Summary
Qui, presentiamo un protocollo graduale per studiare la respirazione mitocondriale e la funzione glicolitica in Candida Albicans utilizzando un analizzatore di flusso supplementare.
Abstract
I mitocondri sono organelli essenziali per il metabolismo cellulare e la sopravvivenza. Una varietà di eventi chiave si svolgono nei mitocondri, come la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale è segnalata per svolgere un ruolo importante nella tolleranza al farmaco antifungino e virulenza dei patogeni fungini. Dati recenti hanno anche portato al riconoscimento dell'importanza dei mitocondri come un importante contributo alla patogenesi fungine. Nonostante l'importanza dei mitocondri in biologia fungina, sono scarsamente sviluppati metodi standardizzati per capire la sua funzione. Qui, presentiamo una procedura per studiare il tasso di consumo di ossigeno basale (OCR), una misura della respirazione mitocondriale e tassi di acidificazione extracellulare (ECAR), una misura della funzione glicolitica in ceppi di c. albicans . Il metodo descritto qui può essere applicato per eventuali ceppi Candidaspp. senza la necessità di purificare i mitocondri da cellule fungine intatte. Inoltre, questo protocollo può anche essere personalizzato alla schermata per inibitori della funzione mitocondriale in ceppi di c. albicans .
Introduction
Infezioni fungine invasive uccidono oltre 1,5 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo. Questo numero è in aumento a causa di un aumento del numero di persone che vivono con immunità compromessa, inclusi i neonati prematuri, anziani, destinatari del trapianto e cancro pazienti1. C. albicans è un patogeno opportunista di fungo umano che fa parte della microflora umana. Abita anche le superfici mucose e il tratto gastrointestinale come un organismo commensale. C. albicans produce malattia sistemica grave in persone che hanno deficit immunitari, che hanno subito la chirurgia, o che sono state trattate con lunghi cicli di antibiotici. Il rango di specie di Candida tra le tre cause principali di malattie infettive nosocomiali (NID) in esseri umani2,3,4,5,6,7. Il numero globale annuale delle infezioni da Candida flusso sanguigno è stimata intorno a ~ 400.000 casi, con mortalità associata di 46-75%1. La mortalità annua a causa della candidosi è all'incirca 10.000 negli Stati Uniti da solo. Nella misura del NID causate da funghi si riflette anche nella astronomico spese paziente5. Negli Stati Uniti, la spesa annua per il trattamento di infezioni fungine invasive supera $ 2 miliardi, l'aggiunta di uno sforzo enorme per sistema sanitario già oberati di lavoro. Attualmente, le terapie antifungine standard disponibili sono limitate a causa di tossicità, sempre più diffuso di farmacoresistenza e interazioni farmaco-farmaco. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di identificare nuovi bersagli di farmaco antifungino che si tradurrà in migliori opzioni di trattamento per pazienti ad alto rischio. Tuttavia, la scoperta di nuovi farmaci che agiscono su bersagli fungine è complicata perché i funghi sono eucarioti. Questo limita notevolmente il numero di bersagli farmacologici specifici fungine.
Recenti studi hanno indicato che i mitocondri sono un contributo critico alla virulenza fungina e la tolleranza alle droghe antifungose poiché i mitocondri sono importanti per la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi8 ,9,10,11. Metabolismo glicolitico sia non-glicolitico sono essenziali per la sopravvivenza dei albicans del c. nel mammifero ospite12,13,14,15,16. Inoltre, diversi mutanti di c. albicans carente di proteine mitocondriali, come Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 ecc. sono stati indicati per essere difettoso in filamentazione, un fattore di virulenza importante di albicans del c.17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Inoltre, questi mutanti inoltre sono stati indicati per essere attenuato per virulenza in un modello murino di diffusi candidosi17,18,19,20,21 ,22. Così, i mitocondri fungini rappresentano un obiettivo attraente per la scoperta di nuovi farmaci. Tuttavia, lo studio della funzione mitocondriale in c. albicans è impegnativo, perché c. albicans è petite negativo23, che significa che essa non può sopravvivere senza il genoma mitocondriale.
Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per studiare la funzione mitocondriale e glicolitica a albicans del c. senza la necessità di purificare i mitocondri. Questo metodo può anche essere ottimizzato per studiare l'effetto della manipolazione genetica o modulatori chimici sulle vie mitocondriale e glicolitiche in c. albicans.
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Protocol
Nota: Il protocollo dettagliato e graduale del dosaggio è descritto di seguito, e il protocollo schematico è illustrato nella Figura 1.
1. ceppi di c. albicans e le condizioni di crescita
- Crescono i ceppi di c. albicans in terreno liquido di lievito estratto-Peptone-destrosio (YPD) a 30 °C in un agitatore incubatore durante la notte.
Nota: Mantenere ceppi di Candida come gli stock congelati e crescono sull'agar YPD (1% di Estratto di lievito, 2% di peptone, destrosio di 2% e 2% agar).
2. preparazione dei reagenti
- Preparare il supporto di test come segue:
- Per l'analisi di funzione mitocondriale, sciogliere la polvere di 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g e 2 g di glucosio (2%) in 90 mL di acqua sterile e caldo i media a 37 ° C. Regolare il pH a 7.4 utilizzo 5 M NaOH e portare il volume a 100 mL con acqua sterile.
- Per l'analisi di stress glicolitico, sciogliere 1,04 g polvere di RPMI 1640 sola in 90 mL di acqua sterile, caldo i media a 37 ° C e regolare il pH a 7,4. Portare il volume a 100 mL con acqua sterile. Polvere di RPMI 1640 non ha nessun bicarbonato, che è fondamentale per monitorare il cambiamento di pH come misura della glicolisi durante il dosaggio.
- Composti di iniezione.
- Preparare 1 M brodo di glucosio in acqua sterile e conservare a-20 ° C.
- Preparare 100 mM oligomycin stock in dimetilsolfossido (DMSO), aliquota in piccoli volumi e conservare a-20 ° C.
- 100 mM antimycin A stock in DMSO, aliquota in piccoli volumi di preparare e conservare a-20 ° C.
- Preparare 100 mM SHAM (acido salicylhydroxamic) magazzino in etanolo il giorno del test.
- Preparare 1 M KCN in acqua sterile il giorno del test.
3. rivestimento della piastra dosaggio con poli-D-lisina (PDL)
Nota: Eseguire tutti i passaggi in una cappa laminare qui sotto.
- Sciogliere Poly-D lisina in acqua di grado di coltura del tessuto per ottenere la concentrazione finale di 50 µ g/mL. Mescolare bene e aliquota in una microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-20 ° C per il lungo termine.
Nota: 50 µ l per pozzetto è necessaria, e per 24 pozzetti, sono necessari 1,2 mL. Di conseguenza, aliquota almeno 1.3 mL / tubo del microcentrifuge. - Aggiungere 50 µ l per pozzetto e incubare a temperatura ambiente con il coperchio coperto per 1-2 h.
- Aspirare la soluzione e sciacquare una volta con acqua grado di 500 µ l sterili per coltura.
- Aprire il coperchio e lasciare asciugare i pozzetti per aria. Utilizzare la piastra sullo stesso giorno o conservare a 4 ° C per un massimo di 2-3 giorni.
4. idratazione della cartuccia sensore
Nota: Eseguire questo passaggio un giorno prima dell'esperimento.
- Aprire il flusso supplementare Assay Kit e rimuovere il contenuto. Posizionare la cartuccia sensore testa in giù accanto alla piastra di utilità (Figura 2).
- Riempire ciascun pozzetto della piastra utilità con 1 mL di calibratore ed inserire la cartuccia sensore indietro. Assicurarsi che i sensori contenenti fluorofori (per misurare l'ossigeno e pH) sono sommerse nel calibratore.
- Incubare la cartuccia sensore durante la notte in un non-CO2 in incubatore a 37 ° C.
5. la coltivazione e semina di cellule nelle piastre rivestite con PDL
- Inoculare i albicans del c. nel brodo YPD e crescere durante la notte a 30 ° C in un agitatore a 200 giri/min.
Nota: In base alla progettazione di dosaggio e l'interesse, albicans del c. possono anche essere coltivate in YPG o terreno minimo. - Il giorno del test, diluire un numero adeguato di cellule in medium di analisi per ottenere una concentrazione finale di 100.000 cellule per 100 µ l.
- Aggiungere 100 µ l delle cellule diluite in ciascun pozzetto della piastra saggio tranne che nei pozzetti A1, B4, C3 e D6, in cui aggiungere solo 100 µ l di medium di analisi per la correzione del fondo (Figura 3).
- Il piano di trasferimento per un non-CO2 incubatore a 37 ° C ed incubare per 60 min, che vi permetterà le cellule di aderire alla superficie della placca.
6. protocollo di analisi
Nota: Il protocollo descritto qui è per il formato a 24 pozzetti dello strumento. Volumi dovranno essere corretti se viene utilizzato un altro formato.
- Analisi della funzione mitocondriale
- Preparazione di composti
- Preparare composti alla concentrazione di 10 x per l'analisi di funzione mitocondriale: preparare 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100mm KCN e 20 µM Antimycin A nel medium di analisi corrispondente.
- Aggiungere 50 µ l SHAM in porta A, 55 µ l Oligomycin nella porta B, 62 µ l KCN in porta C e 68 µ l Antimycin A porta D (Figura 4).
- Preparazione di composti
- Analisi di stress glicolitico
- Preparazione di composti
- Preparare composti alla concentrazione di 10 x per l'analisi di stress glicolitico. Preparare 100 mM glucosio, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-deossi glucosio (2DG) e 20 µM Antimycin A nel medium di analisi corrispondente.
- Aggiungere il glucosio di 50 µ l in porta A, 55 µ l Oligomycin nella porta B, 62 µ l 2-DG in porta C e 68 µ l Antimycin A porta D.
- Preparazione di composti
- Impiegano analizzatore di flusso supplementare, che misura il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di cellule vive in un formato di piastra a 24 pozzetti. Impostare il protocollo di dosaggio in anticipo.
- Aprire l'analizzatore di flusso supplementare e impostare il modello di analisi utilizzando la scheda di analisi guidata e seguire passo per passo le istruzioni per compilare tutte le informazioni che fuoriesce durante l'installazione. Generare il layout del gruppo come simile a illustrato nella Figura 5. Impostare il protocollo, come illustrato nella tabella 1. Impostare questi layout ben in anticipo prima del dosaggio e salvare nel computer. Al momento dell'analisi, è necessario ripristinare il protocollo salvato aprendo il file corrispondente nell'opzione Apri file nella scheda di creazione guidata di dosaggio (Figura 5).
- I composti di 10 volte le rispettive porte della cartuccia sensore idrata contenente il calibratore di caricare e caricare nel vassoio portante dell'analizzatore flusso supplementare. Avviare la calibrazione premendo il tasto Start sullo schermo.
- Aggiungere 350 µ l di medium di analisi delicatamente alla piastra cellulare lungo il lato dei pozzetti per ridurre al minimo la dispersione delle cellule per portare il volume finale a 450 µ l.
- Sostituire la piastra di utilità che contiene il calibratore con la piastra di dosaggio e continuare.
- Rimuovere la cartuccia del sensore e la piastra una volta completato il test. Salvare il file nella cartella di destinazione appropriata.
7. analisi dei dati
- Utilizzare l'area sotto la curva - analisi della varianza (AUC-ANOVA) scheda analisi del software per calcolare la differenza significativa tra i gruppi selezionando i rispettivi parametri (OCR o ECAR) come mostrato nella Figura 6.
- Selezionare i gruppi che devono essere confrontati.
- Aggiungere ai gruppi di analisi per ANOVA e fare clic su Ok.
Nota: Questa analisi ANOVA AUC aggiungerà un nuovo foglio del file in cui l'AUC è calcolato per ogni gruppo e rispetto tra di loro mediante ANOVA. Questo vi darà una tabella di valori di p per mostrare il significato.
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Representative Results
Il fuoco di questo protocollo è quello di determinare le funzioni bioenergetiche di albicans del c. valutata dall'analizzatore di flusso supplementare. Un mutante di albicans del c. che mancano della proteina mitocondriale Mam33 inoltre è incluso insieme al relativo sforzo di complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 per studiare gli effetti dell'eliminazione di una proteina mitocondriale su OCR ed ECAR. MAM33 codifica per una proteina di matrice silicea mitocondriale putativo e sua funzione nella Candida non è noto.
Numeri di cellulare per l'analisi di flusso supplementare
Abbiamo impiegato 1 x 105 c. albicans tipo selvaggio cellule per pozzetto nell'analisi di flusso supplementare, che ha mostrato un OCR di pmol/min 145 (Figura 7), che è all'interno della gamma ottima di 100-300 pmol/min per qualsiasi analisi di flusso extracellulare. È anche importante titolare il numero di cellulare per ottenere un OCR ottimo prima del dosaggio, o quando c'è un cambiamento nella composizione media di crescita tra i diversi test.
Analisi dei dati
L'area sotto la curva - analisi della varianza (AUC-ANOVA) scheda analisi del software è stato utilizzato per calcolare la differenza significativa tra i gruppi selezionando i rispettivi parametri (OCR o ECAR) come mostrato nella Figura 7. Questa analisi ha aggiunto un nuovo foglio del file in cui l'AUC è stato calcolato per ogni gruppo e confrontato tra di loro mediante ANOVA automaticamente, che ha dato una tabella di valori di p.
Analisi della funzione mitocondriale
Nel mitocondriale stress test, il test inizia con misura il tasso di consumo di ossigeno basale (OCR) seguito dall'iniezione di inibitori di un'ossidasi alternativa (AOX), trifosfato di adenosina synthase e complessi della catena di trasporto degli elettroni, IV e III. Oltre alla classica catena respiratoria, albicans del c. utilizza anche la via di AOX per generazione di energia24. Di conseguenza, abbiamo studiato l'effetto del sistema AOX su OCR inibendo la sua attività utilizzando salicylhydroxamic acido (SHAM)25. La funzione mitocondriale, che è stata misurata come un tasso di consumo di ossigeno (OCR) in pmol/min al basale e dopo l'iniezione di rispettivi inibitori è illustrata nella Figura 7. L'OCR basale dei ceppi selvatici tipo, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 non hanno evidenziato differenze (Figura 7A e B). Allo stesso modo, nessuna differenza significativa nell'ECAR basale è stata osservata fra questi ceppi (Figura 7C e D). Tuttavia, inibendo il complesso IV di KCN, wild type e mam33Δ/Δ::MAM33 ha mostrato un sostanza spostamento verso la glicolisi in contrasto con mam33Δ/Δ, che significativamente non riuscito a mostrare uno spostamento glicolitico compensativo (Figura 7 E), suggerendo che la via glicolitica dipendente C-IV è alterata nel mutante mam33Δ/Δ rispetto al wild type e ceppi di mam33Δ/Δ::MAM33 .
Analisi di stress glicolitico
Nel test di stress glicolitico, cellule erano affamate di glucosio per 1 h e il basale OCR ed ECAR è stata misurata. Al momento di inedia, mam33Δ/Δ ha mostrato significativamente inferiore OCR (Figura 8A e B) ed ECAR (Figura 8C e D) rispetto al wild-type e mam33Δ/Δ::MAM33 ceppi suggerendo un'utilizzazione alterata del glucosio per la respirazione e la glicolisi quando le cellule sono costretti alla condizione di fame. Dopo l'iniezione di glucosio, tutti i ceppi ha mostrato la stimolazione di OCR e di ECAR. Anche se oligomycin ha meno effetto sulla OCR sia ECAR, 2-DG, che è un inibitore competitivo della glicolisi, inibisce sia OCR ed ECAR. In particolare, 2-DG inibisce parzialmente OCR, che più ulteriormente è inibita da Antimycin A. Al contrario, 2-DG inibisce quasi completamente ECAR.
Tabella 1. Comandi del protocollo per il dosaggio
Figura 1 . Rappresentazione schematica dell'esperimento Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Cartuccia sensore (verde) posizionati capovolti vicino al piatto di utilità prima di aggiungere il calibratore. Fluorofori sono indicati dalle frecce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Cellulari piastra di coltura risultati pozzi sfondo A1, B4, C3 e D6. Il marchio blu indica la tacca, orientata in basso a sinistra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . La parte superiore della cartuccia sensore risultati bocche A, B, C e D. La freccia indica la tacca, orientata in basso a sinistra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Il layout di pozzi e assegnazione del gruppo come visualizzato nel software. WT - tipo selvaggio; MT - mam33Δ/Δ mutante; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 completano il ceppo. La freccia Mostra la scheda Apri file Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . L'area sotto la scheda di analisi ANOVA di curva (AUC) per calcolare il significato tra i gruppi. Selezionare i gruppi che devono essere confrontati e aggiungere ai gruppi di analisi per ANOVA e fare clic su ok. Questa analisi ANOVA AUC aggiungerà un nuovo foglio del file in cui l'AUC è calcolato per ogni gruppo e rispetto tra di loro mediante ANOVA. Questo vi darà una tabella di valori di p per mostrare il significato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 7. Analisi della funzione mitocondriale in Albicans del c.. Consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare sono stati misurati in ceppi selvatici tipo, mam33 Δ/Δ e mam33 Δ/Δ::MAM33 di c. albicans. A) un grafico in tempo reale del tasso di consumo di ossigeno (OCR) a respirazione basale seguita da iniezione sequenziale di SHAM (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM) e Antimycin un (2 µM). B) confronto dell'area sotto la curva (AUC) basale OCR tra ceppi selvatici tipo, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 di c. albicans non mostrato nessuna differenza significativa. C) un grafico in tempo reale del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) al basale glicolisi seguita da iniezione sequenziale di SHAM (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM) e Antimycin un (2 µM). D) confronto dell'area sotto la curva (AUC) ECAR basale tra ceppi selvatici tipo, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 di c. albicans non mostrato nessuna differenza significativa. E) confronto dell'area sotto la curva (AUC) ECAR tra ceppi selvatici tipo, mam33Δ/Δ e mam33 Δ/Δ::MAM33 di albicans del c. dopo l'iniezione di inibitore di C-IV KCN mostrano diminuzione significativa in glicolitico MAIUSC in mam33Δ/Δ mutante rispetto al wild-type e ceppi complementari i valori sono espressi come media ± errore standard media. * p < 0,05, * * p < 0,001 è considerato significativo da One-way ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 . Analisi di stress glicolitico in c. albicans. Consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare sono stati misurati in wild-type, mam33Δ/Δ mutante dopo che essi erano affamati per glucosio seguito da iniezione acuta di concentrazione nel glucosio saturi. A) un grafico in tempo reale del tasso di consumo di ossigeno dopo che le cellule sono state sottoposte a basale ECAR seguita da iniezione sequenziale di glucosio (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM) e Antimycin un (2 µM). B) grafico a barre Mostra l'area sotto la curva ECAR della glicolisi basale tra ceppi selvatici tipo, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 di c. albicans. C) un grafico in tempo reale della funzione glicolitico dopo che le cellule sono state sottoposte a basale ECAR seguita da iniezione sequenziale di glucosio (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM) e Antimycin un (2 µM). D) grafico a barre che mostra l'area sotto la curva ECAR della glicolisi basale tra wild-type, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 ceppi di albicans del c. i valori sono espressi come media ± errore standard media. * p < 0,05, * * * p < 0.0005, * * * p < 0,0001 è considerato significativo da One-way ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La bioenergetica analisi flusso supplementare serve come un ottimo strumento per leggere la funzione mitocondriale misurando la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)-consumo di ossigeno dipendenti in tempo reale. Inoltre, una funzione glicolitica che viene misurata come un tasso di acidificazione extracellulare (cambiamento del pH extracellulare) può anche essere studiata allo stesso tempo nell'analisi in tempo reale.
Placcatura successo di c. albicans nella piastra di dosaggio è uno dei passaggi critici nell'analisi perché l'incubazione delle cellule nelle piastre PDL rivestito permettono alle cellule di aderire alla piastra di dosaggio. Visualizzazione delle cellule aderenti di albicans del c. è compiuta da microscopia chiara. L'adesione cellulare improprio può portare a cellule galleggianti nei pozzetti, che influiranno sul risultato del test con letture incoerenti tra repliche. Allo stesso modo, è importante eseguire la titolazione di numero di cellulare come il primo passo in questa analisi per ottenere un OCR tra 100-300 pmol/min, che è una gamma ottimale. Inoltre, i composti per ottenere la concentrazione ottimale di titolazione è anche fondamentale per raggiungere la risposta ottima. Questo può essere eseguito ogni volta che c'è un cambiamento nella composizione media basale.
DMEM è il mezzo più comunemente usato basale nell'analisi di flusso supplementare per cellule di mammifero. Tuttavia, nelle nostre mani, medium RPMI 1640 ha dato i risultati ottimali con c. albicans. Ciò era principalmente dovuto l'efficacia degli inibitori complessa catena di trasporto mitocondriale dell'elettrone che ha funzionato meglio nel medium RPMI 1640 rispetto al DMEM.
In questo saggio, wild-type, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 ceppi di c. albicans sono stati usati per valutare la respirazione mitocondriale e l'efficienza glicolitico. I risultati mostrano chiaramente che la delezione del gene MAM33 ha ridotto la capacità dei albicans del c. di spostare a glicolisi in condizioni di stress quali inibizione della C-IV (Figura 7C e 7E). Allo stesso modo, quando le cellule sono stati sottoposti allo stress di condizione come la fame di glucosio, sia la respirazione mitocondriale e glicolitica efficienza è significativamente compromessa nel mutante mam33Δ/Δ , ma non nel wild-type e ceppi di complemento ( Figura 8). Pertanto, a seconda esperimenti, fonti di carbonio in RPMI 1640 possono anche essere modificati glicerolo o galattosio, che costringe le cellule a utilizzare OXPHOS, piuttosto che la glicolisi.
L'importanza di usando l'analisi di flusso supplementare è che usando vari substrati e composti che perturbano la funzione mitocondriale, la capacità delle cellule di utilizzare OXPHOS contro glicolisi può essere presupposta. Questo può essere utilizzato come uno strumento informativo per capire l'effetto di eventuali trattamenti o gene sulla funzione mitocondriale e glicolisi in Candida albicans senza isolare i mitocondri. Il test misura tasso di consumo di ossigeno basale (OCR), che è una misura della respirazione mitocondriale, e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che è una misura della funzione glicolitica in entrambi la presenza di glucosio e dopo aver fame di glucosio. L'analisi di flusso extra cellulare è impiegato in una varietà di modelli mammiferi26. Nonostante l'importanza medica di albicans del c., ricerca nei mitocondri fungini è stato un po' ostacolato a causa della mancanza di procedure standardizzate sperimentale per studiare la funzione mitocondriale e glicolisi in tempo reale.
Questo metodo fornisce un modo semplice e conveniente di indagare la respirazione mitocondriale e glicolitica efficienza usando analisi di flusso extracellulare in tempo reale in albicans del c. In futuro, questo test può anche essere applicato per studiare l'efficacia della droga test utilizzando comunemente impiegati antimicotici quali fluconazolo. Inoltre, un altro potenziale futura applicazione di questo metodo è nella scoperta della droga, soprattutto per lo screening di composti funzione mitocondriale dei albicans del c.di targeting.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Ricerca nel laboratorio di NC è sostenuta da una sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e una sovvenzione di New Jersey Health Foundation (NJHF), n #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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