR entre des souches sauvages de type, mam33Δ/Δ et mam33 Δ/Δ::MAM33 de c. albicans après l’injection d’inhibiteur de C-IV KCN montrent une diminution significative de la glycolyse Maj en mam33Δ/Δ mutant par rapport au type sauvage et valeurs souches complémentaires sont exprimées sous forme de moyenne moyenne ± écart-type. * p < 0,05, ** p < 0,001 est considérée comme importante par ANOVA à. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 . Test de stress glycolytiques dans c. albicans. La consommation d’oxygène et l’acidification extracellulaire ont été mesurés chez le type sauvage, mam33Δ/Δ mutant après que qu’ils ont été affamés pour le glucose suivie d’une injection aiguë de la concentration de glucose saturés. A) un graphique en temps réel des taux de consommation d’oxygène après que les cellules ont été soumises à l’ECAR basale suivie d’une injection séquentielle du glucose (10 mM), l’Oligomycine (1 µM), 2-DG (40 mM) et l’Antimycine A (2 µM). B) graphique à barres montrant la surface sous la courbe ECAR de la glycolyse basale entre les souches sauvages de type, mam33Δ/Δ et mam33Δ/Δ::MAM33 de c. albicans. Graphique en temps réel A C) de la fonction glycolytique après que les cellules ont été soumises à l’ECAR basale suivie d’une injection séquentielle du glucose (10 mM), l’Oligomycine (1 µM), 2-DG (40 mM) et l’Antimycine A (2 µM). D) graphique à barres montrant la surface sous la courbe ECAR de la glycolyse basale entre le type sauvage, mam33Δ/Δ et mam33Δ/Δ::MAM33 des souches de c. albicans valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type moyenne. * p < 0,05, *** p < 0,0005, *** p < 0,0001 est considérée comme importante par ANOVA à. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La bioénergétique test flux supplémentaire est un outil excellent pour donner lecture de la fonction mitochondriale en mesurant la phosphorylation oxydative (OXPHOS)-dépendante d’oxygéne en temps réel. En outre, une fonction glycolytique qui est mesurée sous forme d’un taux d’acidification extracellulaire (modification du pH extracellulaire) peut également être étudiée en même temps dans l’analyse en temps réel.
Électrodéposition réussie de c. albicans dans la plaque de test est une des étapes essentielles dans l’analyse car l’incubation des cellules dans les plaques PDL enduit autorise les cellules d’adhérer à la plaque de test. Visualisation des cellules adhérentes de c. albicans est réalisée au microscope photonique. Adhérence cellulaire inadéquate peut conduire aux cellules flottant dans les puits, ce qui affecteront le résultat de test avec les lectures incohérentes entre les répétitions. De même, il est important d’effectuer le titrage numéro cellulaire comme la première étape de ce test pour obtenir un OCR entre 100-300 pmol/min, ce qui représente une plage optimale. Aussi, titrage les composés pour obtenir la concentration optimale est aussi essentielle à la réalisation de l’intervention optimale. Ceci peut être effectué chaque fois qu’il y a un changement dans la composition du milieu basal.
DMEM est le milieu de base plus couramment utilisé dans l’analyse de flux supplémentaires pour les cellules mammifères. Toutefois, dans nos mains, milieu RPMI 1640 a donné des résultats optimaux avec c. albicans. C’était principalement en raison de l’efficacité du complexe inhibiteurs de chaîne mitochondriale de transport d’électrons qui a fonctionné mieux dans un milieu RPMI 1640 par rapport à DMEM.
Dans cet essai, type sauvage, mam33Δ/Δ et mam33Δ/Δ::MAM33 des souches de c. albicans ont été utilisés pour évaluer la respiration mitochondriale et l’efficacité glycolytique. Les résultats montrent clairement que la délétion du gène MAM33 réduit la capacité de c. albicans à déplacer vers la glycolyse en conditions de stress tels que l’inhibition de la C-IV (Figure 7C et 7E). De même, lorsque les cellules ont été soumises au stress condition comme glucose famine, tant la respiration mitochondriale et glycolytique efficacité est significativement compromise chez le mutant mam33Δ/Δ , mais pas dans le type sauvage et les souches de complément ( Figure 8). Par conséquent, selon les expériences, sources de carbone dans le RPMI 1640 aussi peuvent être modifiées au glycérol ou le galactose, qui force les cellules à utiliser OXPHOS plutôt que la glycolyse.
L’importance de l’utilisation de l’analyse des flux supplémentaires est que, à l’aide de divers substrats et des composés qui perturbent la fonction mitochondriale, la capacité de cellules à utiliser OXPHOS versus la glycolyse peut être déduite. Cela peut servir comme un outil instructif pour comprendre l’effet des traitements ou gène sur la fonction mitochondriale et de la glycolyse chez Candida albicans sans isoler les mitochondries. L’essai mesure les taux de consommation d’oxygène basale (OCR), qui est une mesure de la respiration mitochondriale, et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR), qui est une mesure de la fonction glycolytique en la présence de glucose et après la famine de glucose. L’analyse cellulaire flux supplémentaire est bien employée dans une variété de modèles mammifères26. Malgré l’importance médicale de c. albicans, recherche dans les mitochondries fongiques a été un peu gênée en raison de l’absence de procédures expérimentales normalisées afin d’étudier la fonction mitochondriale et la glycolyse en temps réel.
Cette méthode fournit un moyen facile et pratique d’enquêter sur la respiration mitochondriale et l’efficacité glycolytique en utilisant l’analyse en temps réel flux extracellulaire dans c. albicans. À l’avenir, ce test peut également être appliqué à l’étude l’essai de l’efficacité du médicament à l’aide d’antifongiques couramment utilisés comme le fluconazole. En outre, une autre application future potentielle de cette méthode est à la découverte de médicaments, surtout pour le criblage de composés ciblant la fonction mitochondriale chez c.albicans.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Recherche dans le laboratoire de NC est soutenue par une subvention du National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 et une subvention de la Fondation New Jersey de la santé (NJHF), #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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