Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/58913
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,2
1Department of Microbiology, Biochemistry and Molecular Genetics, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Public Health Research Institute, Rutgers, The State University of New Jersey
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול stepwise לחקור את הנשימה מיטוכונדריאלי והתפקוד glycolytic ב קנדידה אלביקנס באמצעות עם מנתח נוסף השטף.

Abstract

המיטוכונדריה הם organelles חיוני כדי להפוך את חילוף החומרים הסלולר הישרדות. מגוון רחב של אירועי מפתח יתקיים המיטוכונדריה, כגון נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות אפופטוזיס. כתוצאה מכך, תפקוד מיטוכונדריאלי הוא דיווח יש תפקיד חשוב סבילות נגד פטריות, התקפה אלימה של פטריות פתוגניים. נתונים עדכניים הובילו גם ההכרה על החשיבות של המיטוכונדריה כמו תורם חשוב בפתוגנזה פטרייתי. למרות החשיבות של המיטוכונדריה בביולוגיה פטרייתי, שיטות מתוקננים כדי להבין את הפונקציה שלה הן מפותחות. כאן, אנו מציגים את הליך ללמוד שיעור צריכת החמצן הבזליים (OCR), מידת הנשימה מיטוכונדריאלי, ו המחירים חוץ-תאית acidification (ECAR), מדד של פונקציית glycolytic אלביקנס ג זנים. השיטה המתוארת במסמך זה ניתן ליישם כל זני Candidaspp. ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה מתאי פטרייתי ללא פגע. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם אישית עבור מעכבי של פונקציית מיטוכונדריאלי זנים אלביקנס ג מסך.

Introduction

זיהומים פטרייתיים פולשנית להרוג מעל 1.5 מיליון אנשים בשנה ברחבי העולם. המספר הזה הוא בעלייה בשל עלייה במספר האנשים החיים עם חסינות פרוץ, לרבות תינוקות קשישים, מוקדמת, השתלת הנמענים, חולי סרטן1. ג אלביקנס הוא הזדמנותית פטריות פתוגניות זה חלק microflora האדם. הוא שוכן גם ומשטחים הרירית של מערכת העיכול כאורגניזם commensal. אלביקנס ג מייצרת מחלה מערכתית קשה אצל אנשים שיש להם ליקויים החיסונית, אשר עברו ניתוח, או מי שטופלו עם קורסים ארוכים של אנטיביוטיקה. הדרגה מינים קנדידה בין הגורמים המובילים שלושה או ארבעה nosocomial מחלות זיהומיות (ניד) ב בני אדם2,3,4,5,6,7. מספר זיהומים קנדידה למחזור הדם העולמי השנתי מוערך ~ 400,000 מקרים, עם בהירושימה המשויך של 46-75%1. התמותה השנתי עקב קנדידה הוא בערך 10,000 בארצות הברית לבדה. היקף ניד הנגרמת על ידי פטריות משתקפת גם הוצאות אסטרונומיות החולה5. בארצות הברית, על הטיפול של זיהומים פטרייתיים פולשנית הוצאות שנתי עולה 2 מיליארד דולר, הוספת זן ענק כבר עומס מערכת הבריאות. כיום, טיפולים נגד פטריות סטנדרטיים זמינים מוגבלות בשל רעילות, תרופתיים נפוץ יותר ויותר, סמים-תרופתיות. לכן, יש צורך דחוף לזיהוי מטרות תרופה נגד פטריות חדש זה יביא באפשרויות טיפול טוב יותר לחולים בסיכון גבוה. עם זאת, הגילוי של תכשירים חדשים על מטרות פטרייתי הוא מסובך כי פטריות פרוקריוטים. זה מאוד מגביל את מספר מטרות ספציפיות פטרייתי סמים.

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המיטוכונדריה הם תורם קריטי לאלימות ולגרימת פטרייתי עמידות לתרופות נגד פטריות מאז המיטוכונדריה חשובים נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות של אפופטוזיס8 ,9,10,11. מטבוליזם glycolytic והן הלא-glycolytic חיוניים להישרדותה של אלביקנס ג המארח בתרבית של12,13,14,15,16. יתר על כן, מספר מוטציות אלביקנס ג חסר חלבונים מיטוכונדריאלי, כגון Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 וכו ' הוכחו להיות פגום בתוך filamentation, גורם חשוב התקפה אלימה של אלביקנס ג17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. בנוסף, המוטנטים האלה הוצגו גם כדי להיות הקלוש של התקפה אלימה במודל של עכברים של המופץ קנדידה17,18,19,20,21 ,22. לפיכך, המיטוכונדריה פטרייתי מייצגים ליעד אטרקטיבי עבור גילוי תרופות. עם זאת, המחקר של פונקציית מיטוכונדריאלי אלביקנס ג הוא מאתגר כי אלביקנס ג פטיט שלילי23, מה שאומר כי זה לא יכול לשרוד בלי גנום מיטוכונדריאלי.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את פונקציית מיטוכונדריאלי, glycolytic אלביקנס ג ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה. ניתן למטב בשיטה זו גם כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציה גנטית או מאפננים כימי על מסלולים מיטוכונדריאלי ו glycolytic ב ג אלביקנס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: פרוטוקול stepwise מפורט וזמינותו היא כמפורט להלן, פרוטוקול סכמטית מוצג באיור1.

1. ג אלביקנס זנים ותנאי גידול

  1. גדלים זנים אלביקנס ג נוזלי בינוני תמצית-Peptone-Dextrose שמרים (YPD) ב- 30 °C ב שייקר אינקובטור בן לילה.
    הערה: לשמור על זנים של קנדידה מניות קפוא ולגדול על אגר YPD (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, דקסטרוז 2% ו- 2% אגר).

2. הכנת נוגדנים

  1. הכן את המדיום assay כדלקמן:
    1. עבור הפונקציה מיטוכונדריאלי assay, לפזר אבקת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) 1.04 g, 2 גרם גלוקוז (2%) 90 מ ל מים סטרילי, חמים התקשורת 37 מעלות צלזיוס. להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 5 M NaOH ובצע את עוצמת הקול 100 מ ל מים סטריליים.
    2. עבור מתח glycolytic assay, להמיס 1.04 גרם אבקת RPMI 1640 לבד במים סטריליים 90 מ ל, לחמם את המדיה 37 ° C ולהתאים את ה-pH ל 7.4. לבצע את עוצמת הקול 100 מ ל מים סטריליים. אבקת RPMI 1640 יש אין ביקרבונט, אשר חיוני לעקוב אחר השינוי pH כאמצעי של גליקוליזה במהלך וזמינותו.
  2. הזרקת תרכובות.
    1. להכין 1 מ' מניות גלוקוז במים סטריליים, חנות ב-20 ° C.
    2. להכין 100 מ מ oligomycin מניות של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), aliquot בכמויות קטנות ולאחסן ב-20 ° C.
    3. להכין מניות A antimycin 100 מ מ של דימתיל סולפוקסיד, aliquot בכמויות קטנות ולאחסן ב-20 ° C.
    4. הכן 100 מ מ שאם המניה (חומצה salicylhydroxamic) אתנול ביום של וזמינותו.
    5. להכין 1 מ' KCN במים סטריליים ביום וזמינותו.

3. ציפוי של צלחת assay עם פולי-D-ליזין (PDL)

הערה: לבצע את כל להלן השלבים ברדס למינריות.

  1. להמיס ליזין פולי-D במים כיתה תרביות רקמה כדי להפוך 50 הריכוז הסופי של µg/mL. לערבב את זה טוב, aliquot לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL ולאחסן ב-20 ° C לטווח ארוך.
    הערה: יש צורך µL 50 לכל טוב, עבור 24 וולס, מ ל 1.2 נדרש. לכן, aliquot לפחות 1.3 mL למחזור microcentrifuge.
  2. הוסף µL 50 לכל טוב, דגירה בטמפרטורת החדר עם המכסה מכוסה במשך 1-2 h.
  3. האחות הפתרון ולשטוף פעם אחת עם 500 µL תרביות רקמה סטרילי כיתה מים.
  4. פותחים את המכסה ולאפשר הבארות מהאוויר היבש. שימוש לצלחת באותו יום או חנות ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר 2-3 ימים.

4. הידרציה של חיישן מחסנית

הערה: לבצע שלב זה יום אחד לפני הניסוי.

  1. פתח את שטף נוספת Assay ערכת ולהסיר את התוכן. מקם את מחסנית חיישן הפוך ליד הלוחית השירות (איור 2).
  2. מלא כל טוב של צלחת השירות עם 1 מ ל calibrant, למקם את חיישן מחסנית בחזרה. ודא החיישנים המכילים fluorophores (כדי למדוד את חמצן ו- pH) הם שקועים את calibrant.
  3. דגירה את המחסנית חיישן בן לילה חממה-CO2 ב 37 º C.

5. זריעת תאי הלוחות מצופים PDL וגדל

  1. לחסן אלביקנס ג במרק YPD ולגדול בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ב שייקר ב 200 סל ד.
    הערה: מבוסס על העיצוב assay, הריבית, אלביקנס ג ניתן גם לגדל YPG או בינונית מזערי.
  2. ביום של assay, לדלל את המספר המתאים של תאים המדיום assay להניב ריכוז סופי של 100,000 תאים לכל 100 µL.
  3. להוסיף 100 µL של התאים מדולל לבאר כל צלחת assay חוץ בארות A1, B4, C3 ו- D6, שבו הוסף רק 100 µL של המדיום assay לתיקון רקע (איור 3).
  4. להעביר את הצלחת חממה-CO2 ב 37 מעלות צלזיוס, תקופת דגירה של 60 דקות, אשר יאפשר את התאים לדבוק פני השטח צלחת.

6. assay פרוטוקול

הערה: פרוטוקול שמפורטות כאן הוא עבור תבנית 24-טוב של המכשיר. אמצעי אחסון יהיה עליך לכוונן אם נעשה שימוש בתבנית אחרת.

  1. וזמינותו של פונקציה מיטוכונדריאלי
    1. הכנת תרכובות
      1. הכנת תרכובות-ריכוז 10 x עבור הפונקציה מיטוכונדריאלי assay: להכין 20 מ מ. המזויפים, 100 מיקרומטר Oligomycin, 100 מ מ KCN, ו- 20 מיקרומטר Antimycin A במדיום assay המתאימים.
      2. להוסיף 50 µL דמה לתוך ה-port A, 55 µL Oligomycin ליציאת B, µL 62 KCN ליציאת C ו- A Antimycin µL 68 ליציאת D (איור 4).
  2. מתח glycolytic assay
    1. הכנת תרכובות
      1. הכנת תרכובות-ריכוז 10 x עבור מתח glycolytic assay. להכין 100 מ מ גלוקוז, 100 מיקרומטר Oligomycin, 500 מ מ 2-Deoxy גלוקוז (2 די. ג'י), 20 מיקרומטר Antimycin A במדיום assay המתאימים.
      2. להוסיף 50 µL גלוקוז לתוך ליציאה A, 55 µL Oligomycin ליציאת ב', 2 µL 62-DG ליציאת C ו- A Antimycin µL 68 ליציאת ד
  3. מעסיקים מנתח השטף נוספת, אשר מודד את קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב חוץ-תאית acidification (ECAR) של תאים חיים בתבנית 24-ובכן צלחת. להגדיר את פרוטוקול assay מראש.
  4. פתח במנתח השטף נוספת, להגדיר את תבנית assay באמצעות הכרטיסיה אשף assay ובצע הדרכה צעד אחר צעד כדי למלא את כל המידע שעובר החוצה במהלך התקנת. ליצור את הפריסה קבוצה כמו דומה המוצג באיור5. להגדיר את הפרוטוקול כפי שמוצג בטבלה 1. להגדיר פריסות אלה מוביל לפני assay ולשמור במחשב. בזמנו של assay, לשחזר את פרוטוקול שנשמרו על-ידי פתיחת הקבצים המתאימים באפשרות ' פתח קובץ ' בכרטיסיה אשף assay (איור 5).
  5. לטעון 10 x תרכובות של היציאות המתאימות של מיכל הדיו חיישן רטוב המכיל את calibrant וטען במגש המוביל של מנתח השטף נוספת. התחל את הכיול על ידי לחיצה על לחצן התחל במסך.
  6. להוסיף 350 µL של המדיום assay בעדינות לצלחת תא לאורך צדי הבארות כדי למזער את ההפרעה תא כדי להביא את עוצמת הקול הסופי 450 µL.
  7. להחליף את הצלחת השירות המכיל את calibrant עם לוחית assay ולהמשיך.
  8. להסיר את מחסנית חיישן את הצלחת עם סיום וזמינותו. שמור את הקובץ הנמצא בתיקיית היעד המתאים.

7. ניתוח נתונים

  1. להשתמש באזור תחת עקומת - השונות (חאן אל-ANOVA) ניתוח לשונית בתוכנה כדי לחשב את ההבדל המשמעותי בין הקבוצות על-ידי בחירת הפרמטרים המתאימים (OCR או ECAR), כפי שמוצג באיור 6.
  2. בחר בקבוצות צריך להשוות.
  3. להוסיף קבוצות ניתוח עבור ANOVA ולחץ על אישור.
    הערה: ניתוח חאן אל ANOVA זה יוסיף גיליון חדש קובץ המכיל חאן אל היא מחושבת עבור כל קבוצה להשוות ביניהם על-ידי ANOVA. זה ייתן טבלה של ערכים p כדי להציג את המשמעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המוקד של פרוטוקול זה היא לקבוע את הפונקציות bioenergetic של ג אלביקנס מוערך על ידי מנתח השטף נוספת. מוטציה אלביקנס ג חסר חלבון מיטוכונדריאלי Mam33 נכלל גם יחד עם זן המשלים שלו, mam33Δ/Δ::MAM33 לחקור את ההשפעות של המחיקה של חלבון מיטוכונדריאלי OCR, ECAR. MAM33 מקודד על חלבון בשם מטריקס חומצי מיטוכונדריאלי, תפקידה ב קנדידה לא ידוע.

מספרי הטלפון הנייד עבור assay השטף נוספת
אנחנו מועסקים עונה 1 פרק 105 ג אלביקנס פראי סוג תאים לכל באר וזמינותו השטף נוספת, אשר הראו OCR של 145 pmol/min (איור 7), אשר נמצא בטווח אופטימלית של 100-300 pmol/min עבור כל assay השטף חוץ-תאית. זה גם חשוב titrate את מספר הטלפון כדי לקבל זיהוי תווים אופטי אופטימלי לפני וזמינותו, או כאשר חל שינוי בהרכב בינוני צמיחה בין מבחני שונות.

ניתוח של נתוני
האזור תחת עקומת - השונות (חאן אל-ANOVA) ניתוח לשונית בתוכנה שימש כדי לחשב את ההבדל המשמעותי בין הקבוצות על-ידי בחירת הפרמטרים המתאימים (OCR או ECAR), כפי שמוצג באיור 7. ניתוח זה להוסיף גיליון חדש קובץ המכיל חאן אל היה מחושב עבור כל קבוצה להשוות ביניהם על-ידי ANOVA באופן אוטומטי, אשר נתן טבלה של ערכים p.

וזמינותו של פונקציה מיטוכונדריאלי
בבדיקת הלחץ מיטוכונדריאלי, וזמינותו מתחיל עם מדידת קצב צריכת החמצן הבזליים (OCR) ואחריו הזרקה של מעכבי של אוקסידאז חלופי (AOX), ATP סינתאז ואת מתחמי שרשרת האלקטרונים תחבורה, IV ו- III. בנוסף שרשרת הנשימה קלאסית, ג אלביקנס מנצל גם מסלול AOX עבור דור אנרגיה24. לכן, אנחנו חקר את ההשפעה של מערכת AOX על OCR על ידי עיכוב פעילות שלה באמצעות חומצה salicylhydroxamic (דמה)25. הפונקציה מיטוכונדריאלי, אשר נמדד כמו שיעור צריכת החמצן (OCR) pmol/min הבזליים, אחרי הזרקת מעכבי בהתאמה מוצג איור7. OCR הבזליים של זני בר סוג, mam33Δ/Δ, ו mam33Δ/Δ::MAM33 הראה אין הבדלים (איור 7A ו- B). באופן דומה, אין הבדל משמעותי הבסיס ECAR נצפתה בין זנים אלו (איור 7C ו- D). עם זאת, על ידי עיכוב הרביעי מורכבים על-ידי KCN, wild type, mam33Δ/Δ::MAM33 הראו שינוי משמעותי לעבר גליקוליזה בניגוד mam33Δ/Δ, אשר באופן משמעותי נכשל להראות משמרת glycolytic לתת פיצוי (איור 7 E), מציע מסלול glycolytic תלויים C-IV הוא לקוי ב mam33Δ/Δ החשבונאי לעומת פראי סוג וללחצים mam33Δ/Δ::MAM33 .

מתח glycolytic assay
במבחן הלחץ glycolytic, תאים הורעב עבור גלוקוז עבור 1 h, OCR את הבסיס ואת ECAR נמדדה. על הרעב, mam33Δ/Δ הראה OCR (איור 8A ו- B), ECAR (איור 8C ו- D) לעומת פראי סוג של זנים mam33Δ/Δ::MAM33 רומז על ניצול לקוי של גלוקוז נמוך משמעותית הנשימה וגם גליקוליזה כאשר תאים נאלצים בתנאי רעב. אחרי הזרקת גלוקוז, הראה זנים כל גירוי של OCR והן ECAR. למרות oligomycin יש פחות השפעה על OCR והן ECAR, 2-די. ג'י, שהוא מעכב תחרותי של גליקוליזה, מעכב OCR והן ECAR. באופן ספציפי, 2-DG חלקית מעכב OCR, אשר בהמשך מעוכב Antimycin א לעומת זאת, 2-DG מעכב כמעט לחלוטין ECAR.

Table 1
טבלה 1. פרוטוקול פקודות עבור וזמינותו

Figure 1
איור 1 . ייצוג סכמטי של הניסוי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . חיישן מחסנית (ירוק) ממוקם הפוך בסמוך הצלחת השירות לפני הוספת את calibrant. Fluorophores הם המסומנים על ידי חצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . תא צלחת תרבות מציג רקע בארות A1, B4, C3 ו- D6. הסימן הכחול מראה את החריץ, אוריינטציה בפינה הימנית התחתונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . בחלק העליון של המחסנית חיישן מציג יציאות A, B, C ו- D סמן החץ מציג את החריץ, אוריינטציה בפינה הימנית התחתונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . הפריסה של קבוצה הקצאה כפי דמיינו בתוכנה בבארות. WT - wild type; MT - mam33Δ/Δ מוטציה; מבנה שכבות-mam33Δ/Δ::MAM33 משלימים זן. סמן החץ מראה הכרטיסיה פתח קובץ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 . האזור תחת הלשונית ניתוח ANOVA עקומה (AUC) כדי לחשב את המשמעות בין הקבוצות- בחר בקבוצות צריך להשוות, להוסיף קבוצות ניתוח עבור ANOVA ולחץ על אישור. ניתוח חאן אל ANOVA זה יוסיף גיליון חדש קובץ המכיל חאן אל היא מחושבת עבור כל קבוצה להשוות ביניהם על-ידי ANOVA. זה ייתן טבלה של ערכים p כדי להציג את המשמעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7. וזמינותו של פונקציה מיטוכונדריאלי ב אלביקנס ג. צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית נמדדו ב זני בר סוג, Δ mam33/Δ, וδ mam33/Δ::MAM33 של ג אלביקנס. א) גרף בזמן אמת של קצב צריכת החמצן (OCR)-נשימה הבזליים ואחריו הזרקה רציפים של דמה (2 מ מ), Oligomycin (10 מיקרומטר), KCN (10 מ מ), Antimycin (2 מיקרומטר). B) השוואה של אזור תחת עקומת (AUC) OCR הבזליים בין זני בר סוג, mam33Δ/Δ, ו mam33Δ/Δ::MAM33 של ג אלביקנס להראות הבדל משמעותי. ג) גרף בזמן אמת של קצב חוץ-תאית acidification (ECAR)-גליקוליזה הבזליים ואחריו הזרקה רציפים של דמה (2 מ מ), Oligomycin (10 מיקרומטר), KCN (10 מ מ), Antimycin (2 מיקרומטר). D) השוואה של השטח מתחת לעקומה ECAR הבזליים (AUC) בין זני בר סוג, mam33Δ/Δ, ו mam33Δ/Δ::MAM33 של ג אלביקנס להראות הבדל משמעותי. ה) השוואה של אזור תחת עקומת (AUC) ECAR בין זני הסוג, mam33Δ/Δ וδ mam33/Δ::MAM33 בר ג אלביקנס לאחר ההזרקה של C-IV מעכב KCN להראות ירידה משמעותית משמרת glycolytic mam33Δ/Δ מוטציה בהשוואה פראי סוג של ערכים משלימים זנים מבוטא הממוצע ± שגיאת התקן אומר. * p < 0.05, * * p < 0.001 נחשב משמעותי על ידי חד-כיווני אנובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8 . מתח glycolytic assay ב ג אלביקנס. צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית נמדדו בסוג הפרוע, מוטציה mam33Δ/Δ אחרי הם היו ברעב עבור גלוקוז ואחריו הזרקה חריפה של ריכוז הגלוקוז רוויים. א) גרף בזמן אמת של קצב צריכת החמצן לאחר התאים היו נתונים ECAR הבזליים ואחריו הזרקת רציפים של גלוקוז (10 מ מ), Oligomycin (1 מיקרומטר), 2-די. ג'י (40 מ מ), Antimycin (2 מיקרומטר). B) בר גרף המציג את השטח מתחת לעקומה ECAR של גליקוליזה הבזליים בין זני בר סוג, mam33Δ/Δ, ו mam33Δ/Δ::MAM33 של ג אלביקנס. גרף הפונקציה glycolytic לאחר התאים היו נתונים הבזליים ECAR בזמן אמת ג) ואחריו הזרקת רציפים של גלוקוז (10 מ מ), Oligomycin (1 מיקרומטר), 2-די. ג'י (40 מ מ), Antimycin (2 מיקרומטר). ד) בר גרף המציג האזור תחת עקומת ECAR של גליקוליזה הבזליים בין פראי סוג, זנים mam33Δ/Δ, ו mam33Δ/Δ::MAM33 של הערכים אלביקנס ג מבוטא הממוצע ± שגיאת התקן אומר. * p < 0.05, * * * p < 0.0005, * * * p < 0.0001 נחשב משמעותי על ידי חד-כיווני אנובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ביואנרגיה השטף נוספת assay משמש כלי מצוין כדי לקרוא את הפונקציה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת זרחון חמצוני (OXPHOS)-צריכת חמצן התלויים בזמן אמת. בנוסף, פונקציה glycolytic, אשר נמדד כמו שיעור חוץ-תאית acidification (שינוי ב- pH חוץ-תאית) יכול ייחקרו גם במקביל בניתוח בזמן אמת.

ציפוי מוצלחת של אלביקנס ג בצלחת assay הוא אחד השלבים הקריטיים וזמינותו בגלל הדגירה של התאים לוחית PDL מצופה לאפשר את התאים לדבוק הצלחת וזמינותו. ויזואליזציה של הקפדה אלביקנס ג תאים מושגת על ידי מיקרוסקופ אור. הדבקות תא לא תקין עלול להוביל תאים צף הבארות, אשר משפיעים על תוצאות assay עם קריאות לא עקביים בין משכפל. בדומה לכך, חשוב לבצע טיטרציה מספר תאים בשלב הראשון ב הזה assay להשיג OCR של בין 100-300 pmol/min, אשר טווח אופטימלי. כמו כן, titrating תרכובות להשגת ריכוז אופטימלי חיוני גם בהשגת התגובה האופטימלית. זה ניתן לבצע בכל פעם שיש שינוי בהרכב בינוני הבזליים.

DMEM הוא המדיום הבזליים הנפוצות ביותר בוזמינותו השטף נוספת עבור בתרבית של תאים. עם זאת, בידיים שלנו, RPMI 1640 בינוני נתן תוצאה אופטימלית עם ג אלביקנס. זה היה בעיקר בשל יעילותם של תחבורה אלקטרון מיטוכונדריאלי שרשרת מעכבי מורכבים זה עבד יותר טוב RPMI 1640 בינוני בהשוואה DMEM.

ב זה וזמינותו, פראי סוג, זני אלביקנס ג mam33Δ/Δ, ו mam33Δ/Δ::MAM33 שימשו כדי להעריך את הנשימה מיטוכונדריאלי ואת יעילות glycolytic. התוצאות מראות בבירור המחיקה של ג'ין MAM33 מופחתת היכולת של אלביקנס ג להסטה גליקוליזה בתנאים סטרס כגון עיכוב של C-IV (איור 7C ו- 7-אי). באופן דומה, כאשר התאים היו נתון להדגיש תנאי כמו גלוקוז הרעבה, נשימה מיטוכונדריאלי ויעילות glycolytic באופן משמעותי נפרצת המוטציה mam33Δ/Δ אך לא פראי סוג וללחצים המשלים ( איור 8). לכן, בהתאם ניסויים, מקורות פחמן בשנת 1640 RPMI ניתן לשינוי גליצרול או גלקטוז, שכופה את התאים כדי להשתמש OXPHOS במקום גליקוליזה.

החשיבות של שימוש וזמינותו השטף נוספת היא כי באמצעות מצעים שונים, תרכובות perturb פונקציה מיטוכונדריאלי, התאים את היכולת לנצל את OXPHOS לעומת גליקוליזה שניתן להסיק. זה עשוי לשמש ככלי אינפורמטיבי כדי להבין את ההשפעה של טיפולים או הגן על הפונקציה מיטוכונדריאלי, גליקוליזה ב קנדידה אלביקנס ללא בידוד המיטוכונדריה. וזמינותו מודד את קצב צריכת החמצן הבזליים (OCR), המהווה מדד של נשימה מיטוכונדריאלי, ושיעור חוץ-תאית acidification (ECAR), אשר הוא מדד של פונקציית glycolytic הן נוכחות של גלוקוז, לאחר הרעבה גלוקוז. וזמינותו סלולרית נוספת השטף הוא מועסק גם במגוון רחב של מודלים בתרבית של26. למרות החשיבות הרפואית של ג אלביקנס, מחקר לתוך המיטוכונדריה פטרייתי יש כבר קצת הקשו בגלל העדר נהלים ניסיוני מתוקננת ללמוד מיטוכונדריאלי פונקציה ו גליקוליזה בזמן אמת.

שיטה זו מספקת דרך קלה ונוחה של חוקרים את הנשימה מיטוכונדריאלי והיעילות glycolytic על-ידי שימוש assay השטף חוץ-תאית בזמן אמת ב אלביקנס ג. בעתיד, זה וזמינותו ויכול להיות מיושם גם ללמוד בדיקות סמים-יעילות בעזרת תבחיני הנפוצות כגון תהליך הזיקוק. בנוסף, יישום אחר פוטנציאל עתידי של שיטה זו היא גילוי סמים, במיוחד לסינון תרכובות מיקוד מיטוכונדריאלי תפקוד אלביקנס ג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

המחקר במעבדה NC נתמך על ידי מענק הלאומי מכונים לבריאות (NIH) R01AI24499 מענק קרן בריאות ניו ג'רזי (NJHF), PC40-18.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning MT50020PB
Antimycin A Sigma A8674
KCN
Mito stress kit Agilent 103015-100
Oligomycin Calbiochem 495455
pH meter Accumet AR20
Phenol red Sigma P5530
Poly-D lysine Sigma P6407
Rotenone Santa cruz 203242
Seahorse XF24 FluxPak Agilent 100850-001
SHAM
Sodium Chloride Amresco  241
Sodium hydroxie pellets J.T Baker 3722
Tissue culture grade water Gibco 1523-0147
XF assay calibrant solution Agilent 100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose Fisher scientific, BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar Sigma A1296
Yeast extract Peptone Glycerol Sigma G2025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
  4. Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
  5. Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
  6. Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
  7. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
  8. Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
  9. Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
  10. Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
  11. Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  12. Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
  13. Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
  14. Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
  15. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
  16. Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
  17. Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
  18. Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
  19. Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
  20. Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
  21. Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
  22. Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
  23. Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
  24. Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
  25. Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
  26. de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).

Tags

רפואה גיליון 145 קנדידה אלביקנס ביואנרגיה חילוף החומרים המיטוכונדריה נשימה צריכת חמצן acidification חוץ-תאית גליקוליזה
ביו-energetics החקירה של <em>קנדידה אלביקנס</em> משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkatesh, S., Chauhan, M., Suzuki,… More

Venkatesh, S., Chauhan, M., Suzuki, C., Chauhan, N. Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58913, doi:10.3791/58913 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter