Summary
여기, 선물이 미토 콘 드리 아 호흡 및 Candida Albicans 에 glycolytic 기능 조사 stepwise 프로토콜 추가 유출 분석기를 사용 하 여.
Abstract
미토 콘 드리 아 세포 물질 대사 및 생존을 위한 필수적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아, 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환, apoptosis 등 다양 한 주요 행사 개최. 따라서, 미토 콘 드 리아 기능 장애는 항진균 약물 내성 및 병원 성 곰 팡이의 독성에 중요 한 역할을 보고 됩니다. 최근 데이터는 또한 곰 팡이 병의 중요 한 기여자는 미토 콘 드리 아의 중요성의 인식을 이끌어 냈다. 곰 팡이 생물학에서 미토 콘 드리 아의 중요성에도 불구 하 고 표준화 된 방법의 기능을 이해 하는 가난 하 게 개발 되었다. 여기, 기저 산소 소비 속도 (OCR), 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 및 extracellular 산성화 요금 (ECAR), C. albicans 긴장 glycolytic 기능 측정 연구 절차 선물이. 여기 설명 하는 방법은 그대로 곰 팡이 세포에서 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 긴장 Candidaspp. 어떤에 적용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 또한 사용자 정의할 수 있습니다 C. albicans 긴장에 미토 콘 드리 아 기능 억제제에 대 한 화면으로.
Introduction
침입 균 감염 전세계 1 년 이상의 1.5 백만 명 죽 일. 이 번호는 손상 된 면역, 암 환자1, 이식 받는 사람, 노인, 조기 유아를 포함 하 여 생활 하는 사람들의 숫자에 증가 때문에. C. albicans 는 기회주의적 인간의 곰 팡이 병원 체 인간 microflora의 일부입니다. 그것은 또한 공생 생물으로 점 막 표면 및 위장에 서식. C. albicans 심각한 조직 질병 면역 결핍증, 누가 수술을 받은 또는 누가 항생제의 긴 과정을 함께 취급 하 고 있는 사람들을 생성 합니다. 병원내 감염 증 (NID) 인간2,3,4,5,,67의 상위 3 ~ 4 원인 중 칸디 다 종 차수입니다. 칸디 다 혈 류 량 감염의 연례 글로벌 수 ~ 400000 경우, 46-751의 연결된 mortalities로 추정 된다. 칸디 다 증 때문에 연간 사망률 약 미국 에서만 10, 000입니다. 곰 팡이로 인 한 NID의 범위는 천문 환자 비용5에 반영 됩니다. 미국에서는, 침입 균 감염의 치료에 대 한 연간 비용 $2 십억, 이미 overburdened 의료 시스템을 거 대 한 긴장을 추가 능가 한다. 현재, 사용할 수 있는 표준 항진균 치료 독성, 점점 널리 약물 저항, 및 약물-약물 상호 작용으로 인해 제한 됩니다. 따라서, 고 위험 환자에 대 한 더 나은 치료 옵션 귀 착될 것 이다 새로운 항진균 약물 목표를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다. 그러나, 곰 팡이 목표에 행동 하는 새로운 약물의 발견은 곰 팡이 진핵생물 복잡 합니다. 이 크게 특정 곰 팡이 약물 목표의 수를 제한합니다.
최근 연구는 미토 콘 드리 아는 곰 팡이 독성에 중요 한 기여자 및 항진균 약물에 내성 때문에 미토 콘 드리 아는 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환 및 apoptosis8에 대 한 중요 한 표시 ,9,,1011. Glycolytic 및 비 glycolytic 대사는 포유류 호스트12,,1314,,1516 C. albicans 의 생존을 위해 필수적입니다. 또한, Goa1, 같은 미토 콘 드리 아 단백질 부족 여러 C. albicans 돌연변이 Srr1, Gem1, Sam37 등 표시 되었습니다 filamentation, C. albicans17, 의 중요 한 독성 요소에에서 결함이 있는 것을 18 , 19 , 20 , 21 , 22. 또한, 이러한 돌연변이 또한 독성의 마우스 모델에서 칸디 다17,,1819,20,21 전파에 대 한 감쇠를 표시 했다 ,22. 따라서, 곰 팡이 미토 콘 드리 아 약물 발견에 대 한 매력적인 대상을 나타냅니다. 그러나, C. albicans 에 미토 콘 드리 아 기능 연구는 C. albicans 는 몸집이 작은 부정적인23, 미토 콘 드리 아 게놈 없이 살아남을 수 없다 의미 때문에 도전적 이다.
여기, 우리는 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 C. albicans 에 glycolytic 미토 콘 드리 아 기능을 조사 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 또한 C. albicans에 미토 콘 드리 아와 glycolytic 경로에 유전자 조작 이나 화학 변조기의 효과 조사 하기 위해 최적화할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 분석 결과의 상세한 stepwise 프로토콜은 아래, 설명 하 고 도식 프로토콜 그림 1에 표시 됩니다.
1. C. albicans 긴장 및 성장 조건
- C. albicans 긴장 성장 30 °C에서 인큐베이터 쉐이 커에 액체 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 매체에서 하룻밤.
참고: 냉동된 주식으로 칸디 다 긴장을 유지 하 고 YPD agar (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, 및 2 %agar)에 성장.
2입니다. 시 약의 준비
- 다음과 같이 분석 결과 매체를 준비:
- 미토 콘 드리 아 기능 분석 결과 대 한 해산 1.04 g 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 분말과 포도 당 2 세대 (2%) 90 살 균 물과 따뜻한 37 ° c 미디어 7.4 5 M NaOH를 사용 하 여에 pH를 조정 하 고 메 마른 물 100 mL에는 볼륨을 구성 하.
- Glycolytic 스트레스 분석 결과 대 한 1.04 g RPMI 1640 분말 90 살 균 물 혼자를 분해 하 고 따뜻한 미디어 37 ° C를 pH 7.4에 조정. 멸 균 물 100 mL에 볼륨을 확인 합니다. RPMI 1640 파우더는 중요 한 분석 결과 중 분해의 pH 변화를 모니터링 하는 아무 중 탄산염.
- 사출 화합물입니다.
- 1 M 포도 당 주식 살 균 물에-20 ° c.에가 게를 준비
- 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 작은 볼륨에서 aliquot에 oligomycin 주식 100 mM를 준비 하 고-20 ° c.에 저장
- DMSO, 작은 볼륨에서 aliquot에 100 m m antimycin A 재고를 준비 하 고-20 ° c.에 저장
- 에탄올에 가짜 (salicylhydroxamic 산) 주식 분석 결과 하루에 100 mM를 준비 합니다.
- 분석 결과의 날에 1 M 메 마른 물에 KCN을 준비 합니다.
3. 분석 결과 플레이트와 폴 리-D-라이 신 (PDL)의 코팅
참고: 모든 수행은 층 류 후드에서 단계 아래.
- 50 µ g/mL 최종 농도 만들기 위해 조직 문화 학년 물에 폴 리 D Lysine을 디졸브. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 잘 그리고 aliquot 그것을 혼합 하 고 오랜 기간 동안-20 ° C에서 저장.
참고: 잘 당 50 µ L이 필요, 그리고 24 웰 스, 1.2 mL이 필요. 따라서, microcentrifuge 튜브 당 약 1.3 이상 수 mL. - 잘 당 50 µ L을 추가 하 고 뚜껑을 1-2 h 동안 실 온에서 품 어.
- 솔루션을 발음 하 고 500 µ L 무 균 조직 문화 학년 물으로 한 번 씻어.
- 뚜껑 열고 건조 공기를 우물을 허용 합니다. 같은 날에 4 ° C에 게 접시를 사용 하 여 최대 2-3 일에 대 한.
4입니다. 수 분이 센서 카트리지
참고: 하루는 실험 전에이 단계를 수행 합니다.
- 분석 결과 키트 추가 유출 열고 내용을 제거 합니다. 거꾸로 유틸리티 플레이트 (그림 2) 옆 센서 카트리지를 놓습니다.
- 각 유틸리티 접시의 calibrant의 1 mL와 함께 고 센서 카트리지를 다시 배치 작성. (측정 하기 위해 산소와 pH) fluorophores 포함 하는 센서는 calibrant에 잠긴 다는 것을 확인 하십시오.
- 37 ° c.에 비 CO2 배양 기에서 하룻밤 센서 카트리지를 품 어
5. 성장 및 PDL 코팅 판에 셀 시드
- C. albicans YPD 국물에 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 통에 30 ° C에서 성장.
참고: 분석 결과 설계 및 관심에 따라, C. albicans 수 YPG 또는 최소 매체 또한 성장 수 있다. - 분석 결과의 날, 적절 한 수를 100 µ L 당 100, 000 셀의 최종 농도 분석 결과 중간에 셀의 희석.
- 웰 스 A1, B4, c 3와 D6, 있는 배경 보정 (그림 3)에 대 한 분석 결과 매체의 100 µ L를 추가 제외 하 고 분석 결과 플레이트의 각 음에 희석 셀 100 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° C에서 비 CO2 인큐베이터에 접시를 전송 하 고 플레이트 표면에 고착 하는 세포에 게 할 것 이다 60 분 동안 품 어.
6. 분석 결과 프로토콜
참고: 여기에 설명 된 프로토콜은 악기의 24-잘 형식입니다. 볼륨은 다른 형식이 사용 되 면 조정 해야 합니다.
- 미토 콘 드리 아 기능 분석 결과
- 화합물의 준비
- 미토 콘 드 리아 기능 분석 결과 대 한 10 배 농도에서 화합물을 준비: 20mm 가짜, 100 µ M 준비 Oligomycin, 100 mM KCN, 그리고 해당 분석 결과 매체에서 20 µ M Antimycin A.
- 추가 50 µ L 포트 A, 55 µ L로 가짜 Oligomycin 포트 B, 62 µ L KCN 포트 C와 D의 포트 68 µ L Antimycin A (그림 4).
- 화합물의 준비
- Glycolytic 스트레스 분석 결과
- 화합물의 준비
- Glycolytic 스트레스 분석 결과 대 한 10 배 농도에서 화합물을 준비 합니다. 포도 당, 100 µ M 100 mM를 준비 Oligomycin, 500 m m 2에 의하여 포도 당 (2 DG) 및 해당 분석 결과 매체에서 20 µ M Antimycin A.
- 포트 A, 55 µ L로 50 µ L 포도 추가 C와 포트 D. 68 µ L Antimycin A 포트에 포트 B, 62 µ L 2-DG Oligomycin
- 화합물의 준비
- 여분의 플럭스 분석기, 산소 소비 속도 (OCR)와 24-잘 플레이트 형식에 살아있는 세포의 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 측정을 사용 합니다. 사전에 시험 프로토콜을 설정 합니다.
- 여분의 플럭스 분석기 및 분석 결과 마법사 탭을 사용 하 여 분석 결과 서식 파일 설정 열고 모든 정보를 설치 하는 동안 밖으로 아빠 작성 단계 지시에 따라. 그림 5에 표시 된 유사한 그룹 레이아웃을 생성 합니다. 표 1에 표시 된 대로 프로토콜을 설정 합니다. 분석 결과 전에 잘 앞서 이러한 레이아웃을 설정 하 고 컴퓨터에 저장. 당시 분석 결과, 분석 결과 마법사 탭 (그림 5)에서 파일 열기 옵션에서 해당 파일을 열어서 저장된 프로토콜을 복원 합니다.
- 10 x 화합물 수산화 센서 카트리지를 포함 하는 calibrant의 해당 포트에 로드 하 고 여분의 플럭스 분석기의 캐리어 트레이 로드 하십시오. 화면에서 시작 버튼을 눌러 보정을 시작 합니다.
- 450 µ L를 최종 볼륨을가지고 셀 소요를 최소화 하기 위해 웰 스의 측면을 따라 셀 플레이트를 부드럽게 분석 결과 매체의 350 µ L를 추가 합니다.
- 분석 결과 플레이트 calibrant를 포함 하는 유틸리티 플레이트를 장착 하 고 계속.
- 분석 결과 완료 되 면 센서 카트리지 및 플레이트를 제거 합니다. 적절 한 대상 폴더에 파일을 저장 합니다.
7. 데이터 분석
- 탭의 곡선-분산 분석 (ANOVA AUC) 분석 소프트웨어에서 영역을 사용 하 여 그림 6에서 같이 각 매개 변수 (OCR 또는 ECAR)를 선택 하 여 그룹 간의 중요 한 차이 계산.
- 비교할 필요가 있는 그룹을 선택 합니다.
- ANOVA에 대 한 분석 그룹에 추가 하 고 확인을 클릭 합니다.
참고:이 AUC ANOVA 분석 AUC는 각 그룹에 대 한 계산 고 있는 ANOVA에 의해 그들 사이 비교 파일에 새 시트를 추가 합니다. 이 중요성을 보여 p 값의 표를 줄 것 이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜의 추가 유출 분석기에 의해 평가 되는 C. albicans 의 bioenergetic 기능을 결정 하는. C. albicans 돌연변이 미토 콘 드리 아 단백질 Mam33 부족의 보완 스트레인, OCR 및 ECAR 미토 콘 드리 아 단백질의 삭제의 효과 공부 mam33Δ/Δ::MAM33 함께 포함 되어 있습니다. MAM33 상 상속 미토 콘 드 리아 산 성 매트릭스 단백질 인코딩하고 칸디 다 에 그것의 기능을 알 수 없는 합니다.
핸드폰 번호 추가 유출 분석 결과 대 한
우리는 1 x 105 C. albicans 야생 타입 셀 당 145 pmol/min를 (그림 7), 모든 세포 외 유출 분석 결과 대 한 100-300 pmol/min의 최적 범위는 OCR을 보여 추가 유출 분석 결과에서 잘 고용. 그것은 또한 분석 결과 또는 다른 분석 실험 사이 성장 매체 구성에 변화가 있을 때 최적의 OCR를 셀 수를 적정 하는 것이 중요.
데이터의 분석
탭의 곡선-분산 분석 (ANOVA AUC) 분석 소프트웨어에서 지역 그림 7에서 같이 각 매개 변수 (OCR 또는 ECAR)를 선택 하 여 그룹의 중요 한 차이 계산 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 p 값의 테이블을 했다 있는 AUC는 각 그룹에 대 한 계산 하 고 자동으로, ANOVA에 의해 그들 사이 비교 파일에 새 시트를 추가.
미토 콘 드리 아 기능 분석 결과
미토 콘 드리 아 스트레스 테스트에 분석 결과의 대체 산화 효소 (AOX), ATP synthase, 및 전자 수송 체인 복합물, 4 및 III의 억제제를 주입 하 여 다음 기저 산소 소비 속도 (OCR)을 측정 하 여 시작 합니다. 클래식 호흡기 체인 이외에 C. albicans 는 또한 에너지 세대24AOX 통로 활용합니다. 따라서, 우리는 salicylhydroxamic 산 (가짜)25를 사용 하 여 그것의 활동을 억제 함으로써 OCR에 AOX 시스템의 효과 조사. 미토 콘 드리 아 기능, pmol/min와 그림 7에 나와 각각 억제제를 주입 후 기저에 있는 산소 소비 속도 (OCR)로 측정 했다. 야생 유형, mam33Δ/Δ, 및 mam33Δ/Δ::MAM33 긴장의 기저 OCR (그림 7A와 B) 차이가 나타났다. 마찬가지로, 기저 ECAR에 큰 차이 (그림 7C와 D)이이 긴장 사이 관찰 되었다. 그러나, 야생 유형 및 mam33Δ/Δ::MAM33 mam33Δ/Δ, 달리 분해도 상당한 변화를 보였다 KCN에 의해 복잡 한 IV를 억제 함으로써는 크게 표시 하지 못했습니다 보상 glycolytic 변화 (그림 7 E), C-4 종속 glycolytic 통로 야생 타입 및 mam33Δ/Δ::MAM33 긴장에 비해 mam33Δ/Δ 돌연변이에 손상 하는 것을 건의.
Glycolytic 스트레스 분석 결과
Glycolytic 스트레스 테스트에서 셀은 1 시간에 대 한 포도 당에 대 한 굶 어 하 고 기저 OCR 및 ECAR 측정 되었다. 기아, 시 mam33Δ/Δ 보여 상당히 낮은 OCR (그림 8A와 B) ECAR (그림 8C와 D) 야생 유형 및 포도의 장애인된 이용을 제안 하는 mam33Δ/Δ::MAM33 긴장에 비해 호흡과 분해 세포가 기아 상태에 때. 포도 당 주입 후 모든 긴장 OCR 및 ECAR 자극을 했다. 비록 oligomycin 덜 효과 OCR에 ECAR, 2-DG, 분해의 경쟁적인 억제 물, OCR 및 ECAR 억제. 특히, 2-DG 부분적으로 OCR, 더 Antimycin 저해를 억제합니다 반면, 2-DG는 거의 완전히 ECAR 억제.
표 1입니다. 분석 결과 대 한 프로토콜 명령
그림 1 . 실험의 도식 표현 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 센서 카트리지 (녹색)는 calibrant을 추가 하기 전에 유틸리티 플레이트 근처 거꾸로 배치. Fluorophores 화살표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 셀 A1, B4, c 3와 D6 배경 우물을 보여주는 문화 판. 블루 마크 노치, 왼쪽 하단에 지향을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 포트 A, B, C, D. 보여주는 센서 카트리지의 윗부분 화살표 마크 왼쪽 아래 지향 노치를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 우물 및 그룹 할당으로 소프트웨어에서 시각화 레이아웃. WT-야생 유형; MT- mam33Δ/Δ 돌연변이; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 . 긴장을 보완 화살표 표시 파일 열기 탭 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 그룹 사이 의미를 계산 하기 위해 곡선 (AUC) ANOVA 분석 탭 영역. 비교 및 ANOVA에 대 한 분석 그룹에 추가 하 고 확인을 클릭 하는 그룹을 선택 합니다. 이 AUC ANOVA 분석 AUC는 각 그룹에 대 한 계산 고 있는 ANOVA에 의해 그들 사이 비교 파일에 새 시트를 추가 합니다. 이 중요성을 보여 p 값의 표를 줄 것 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7. 미토 콘 드리 아 기능 분석 결과 C. albicans입니다. 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 C. albicans의 야생 유형, mam33 Δ/Δ, 및 mam33 Δ/Δ::MAM33 긴장에 측정 되었다. 기초 호흡에서 산소 소비 속도 (OCR)의 A)는 실시간 그래프 뒤 가짜 (2mm) Oligomycin의 순차 주사 (10 µ M), KCN (10 m m), 및 Antimycin (2 µ M). C. albicans 의 야생 유형, mam33Δ/Δ, 및 mam33Δ/Δ::MAM33 긴장 사이 곡선 (AUC) 기저 OCR에 지역의 B) 비교 큰 차이 보여줍니다. 가짜 (2mm) Oligomycin의 순차 주사 이어서 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 기저 분해의 A C) 실시간 그래프 (10 µ M), KCN (10 m m), 및 Antimycin (2 µ M). D) 곡선 아래 면적의 비교 (AUC) 기저 ECAR C. albicans 의 야생 유형, mam33Δ/Δ, 및 mam33Δ/Δ::MAM33 긴장 사이 큰 차이 보여줍니다. E) 비교 곡선 (AUC) 야생 유형, mam33Δ/Δ 및 Δ/Δ::MAM33 mam33 긴장 사이 ECAR C. albicans 의 C-4 억제제 KCN의 주입 후에 지역의 mam33Δ/Δ에 glycolytic 변화에 상당한 감소를 보여 돌연변이 야생 타입에 비해 고 보완 종자 값은 평균 ± 표준 오차 평균으로 표시 됩니다. * p < 0.05, * * p < 0.001 일방통행 ANOVA에 의해 중요 한 여겨진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 . Glycolytic 스트레스 분석 결과 C. albicans. 산소 소비와 세포 외 산성화는 야생 타입, mam33Δ/Δ 돌연변이 그들은 포도 당 포화 포도 당 농도의 급성 주입에 의해 다음에 대 한 굶 어 했다 후에 측정 되었다. A) 세포 기저 ECAR 대상이 됐다 후 산소 소비 속도의 실시간 그래프 뒤에 포도 당 (10 mM) Oligomycin의 순차 주사 (1 µ M), 2-DG (40 m m), 및 Antimycin (2 µ M). B) 막대 그래프 곡선 ECAR C. albicans의 야생 유형, mam33Δ/Δ, 및 mam33Δ/Δ::MAM33 긴장 사이 기저 분해의 아래 영역을 보여주는. 후 세포 기저 ECAR 대상이 됐다 glycolytic 함수의 C) A 실시간 그래프 뒤에 포도 당 (10 mM) Oligomycin의 순차 주사 (1 µ M), 2-DG (40 m m), 및 Antimycin (2 µ M). D) 막대 그래프 보여주는 야생 유형 사이 기저 분해의 ECAR 곡선 아래의 영역 mam33Δ/Δ, 및 mam33Δ/Δ::MAM33 긴장의 C. albicans 값 평균 ± 표준 오차 평균으로 표시 됩니다. * p < 0.05, * * * p < 0.0005, * * * p < 0.0001 일방통행 ANOVA에 의해 중요 한 여겨진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
생체 외 유출 분석 결과 산화 인 산화 (OXPHOS)를 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 읽을 수 있는 훌륭한 도구 역할-실시간으로 종속 산소 소비. 또한, extracellular 산성화 속도 (extracellular pH 변화)로 측정 한 glycolytic 기능 또한 실시간 분석에 동시에 조사 수 있습니다.
PDL 코팅 접시에 셀의 인큐베이션 허용 시험 접시에 셀 시험 접시에 C. albicans 의 성공적인 도금 분석 결과에 중요 한 단계 중 하나입니다. C. albicans 세포 접착의 시각화는 가벼운 현미경 검사 법에 의해 수행 됩니다. 잘못 된 셀 준수 셀 사이의 복제 일관성 읽기와 분석 결과 영향을 미칠 것입니다 우물에 떠 있는 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 100-300 pmol/min, 최적의 범위는 사이 OCR를이 분석 결과 첫 번째 단계도 셀 번호 적정을 수행 하는 것이 중요. 또한, 최적의 농도 얻기 위해 화합물 titrating 이기도 최적의 응답을 달성 하는 데 중요 합니다. 이 기저 중간 구성에 변화가 있다 언제 든 지 수행할 수 있습니다.
DMEM은 포유류 세포에 대 한 추가 유출 분석 결과에서 가장 일반적으로 사용 되 기저 매체 이다. 그러나, 우리 손에 RPMI 1640 매체 C. albicans와 최적의 결과 주었다. 이것은 주로 RPMI 1640 매체 DMEM에 비해 더 나은 일 미토 콘 드리 아 전자 수송 체인 복잡 한 억제제의 효능 때문 이었다.
이 분석 결과, 야생 타입, C. albicans 의 mam33Δ/Δ, 및 mam33Δ/Δ::MAM33 변종 미토 콘 드리 아 호흡 및 glycolytic 효율성을 평가 하기 위해 사용 되었다. 결과 명확 하 게 MAM33 유전자의 삭제 C-4 (그림 7C와 7E)의 억제 같은 스트레스 조건 하에서 분해를 이동 하는 C. albicans 의 기능 감소 보여. 마찬가지로, 세포는 포도 당 기아 같은 상태를 스트레스를 복종 되었다 때 미토 콘 드리 아 호흡 및 glycolytic 효율은 크게 손상 mam33Δ/Δ 돌연변이 야생 유형 및 보완 긴장 ( 에만 그림 8). 따라서, 실험에 따라 RPMI 1640에 탄소 소스 또한 글리세롤 또는 갈 락 토스, 힘 세포를 분해 보다는 OXPHOS를 사용 하 여 수정할 수 있습니다.
추가 유출 분석 결과 사용 하 여의 중요성은 그 다양 한 기판 및 미토 콘 드리 아 기능을 교란 하는 화합물을 사용 하 여 셀 분해 대 OXPHOS을 활용 수 추정 될 수 있다. 이 미토 콘 드리 아를 분리 하지 않고 미토 콘 드리 아 기능 및 Candida albicans 에 분해에 어떤 치료 나 유전자의 영향을 이해 하는 유익한 도구로 사용할 수 있습니다. 분석 결과 미토 콘 드리 아 호흡의, 기저 산소 소비 속도 (OCR), 및 extracellular 산성화 속도 (ECAR) glycolytic 함수 모두 존재의 포도 당 및 포도 당 기아 후에 측정 하는 측정 한다. 여분의 플럭스 세포 분석 결과 잘 포유류 모델26의 다양 한에서 채택 된다. 곰 팡이 미토 콘 드리 아 연구 C. albicans의 의학 중요성에도 불구 하 고 다소 되었습니다 미토 콘 드 리아 기능 실시간으로 분해를 공부 하 고 표준화 된 실험 절차의 부족으로 인해 방해.
실시간 세포 외 유출 분석 결과 사용 하 여 미토 콘 드리 아 호흡 및 glycolytic 효율을 조사는 간단 하 고 편리한 방법을 제공 합니다 C. albicans. 미래에,이 분석 결과 fluconazole 등 일반적으로 고용된 antifungals를 사용 하 여 약물 효능 테스트 연구에 적용할 수 있습니다. 또한,이 방법의 또 다른 잠재적인 미래의 응용 프로그램 특히 C. albicans의 미토 콘 드리 아 기능을 대상으로 하는 화합물을 심사에 대 한 약물 발견에는.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
NC 랩에서 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 R01AI24499와 뉴저지 건강 재단 (NJHF) 부여, #PC40-18에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
