Summary
Hier präsentieren wir eine schrittweise Protokoll um die mitochondriale Atmung und glykolytische Funktion in Candida Albicans untersuchen mit ein zusätzliches Flussmittel-Analyzer.
Abstract
Mitochondrien sind wesentliche Organellen für den Zellstoffwechsel und das Überleben. Eine Vielzahl von wichtigen Veranstaltungen finden statt in den Mitochondrien, z. B. oxidativen Stoffwechsel, Zellatmung, Signaltransduktion und Apoptose. Infolgedessen wird die mitochondriale Dysfunktion berichtet, eine wichtige Rolle in der pilzbefallverhütende Droge Toleranz und Virulenz von pathogenen Pilzen. Die jüngsten Daten führten auch die Anerkennung der Bedeutung der Mitochondrien als ein wichtiger Faktor für Pilz Pathogenese. Trotz der Bedeutung der Mitochondrien in Pilz-Biologie sind standardisierte Methoden, um seine Funktion zu verstehen schlecht entwickelt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Verfahren um die basalen Sauerstoff-Verbrauch (OCR), ein Maß für die mitochondriale Atmung und extrazelluläre Übersäuerung Preise (ECAR), ein Maß für die glykolytischen Funktion in C. Albicans -Stämmen zu studieren. Die hier beschriebene Methode kann auf alle Candidaspp. Stämme ohne Mitochondrien von den intakten Pilzzellen zu reinigen angewendet werden. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch angepasst werden zum Bildschirm für Inhibitoren der mitochondrialen Funktion in C. Albicans -Stämmen.
Introduction
Invasive Pilzinfektionen töten mehr als 1,5 Millionen Menschen pro Jahr weltweit. Diese Nummer ist auf dem Vormarsch durch eine Erhöhung der Anzahl der Menschen, die mit infizierten Immunität, einschließlich älterer, vorzeitige Säuglinge, Transplantationspatienten und Krebs Patienten1. C. Albicans ist eine opportunistische menschlichen pilzliche Erreger, die ein Teil der menschlichen Mikroflora ist. Er bewohnt auch Schleimhaut-Oberflächen und den Magen-Darm-Trakt als Kommensalen Organismus. C. Albicans produziert schwere systemische Erkrankung bei Menschen mit Immunschwäche, die Operation unterzogen haben, oder wer mit langen Kurse der Antibiotika behandelt wurden. Der Candida Spezies zählen zu den Top drei bis vier Ursachen nosokomialer Infektionskrankheiten (NID) in Menschen2,3,4,5,6,7. Die jährliche globale Anzahl von Candida -Infektionen Blutkreislauf wird voraussichtlich ~ 400.000 Fälle mit damit verbundenen Todesfälle von 46-75 %1. Die jährliche Sterblichkeit wegen Candidiasis ist etwa 10.000 in den Vereinigten Staaten allein. Das Ausmaß der durch Pilze hervorgerufenen NID spiegelt sich auch im astronomischen Patienten Kosten5. In den USA übertrifft die jährlichen Kosten für die Behandlung von invasiven Pilzinfektionen $ 2 Milliarden, bereits überlasteten Gesundheitssystem eine große Belastung hinzufügen. Derzeit verfügbare standard antimykotische Therapien begrenzt wegen der Toxizität, immer häufiger Resistenzen und Wechselwirkungen. Daher ist dringend erforderlich, neue Angriffspunkte für antimykotische Medikamente zu identifizieren, die bessere Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit hohem Risiko führt. Die Entdeckung neuer Medikamente auf Pilz Ziele ist jedoch komplizierter, weil Pilze Eukaryoten sind. Dies schränkt erheblich die Zahl der Pilz-spezifische Drogeziele.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass Mitochondrien einen kritischen Beitrag zu den Pilz Virulenz und Toleranz gegenüber Antimykotika da Mitochondrien wichtig für die Zellatmung, oxidativen Stoffwechsel, Signaltransduktion und Apoptose8 sind ,9,10,11. Glykolytische und nicht glykolytischen Stoffwechsel sind essentiell für das Überleben von C. Albicans im Säugetier-Wirt12,13,14,15,16. Darüber hinaus haben mehrere C. Albicans Mutanten fehlt mitochondrialen Proteine, wie z.B. Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. erwiesen, in Filamentierung, einem wichtigen Virulenzfaktor von C. Albicans17, defekt 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Darüber hinaus diese Mutanten zeigten auch abgeschwächt werden, denn in einem Mausmodell der Virulenz Candidiasis17,18,19,20,21 verbreitet ,22. Pilze Mitochondrien stellen somit, ein attraktives Ziel für die Arzneimittelforschung. Die Untersuchung der Funktion der Mitochondrien in C. Albicans ist jedoch schwierig, da C. Albicans ist petite negative23, was bedeutet, dass es ohne das mitochondriale Genom nicht überleben kann.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, zu untersuchen, mitochondriale und glykolytische Funktion in C. Albicans ohne die Notwendigkeit, die Mitochondrien zu reinigen. Diese Methode kann auch optimiert werden, um die Auswirkungen der Genmanipulation oder chemische Modulatoren auf mitochondriale und glykolytische Wege in C. Albicansuntersuchen.
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Protocol
Hinweis: Das detaillierte schrittweise Protokoll des Assays ist weiter unten beschrieben und die schematische Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
1. C. Albicans -Stämme und Wachstumsbedingungen
- Wachsen Sie C. Albicans -Stämme in flüssige Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Medium bei 30 °C in einem Inkubator-Shaker über Nacht.
Hinweis: Candida -Stämme als gefrorene Bestände zu erhalten und wachsen auf YPD-Agar (Hefeextrakt 1 %, 2 % Pepton, 2 % Traubenzucker und 2 % Agar).
2. Vorbereitung der Reagenzien
- Der Assay-Medium wie folgt vorbereiten:
- Lösen Sie für die Funktion der Mitochondrien-Assay auf, 1,04 g Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Pulver und 2 g Glukose (2 %) in 90 mL sterilem Wasser und Warm die Medien auf 37 ° C. Passen Sie den pH auf 7,4 mit 5 M NaOH und stellen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit sterilem Wasser.
- Glykolytischen Stress Test 1,04 g RPMI 1640 Pulver allein in 90 mL sterilem Wasser auflösen, die Medien auf 37 ° C warm und den pH-Wert 7,4 passen. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit sterilem Wasser. RPMI 1640 Pulver hat keine Bikarbonat, die entscheidend für die pH-Änderung als Maß für die Glykolyse während des Tests zu überwachen ist.
- Injektion-Verbindungen.
- Bereiten Sie 1 M Glukose Lager in sterilem Wasser und Speicher bei-20 ° C.
- Bereiten Sie 100 mM Oligomycin Lager in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), aliquoten in Kleinmengen und Lagerung bei-20 ° C.
- 100 mM Antimycin A Lager in DMSO, aliquoten in kleinen Mengen zubereiten und Lagerung bei-20 ° C.
- Bereiten Sie 100 mM SHAM (Salicylhydroxamic Säure) Lager in Ethanol, am Tag des Tests.
- 1 M KCN in sterilem Wasser am Tag des Tests vorbereiten.
3. Beschichtung der Assay-Platte mit Poly-D-Lysin (PDL)
Hinweis: Führen Sie alle der folgenden Schritte in eine laminare Kapuze.
- Lösen Sie Poly-D-Lysin in Gewebekultur Grade Wasser zu 50 µg/mL Endkonzentration auf. Mischen Sie es gut und aliquoten in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und langfristig bei-20 ° C lagern.
Hinweis: 50 µL pro Bohrloch wird benötigt, und für 24 Vertiefungen, 1,2 mL erforderlich. Daher Aliquot mindestens 1,3 mL pro Microcentrifuge Schlauch. - Fügen Sie 50 µL pro Bohrloch und mit dem Deckel abgedeckt für 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Aspirieren Sie die Lösung und spülen Sie einmal mit 500 µL steriler Gewebekultur Grade Wasser.
- Öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Brunnen an der Luft trocknen. Verwenden Sie die Platte am gleichen Tag oder Shop bei 4 ° C für maximal 2-3 Tage.
4. die Hydratation der Sensorkassette
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt eines Tages vor dem Experiment.
- Öffnen Sie das extra Flussmittel Assay Kit und entfernen Sie den Inhalt. Setzen Sie die Sensor-Patrone Kopf neben der Dienstprogramm-Platte (Abbildung 2).
- Füllen Sie jeweils gut der Dienstprogramm-Platte mit 1 mL der Kalibrator und legen Sie die Sensor-Steckmodul zurück. Stellen Sie sicher, dass die Sensoren die Fluorophore (um den Sauerstoff und pH-Wert messen) enthalten in der Kalibrator untergetaucht sind.
- Inkubieren Sie der Sensorkassette über Nacht in einem nicht-CO2 -Inkubator bei 37 ° c
5. Anbau und Aussaat Zellen in die PDL-beschichtete Platten
- C. Albicans in der YPD Brühe zu impfen und wachsen über Nacht bei 30 ° C in einem Shaker bei 200 u/min.
Hinweis: Basierend auf das Test-Design und das Interesse, kann C. Albicans auch in YPG oder minimaler Medium gezüchtet werden. - Am Tag des Tests verdünnen Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen im Assay Medium um eine Endkonzentration von 100.000 Zellen pro 100 µL zu erzielen.
- Fügen Sie 100 µL der verdünnten Zellen in jede Vertiefung der Assay-Platte mit Ausnahme von Brunnen A1, B4, C3 und D6, in dem nur 100 µL des Mediums Assay für Hintergrundkorrektur (Abbildung 3) hinzufügen.
- Übertragen Sie die Platte in ein nicht-CO2 -Inkubator bei 37 ° C und inkubieren Sie für 60 min, die die Zellen an der Plattenoberfläche halten lassen.
6. Test-Protokoll
Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll ist für das 24-Well-Format des Instruments. Volumina müssen angepasst werden, wenn ein anderes Format verwendet wird.
- Mitochondriale Funktion assay
- Herstellung von Verbindungen
- Verbindungen bei 10 X-Konzentration für die Funktion der Mitochondrien-Test vorbereiten: bereiten Sie 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100 mM KCN, und 20 µM Antimycin A in der entsprechenden Assay-Medium.
- Fügen Sie 50 µL SHAM in Port A, 55 µL Oligomycin in Port B 62 µL KCN in Port C und 68 µL Antimycin A in Port D (Abbildung 4).
- Herstellung von Verbindungen
- Glykolytischen Stress-Test
- Herstellung von Verbindungen
- Verbindungen bei 10 X-Konzentration für glykolytischen Stress Test vorzubereiten. Bereiten Sie 100 mM Glukose, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-Deoxy Glucose (2DG) und 20 µM Antimycin A in der entsprechenden Assay-Medium.
- Fügen Sie 50 µL Glukose in Port A, 55 µL Oligomycin in Port B 62 µL 2-DG in Port C und 68 µL Antimycin A in Port D.
- Herstellung von Verbindungen
- Beschäftigen Sie zusätzliches Flussmittel Analyzer, der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) und extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR) von lebenden Zellen in einem 24-Well-Platte-Format misst. Richten Sie das Test-Protokoll im Voraus.
- Den zusätzliche Flussmittel Analyzer öffnen und der Assay-Vorlage mithilfe der Registerkarte Assay-Assistent eingerichtet und folgen Sie Schritt für Schritt Anleitung zum ausfüllen, alle Informationen, die während des Setups herausspringt. Generieren der Gruppenlayout als ähnlich wie in Abbildung 5dargestellt. Richten Sie das Protokoll wie in Tabelle 1dargestellt. Diese Layouts gut im Voraus vor Assay einzurichten und auf dem Computer speichern. Zum Zeitpunkt des Tests wiederherstellen Sie das gespeicherte Protokoll durch Öffnen der entsprechenden Datei in der Datei öffnen Option in der Registerkarte Assay-Assistent (Abbildung 5).
- 10 X Verbindungen in den jeweiligen Häfen mit den Kalibrator hydratisiert Sensorkassette laden und laden in das Fach der Träger des zusätzliches Flussmittel Analyzer. Starten Sie die Kalibrierung durch Drücken der Start Taste auf dem Bildschirm.
- Hinzu kommt 350 µL des Mediums Assay sanft Zellplatte entlang der Seite der Brunnen zu Zelle Störungen um 450 µL Endvolumen bringen zu minimieren.
- Ersetzen der Dienstprogramm-Platte mit den Kalibrator mit der Assay-Platte und weiter.
- Der Sensorkassette und der Platte zu entfernen, sobald der Test abgeschlossen ist. Speichern Sie die Datei im entsprechenden Zielordner.
7. die Datenanalyse
- Verwenden Sie die Fläche unter der Kurve - Varianzanalyse (AUC-ANOVA) Registerkarte Analyse in der Software zur Berechnung des wesentlichen Unterschied zwischen den Gruppen durch Auswahl der entsprechenden Parameter (OCR oder ECAR) wie in Abbildung 6dargestellt.
- Wählen Sie die Gruppen, die verglichen werden müssen.
- Die Analysegruppen für die ANOVA hinzu, und klicken Sie auf Ok.
Hinweis: Diese AUC ANOVA-Analyse wird ein neues Blatt der Datei hinzufügen, die AUC berechnet für jede Gruppe und untereinander durch ANOVA verglichen. Dies wird eine Tabelle der p-Werte zeigen die Bedeutung geben.
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Representative Results
Im Mittelpunkt dieses Protokolls ist zu bestimmen, der bioenergetischen Funktionen von C. Albicans durch zusätzliches Flussmittel Analyzer bewertet. Eine mitochondriale Protein Mam33 fehlt C. Albicans -Mutante ist auch zusammen mit seiner Ergänzung Belastung, mam33Δ/Δ::MAM33 Studie zu den Auswirkungen der Löschung eines mitochondrialen Proteins auf OCR und ECAR enthalten. MAM33 kodiert für eine vermeintliche mitochondriale sauren Matrix-Protein und seine Funktion im Candida ist nicht bekannt.
Zellzahlen für zusätzliches Flussmittel assay
Wir beschäftigten 1 x 105 C. Albicans Wildtyp Zellen pro Bohrloch in der Probe, zusätzliches Flussmittel, die eine OCR von 145 Pmol/min (Abbildung 7), zeigte sich im optimalen Bereich von 100-300 Pmol/min für jede extrazelluläre Flux-Assay. Es ist auch wichtig, die Anzahl von Zellen erhalten eine optimale OCR vor der Probe oder wenn es eine Änderung im Wachstum mittlerer Zusammensetzung zwischen verschiedenen Assays titrieren.
Analyse der Daten
Die Fläche unter der Kurve - Varianzanalyse (AUC-ANOVA) Registerkarte Analyse in der Software wurde zur Berechnung der signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen durch Auswahl der entsprechenden Parameter (OCR oder ECAR) wie in Abbildung 7dargestellt. Diese Analyse hinzugefügt ein neues Tabellenblatt die Datei in der die AUC berechnet für jede Gruppe und im Vergleich untereinander durch ANOVA automatisch, die eine Wertetabelle p gab.
Mitochondriale Funktion assay
In den Mitochondrien Stresstest beginnt der Test mit der Messung der basalen Sauerstoff-Verbrauch (OCR), gefolgt von Injektion von Inhibitoren eine Alternative Oxidase (AOX), ATP-Synthase und Elektronentransport-Kette-komplexe, IV und III. Neben den klassischen Atmungskette nutzt C. Albicans auch die AOX-Bahn für Energie Erzeugung24. Daher untersuchten wir die Wirkung des AOX-Systems auf OCR durch Hemmung ihrer Tätigkeit mit Salicylhydroxamic Säure (SHAM)25. Die mitochondriale Funktion, die als eine Sauerstoff-Verbrauchsrate (OCR) in Pmol/min bei basalen und nach der Injektion von jeweiligen Inhibitoren gemessen wurde ist in Abbildung 7dargestellt. Die basalen OCR der wilden Art, mam33Δ/Δ und mam33Δ/Δ::MAM33 Stämme zeigten keine Unterschiede (Abb. 7A und B). In ähnlicher Weise wurde kein signifikanter Unterschied in der basalen ECAR zwischen diesen Stämmen (Abbildung 7C und D) beobachtet. Jedoch nicht durch die Hemmung Komplex IV von KCN, Wildtyp und mam33Δ/Δ::MAM33 zeigte eine deutliche Verlagerung in Richtung der Glykolyse im Gegensatz zu mam33Δ/Δ, die deutlich eine kompensatorische glykolytischen Verschiebung (Abbildung 7 ( E), was darauf hindeutet, dass C-IV abhängige glykolytischen Weg in die mam33Δ/Δ -Mutante im Vergleich zum Wildtyp und mam33Δ/Δ::MAM33 Belastungen beeinträchtigt wird.
Glykolytischen Stress-Test
In den glykolytischen Stresstest Zellen für Glukose für 1 h hungerten und basale OCR und ECAR wurde gemessen. Bei Hunger mam33Δ/Δ zeigte deutlich geringer OCR (Abbildung 8A und B) und ECAR (Abbildung 8C und D) im Vergleich zum Wildtyp und mam33Δ/Δ::MAM33 Stämme vorgeschlagen eine beeinträchtigte Verwertung von Glukose für Atmung und Glykolyse, wenn Zellen in den Hungertod Zustand gezwungen werden. Nach der Injektion von Glukose, zeigten alle Stämme Stimulation von OCR und ECAR. Obwohl Oligomycin weniger Einfluss auf die OCR und ECAR, 2-DG, die als kompetitiver Inhibitor der Glykolyse ist hat, hemmt die OCR und ECAR. 2-DG hemmt spezifisch, teilweise OCR, die weiter von Antimycin A. gehemmt wird 2-DG hemmt dagegen fast vollständig ECAR.
Tabelle 1. Protokollbefehle zum Test
Abbildung 1 . Schematische Darstellung des Experiments Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Sensorkassette (grün) auf dem Kopf stehend in der Nähe der Dienstprogramm-Platte vor dem Hinzufügen der Kalibrator platziert. Fluorophore sind durch Pfeile angedeutet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Zell-Kultur-Platte zeigt Hintergrund Brunnen A1, B4, C3 und D6. Die blaue Markierung zeigt die Kerbe, orientiert sich an der linken unteren Ecke. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Der obere Teil der Sensorkassette zeigen Ports A, B, C und D. Die Pfeilmarkierung zeigt die Kerbe, orientiert sich an der linken unteren Ecke. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Das Layout von Brunnen und Gruppenübung wie in der Software visualisiert. WT - Wildtyp; MT - mam33Δ/Δ Mutant; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 Stamm. zu ergänzen Pfeilmarkierung zeigt die Registerkarte "Datei öffnen" Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Die Fläche unter der Kurve (AUC) ANOVA Registerkarte Analyse die Bedeutung zwischen den Gruppen zu berechnen. Wählen Sie die Gruppen, die müssen verglichen werden und die Analysegruppen für ANOVA hinzufügen und klicken Sie auf ok. Diese AUC ANOVA-Analyse wird ein neues Blatt zu der Datei hinzufügen, in der die AUC ist berechnet für jede Gruppe und untereinander durch ANOVA verglichen. Dies wird eine Tabelle der p-Werte zeigen die Bedeutung geben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7. Mitochondriale Funktion Assay in C. Albicans. Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise wurden in wilden Art, mam33 Δ/Δ, und mam33 Δ/Δ::MAM33 Stämme von C. Albicansgemessen. (A) eine Echtzeit-Grafik des Sauerstoff-Verbrauch (OCR) bei basalen Atmung gefolgt von sequentielle Einspritzung von SHAM (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM) und Antimycin (2 µM). (B) Vergleich der Fläche unter der Kurve (AUC) basale OCR zwischen wilden Art, mam33Δ/Δ und mam33Δ/Δ::MAM33 Stämme von C. Albicans zeigen keinen signifikanten Unterschied. (C) ein Echtzeit-Grafik der extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR) bei basalen Glykolyse gefolgt von sequentielle Einspritzung von SHAM (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM) und Antimycin (2 µM). (D) Vergleich der Fläche unter der Kurve (AUC) basale ECAR zwischen wilden Art, mam33Δ/Δ und mam33Δ/Δ::MAM33 Stämme von C. Albicans zeigen keinen signifikanten Unterschied. (E) Vergleich der Fläche unter der Kurve (AUC) ECAR zwischen wilden Art, mam33Δ/Δ und mam33 Δ/Δ::MAM33 -Sorten von C. Albicans nach der Injektion von C-IV-Hemmer KCN zeigen signifikante Abnahme der glykolytischen Verschiebung in mam33Δ/Δ Mutant im Vergleich zum Wildtyp und ergänzende Stämme Werte werden als durchschnittliche ± Standardfehler Mittelwert angegeben. * p < 0,05, ** p < 0,001 wird durch einfache ANOVA als signifikant betrachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 . Glykolytischen Stress-Test in C. Albicans. Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung wurden gemessen in Wildtyp, mam33Δ/Δ Mutant, nachdem sie für Glukose, gefolgt von akuten Injektion von gesättigten Glukosekonzentration verhungert waren. (A) eine Echtzeit-Grafik des Sauerstoff-Verbrauch nach basal ECAR Zellen ausgesetzt wurden gefolgt von sequentielle Einspritzung von Glukose (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM) und Antimycin (2 µM). (B) Balkendiagramm zeigt die Fläche unter der Kurve ECAR der basalen Glykolyse zwischen wilden Art, mam33Δ/Δ und mam33Δ/Δ::MAM33 Stämme von C. Albicans. (C) ein Echtzeit-Grafik der glykolytischen Funktion nachdem Zellen basale ECAR unterzogen wurden gefolgt von sequentielle Einspritzung von Glukose (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM) und Antimycin (2 µM). (D) Balkendiagramm zeigt die Fläche unter der Kurve ECAR der basalen Glykolyse zwischen Wildtyp, mam33Δ/Δ und mam33Δ/Δ::MAM33 Stämme von C. Albicans Werte als durchschnittliche ± Standardfehler Mittel ausgedrückt werden. * p < 0,05, *** p < 0,0005, *** p < 0,0001 wird durch einfache ANOVA als signifikant betrachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Bioenergetik zusätzliches Flussmittel Assay dient als ein hervorragendes Tool zum Auslesen der mitochondrialen Funktion durch Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) messen-abhängige Sauerstoffverbrauch in Echtzeit. Darüber hinaus kann eine glykolytische Funktion, die als eine extrazelluläre Übersäuerung Rate (Veränderung des extrazellulären pH) gemessen wird auch gleichzeitig in Echtzeit-Analyse untersucht werden.
Erfolgreiche Beschichtung von C. Albicans in der Assay-Platte gehört zu die entscheidenden Schritte in der Probe, da die Inkubation der Zellen in der PDL beschichtete Platten ermöglichen die Zellen an der Assay-Platte halten. Visualisierung von anhaftenden C. Albicans Zellen geschieht durch Lichtmikroskopie. Unsachgemäße Zelladhärenz führen zu Zellen schwebend in den Vertiefungen, die den Assay-Ausgang mit inkonsistenten Lesungen auf Wiederholungen beeinflussen werden. Ebenso ist es wichtig, dass die Zelle Nummer Titration als der erste Schritt in diesem Assay, eine OCR zwischen 100-300 Pmol/min, eine optimale Auswahl ist zu erwirken. Auch ist es auch entscheidend für die Erreichung der optimalen Reaktion, Titrieren Verbindungen um die optimale Konzentration zu erhalten. Dies kann durchgeführt werden, wenn eine Änderung in der basalen mittlerer Zusammensetzung vorliegt.
DMEM ist das am häufigsten verwendete basal Medium in die zusätzliche Flussmittel Assay für Säugerzellen. Jedoch gab RPMI 1640 Medium in unseren Händen, die optimale Ergebnisse mit C. Albicans. Dies war in erster Linie auf die Wirksamkeit der mitochondrialen Elektronentransport-Kette komplexe Inhibitoren, die besser in RPMI 1640 Medium im Vergleich zu DMEM gearbeitet.
In diesem Assay, Wildtyp, dienten die mam33Δ/Δ und mam33Δ/Δ::MAM33 Stämme von C. Albicans die mitochondriale Atmung und glykolytische Effizienz bewerten. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Streichung des MAM33 -Gens die Möglichkeit von C. Albicans reduziert , auf Glykolyse unter Stressbedingungen wie Hemmung der C-IV (Abbildung 7C und 7E) zu verlagern. Ebenso, wenn Zellen Zustand wie Glukose Hunger Stress ausgesetzt waren, mitochondriale Atmung und glykolytische Effizienz erheblich leidet in den mam33Δ/Δ -Mutanten, aber nicht in den Wildtyp und Ergänzung Stämme ( Abbildung 8). Daher können je nach Experimenten, Kohlenstoffquellen RPMI 1640 auch geändert werden, Glycerin oder Galaktose, die die Zellen mit OXPHOS anstatt Glykolyse zwingt.
Die Bedeutung der Verwendung von zusätzlichen Flux-Assay ist, dass durch die Verwendung verschiedener Substrate und Verbindungen, die Funktion der Mitochondrien zu belästigen, die Zellen Fähigkeit, OXPHOS versus Glykolyse nutzen abgeleitet werden kann. Dies kann als ein informatives Tool verwendet werden, um die Wirkung von Behandlungen oder gen auf die Funktion der Mitochondrien und Glykolyse in Candida Albicans zu verstehen, ohne Mitochondrien zu isolieren. Der Test misst basale Sauerstoff-Verbrauch (OCR), ist ein Maß für die mitochondriale Atmung und extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR), die ein Maß für die glykolytischen Funktion in der Anwesenheit von Glukose und nach Glukose verhungern. Zusätzliches Flussmittel zelluläre Assays wird auch in einer Vielzahl von Säugetieren Modelle26eingesetzt. Trotz der medizinischen Bedeutung von C. Albicanswurde Forschung in Pilz Mitochondrien aufgrund des Fehlens von standardisierten experimentelle Verfahren zur Funktion der Mitochondrien und Glykolyse in Echtzeit zu studieren etwas behindert.
Diese Methode bietet eine einfache und bequeme Möglichkeit der Untersuchung die mitochondriale Atmung und glykolytische Effizienz mithilfe von Echtzeit-extrazellulären Flussmittel Assay in C. Albicans. In Zukunft kann dieser Test auch zur Untersuchung der Wirksamkeit von Medikamenten Tests verwendeten Antimykotika wie Fluconazol angewendet werden. Darüber hinaus ist eine weitere mögliche zukünftige Anwendung dieser Methode in der Drogeentdeckung, vor allem für das screening von Verbindungen, die Ausrichtung auf die mitochondriale Funktion von C. Albicans.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Forschung im NC-Editor wird unterstützt durch ein Stipendium der National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 und einen Zuschuss von New Jersey Health Foundation (NJHF), #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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