Summary
Her presenterer vi en gradvis protokoll for å undersøke mitokondrie åndedrett og glycolytic funksjonen i Candida Albicans bruker en ekstra fluks analyserer.
Abstract
Mitokondrier er viktig organelles for cellenes stoffskifte og overlevelse. En rekke viktige hendelser skje i mitokondrier, som cellular respirasjon, oksidativt metabolisme, signaltransduksjon og apoptose. Følgelig rapporteres mitokondrie dysfunksjon å spille en viktig rolle i soppdrepende narkotika toleranse og virulens av patogene sopp. Nyere data har også ført til anerkjennelse av betydningen av mitokondrier som en viktig bidragsyter til sopp patogenesen. Til tross for betydningen av mitokondrier i fungal biologi, er standardiserte metoder å forstå dens funksjon dårlig utviklet. Her presenterer vi en prosedyre for å studere basale oksygen forbruksraten (OCR), et mål på mitokondrie åndedrett, og ekstracellulære forsuring priser (ECAR), et mål på glycolytic funksjon i C. albicans stammer. Metoden beskrevet her kan brukes på alle Candidaspp. stammer uten å rense mitokondrier fra intakt fungal cellene. Videre denne protokollen kan også tilpasses til skjermen for hemmere av mitokondrie funksjon i C. albicans stammer.
Introduction
Invasiv soppinfeksjoner drepe over 1,5 millioner mennesker hvert år over hele verden. Dette nummeret er på økningen skyldes en økning i antall mennesker med nedsatt immunitet, inkludert eldre, premature spedbarn, transplantasjon mottakere og kreft pasienter1. C. albicans er en opportunistisk menneskelige fungal patogen som er en del av menneskelig mikroflora. Det bor også mucosal overflater og fordøyelsessystemet som en commensal organisme. C. albicans produserer alvorlig systemisk sykdom i folk som har immun mankoen, som har gjennomgått kirurgi eller som har blitt behandlet med lang kurs av antibiotika. Candida arter rangerer blant topp tre til fire årsakene til nosocomial smittsomme sykdommer (NID) i Human2,3,4,5,6,7. Det årlige globale antallet Candida blodbanen infeksjoner er anslått til ~ 400 000 tilfeller med tilknyttede dødelighet 46-75%1. Den årlige dødeligheten på grunn av candidiasis er omtrent 10 000 i USA alene. Omfanget av NID forårsaket av sopp gjenspeiles i astronomiske pasienten utgifter5. I USA overgår årlige kostnaden for behandlingen av invasiv soppinfeksjoner $2 milliarder, legger en enorm belastning til allerede overbelastet helsevesenet. Foreløpig er tilgjengelig standard soppdrepende terapi begrenset på grunn av toksisitet, stadig mer utbredt resistens og narkotika-interaksjoner. Derfor er det et presserende behov for å identifisere nye soppdrepende narkotika mål som fører til bedre behandlingstilbud for høy-risiko pasienter. Oppdagelsen av nye stoffer opptrer på sopp mål er imidlertid komplisert fordi sopp eukaryoter. Dette begrenser sterkt antall sopp-spesifikke narkotika mål.
Nyere studier har indikert at mitokondrier er en viktig bidragsyter til sopp virulens og toleranse soppdrepende narkotika siden mitochondria er viktig for cellular respirasjon, oksidativt metabolisme, signaltransduksjon og apoptose8 ,9,10,11. Både glycolytic og ikke-glycolytic metabolisme er avgjørende for overlevelse av C. albicans i de pattedyr vert12,13,14,15,16. Videre har flere C. albicans mutanter mangler mitokondrie proteiner, slik som Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. vist seg å være defekt i filamentation, en viktig virulens faktor C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. I tillegg disse mutanter ble også vist å dempes for virulens i en musemodell spres candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Dermed representerer fungal mitokondrier et attraktivt mål for medisiner. Imidlertid er studiet av mitokondrie funksjon i C. albicans utfordrende fordi C. albicans er petite negative23, som betyr at det ikke kan overleve uten mitokondrie genomet.
Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å undersøke mitokondrie og glycolytic funksjon i C. albicans uten å rense mitokondrier. Denne metoden kan også optimeres for å undersøke effekten av genetisk manipulasjon eller kjemiske modulatorer på mitokondrie og glycolytic stier i C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Detaljert gradvis protokollen til analysen er beskrevet nedenfor, og skjematisk protokollen er vist i figur 1.
1. C. albicans stammer og vekst betingelser
- Vokse C. albicans stammene i flytende gjær ekstrakt-pepton-druesukker (YPD) medium på 30 °C i en inkubator shaker over natten.
Merk: Opprettholde Candida stammer som frosne aksjer og vokse på YPD agar (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% druesukker og 2% agar).
2. forberedelse av reagenser
- Forbered analysen mediet som følger:
- For mitokondrie funksjonen analysen, oppløse 1.04 g Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pulver og 2 g glukose (2%) i 90 mL sterilt vann og varme media til 37 ° C. Justere pH 7,4 med 5 M NaOH og gjør opp volumet til 100 mL med sterilt vann.
- For glycolytic stress analysen, oppløse 1.04 g RPMI 1640 pulver alene i 90 mL sterilt vann, varme media 37 ° c og justere pH 7,4. Gjør opp volumet til 100 mL med sterilt vann. RPMI 1640 pulver har ingen bikarbonat, som er avgjørende for å overvåke pH endringen som et mål på Glykolysen under analysen.
- Injeksjon forbindelser.
- Forberede 1 M glukose aksjer i sterilt vann og butikk på 20 ° C.
- Forberede 100 mM oligomycin aksjer i dimethyl sulfoxide (DMSO) aliquot i små volumer og lagre på 20 ° C.
- Forberede 100 mM antimycin A lager i DMSO aliquot i små volumer og lagre på 20 ° C.
- Forberede 100 mM HUMBUG (salicylhydroxamic acid) aksjer i etanol ved analysen.
- Forberede 1 M KCN i sterilt vann på dagen til analysen.
3. coating av analysen plate med Poly-D-Lysine (PDL)
Merk: Utføre alle de neden skritt i laminær hette.
- Oppløse Poly-D lysin i vev kultur klasse vann for å gjøre 50 µg/mL siste konsentrasjon. Bland det godt og aliquot inn i en 1,5 mL microcentrifuge rør og lagre på 20 ° C på lang sikt.
Merk: 50 µL per brønn er nødvendig, og 24 brønner, 1,2 mL kreves. Derfor aliquot minst 1,3 mL per microcentrifuge tube. - Legg til 50 µL per brønn og ruge ved romtemperatur med lokk dekket i 1-2 h.
- Sug opp løsningen og skyll én gang med 500 µL sterilt vev kultur klasse vann.
- Åpne lokket og la brønnene til luft tørr. Bruk platen på samme dag eller butikken på 4 ° C for maksimalt 2-3 dager.
4. hydrering av sensoren patron
Merk: Utføre dette trinnet en dag før eksperimentet.
- Åpne ekstra fluks analysen Kit og fjerne innholdet. Plass sensoren kassetten opp ned ved siden av verktøyet platen (figur 2).
- Fyll hver godt av verktøyet plate med 1 mL av calibrant og plasser sensoren kassetten tilbake. Kontroller at sensorer som inneholder fluorophores (for å måle oksygen og pH) senkes i calibrant.
- Inkuber sensor kassetten overnatter i en ikke-CO2 inkubator på 37 ° C.
5. voksende og seeding celler i PDL-belagt plater
- Vaksinere C. albicans i YPD buljong og vokse over natten på 30 ° C i en shaker på 200 rpm.
Merk: Basert på analysen design og interesse, kan C. albicans også dyrkes i YPG eller minimal medium. - På dagen for analysen, fortynne et passende antall celler i analysen medium å gi en endelig konsentrasjon av 100.000 celler per 100 µL.
- Legge til 100 µL utvannet cellene i hver brønn av analysen plate unntatt brønner A1, B4, C3 og D6, som legger bare 100 µL av analysen medium for bakgrunnen korreksjon (Figur 3).
- Overføre platen til en ikke-CO2 inkubator på 37 ° C og ruge for 60 min, som vil la cellene overholder tallerken overflaten.
6. analysen protokollen
Merk: Protokollen skissert her er 24-og formatet på apparatet. Volumer må justeres hvis et annet format.
- Mitokondrielt funksjonen analysen
- Utarbeidelse av forbindelser
- Forberede forbindelser på 10 x konsentrasjonen for mitokondrie funksjonen analysen: forberede 20 mM HUMBUG, 100 µM Oligomycin, 100 mM KCN, og 20 µM Antimycin A i tilsvarende analysen medium.
- Legge til 50 µL HUMBUG i port A, 55 µL Oligomycin til port B, 62 µL KCN til porten C og 68 µL Antimycin A til D-port (Figur 4).
- Utarbeidelse av forbindelser
- Glycolytic stress analysen
- Utarbeidelse av forbindelser
- Forberede forbindelser på 10 x konsentrasjonen for glycolytic stress analysen. Forberede 100 mM glukose, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-Deoxy glukose (2DG) og 20 µM Antimycin A i tilsvarende analysen medium.
- Legge til 50 µL glukose i port A, 55 µL Oligomycin til B, 62 µL 2-DG-port til port C og 68 µL Antimycin A til D.-port
- Utarbeidelse av forbindelser
- Ansette ekstra fluks analyzer, som måler oksygen forbruksraten (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) av levende celler i 24-vel plate format. Definere analysen protokollen på forhånd.
- Åpne ekstra fluks analyzer og sette opp malen analysen ved hjelp av kategorien analysen veiviseren og Følg trinn å fylle ut all informasjon som kommer under installasjonen. Generere gruppe layouten ligner vist i figur 5. Definere protokollen som vist i tabell 1. Definere disse oppsettene fram før analysen og lagre på datamaskinen. På tidspunktet for analysen, gjenopprette lagret protokollen ved å åpne den tilsvarende filen i alternativet åpne filen i kategorien for analysen veiviseren (figur 5).
- Laste den 10 x forbindelser i respektive portene på hydrert sensor patronen inneholder calibrant og laste i bærer skuffen av ekstra fluks analysator. Start kalibreringen ved å trykke Start -knappen på skjermen.
- Legge til 350 µL av analysen medium forsiktig til celle plate langs siden av å minimere celle forstyrrelse å ta det siste bindet til 450 µL.
- Erstatt verktøyet plate inneholder calibrant med analysen platen og fortsette.
- Fjern sensor kassetten og plate når analysen er fullført. Lagre filen i riktig målmappen.
7. dataanalyse
- Bruk området under kurven - analyse av varians (AUC-ANOVA) analyse kategorien i programvaren til å beregne viktige forskjellen mellom gruppene ved å velge de aktuelle parameterne (OCR eller ECAR) som vist i figur 6.
- Velg gruppene som skal sammenlignes.
- Legge til analyse grupper for ANOVA og klikk Ok.
Merk: Denne AUC ANOVA analysen vil legge et nytt ark til filen der AUC beregnes for hver gruppe og forhold mellom dem ved ANOVA. Dette vil gi en tabell med p-verdier for å vise betydningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fokus for denne protokollen er å avgjøre bioenergetisk funksjoner C. albicans vurdert av ekstra fluks analyzer. En C. albicans mutant mangler mitokondrie protein Mam33 er også inkludert sammen med sin supplement belastning, mam33Δ/Δ::MAM33 å studere virkningene av sletting av en mitokondrie protein på OCR og ECAR. MAM33 koder for et antatte mitokondrie surt matrix protein og dens funksjon Candida er ikke kjent.
Cellen tallene for ekstra fluks analysen
Vi ansatt 1 x 105 C. albicans vill type celler per brønn i ekstra fluks analysen, som viste en OCR på 145 pmol/min (figur 7), som er i det optimale området på 100-300 pmol/min for noen ekstracellulære flux analysen. Det er også viktig å sjarmere celle nummer for å få en optimal OCR før analysen eller når det er en endring i vekst medium komposisjon mellom ulike analyser.
Analyse av data
Området under kurven - analyse av varians (AUC-ANOVA) analyse kategorien i programvaren ble brukt til å beregne viktige forskjellen mellom gruppene ved å velge de aktuelle parameterne (OCR eller ECAR) som vist i figur 7. Denne analysen lagt et nytt ark i filen som var AUC beregnet for hver gruppe og forhold mellom dem ved ANOVA automatisk, som ga en tabell med p-verdier.
Mitokondrielt funksjonen analysen
I mitokondrie stress test starter analysen med å måle basal oksygen forbruksraten (OCR) etterfulgt av injeksjon av hemmere av en alternativ oxidase (AOX) og ATP syntase elektronet transport kjeden komplekser, IV og III. I tillegg til den klassiske åndedretts kjeden benytter C. albicans også AOX veien for energi generasjon24. Derfor undersøkt vi effekten av AOX system på OCR begrenser sin virksomhet ved hjelp av salicylhydroxamic acid (HUMBUG)25. Funksjonen mitokondrie, som ble målt som en oksygen forbruksraten (OCR) i pmol/min på basale og etter sprøytebruk respektive hemmere vises i figur 7. Den basale OCR av vill, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer viste ingen forskjeller (figur 7A og B). Tilsvarende ble noen signifikant forskjell i den basale ECAR observert mellom disse stammer (figur 7C og D). Men ved å hemme komplekse IV av KCN, viste et betydelig skifte mot Glykolysen i motsetning til mam33Δ/Δvill type og mam33Δ/Δ::MAM33, som betydelig ikke viser en kompenserende glycolytic Skift (figur 7 E), tyder på at C-IV avhengige glycolytic sti er nedsatt i mam33Δ/Δ mutant sammenlignet med vill type og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer.
Glycolytic stress analysen
I glycolytic stress test, celler var sultet for glukose 1t og de basale OCR og ECAR ble målt. På sult, mam33Δ/Δ viste signifikant lavere OCR (Figur 8A og B) og ECAR (Figur 8C og D) sammenlignet med vill type og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer foreslå en svekket utnyttelse av glukose både åndedrett og Glykolysen når cellene blir tvunget til sult tilstanden. Etter sprøytebruk glukose, viste alle stammer stimulering av både OCR og ECAR. Selv om oligomycin har mindre effekt på både OCR og ECAR, 2-DG, som er en konkurransedyktig inhibitor av Glykolysen, hemmer både OCR og ECAR. 2-DG hemmer spesifikt, delvis OCR, som er videre hemmet av Antimycin A. 2-DG hemmer derimot nesten helt ECAR.
Tabell 1. Protokollen kommandoene for analysen
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av eksperimentet Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Sensoren patron (grønn) plassert opp-ned nær verktøyet platen før du legger til i calibrant. Fluorophores angis med piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Celle kultur plate viser bakgrunnen brønner A1, B4, C3 og D6. Blå merket viser hakket, rettet mot nedre venstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Den øverste delen av sensoren kassetten med porter A, B, C og D. Pil merket viser hakket, rettet mot nedre venstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Oppsettet og Gruppetildelinger som visualisert i programvaren. WT - wild type; MT - mam33Δ/Δ mutant; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 utfyller belastning. Pil merket viser kategorien åpen Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Området under kategorien kurven (AUC) ANOVA analyse til å beregne betydningen mellom gruppene. Velg gruppene som må sammenlignes og legge til analyse grupper for ANOVA og klikk ok. Denne AUC ANOVA analysen vil legge til et nytt ark i filen der AUC beregnes for hver gruppe og forhold mellom dem ved ANOVA. Dette vil gi en tabell med p-verdier for å vise betydningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Mitokondrielt funksjonen analysen i C. albicans. Oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser ble målt i vill, mam33 Δ/Δ, og mam33 Δ/Δ::MAM33 stammer av C. albicans. A) en real-time diagrammet av oksygen forbruksraten (OCR) på basale åndedrett etterfulgt av sekvensiell injeksjon av HUMBUG (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM), og Antimycin en (2 µM). B) sammenligning av området under kurven (AUC) basale OCR mellom wild, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer av C. albicans viser ingen signifikant forskjell. C) A real-time diagrammet ekstracellulære forsuring rate (ECAR) på basale Glykolysen etterfulgt av sekvensiell injeksjon av HUMBUG (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM), og Antimycin en (2 µM). D) sammenligning av området under kurven (AUC) basale ECAR mellom wild, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer av C. albicans viser ingen signifikant forskjell. E) sammenligning av området under kurven (AUC) ECAR mellom wild, mam33Δ/Δ og mam33 Δ/Δ::MAM33 stammer av C. albicans etter injeksjon av C-IV inhibitor KCN viser betydelig reduksjon i glycolytic skift i mam33Δ/Δ mutant sammenlignet med vill type og komplementære stammer verdier blir uttrykt som gjennomsnittlig ± standardfeil. * p < 0,05, ** p < 0,001 regnes som betydelig av veis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 . Glycolytic stress analysen i C. albicans. Oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring ble målt i naturen, mam33Δ/Δ mutant etter at de var sultet for glukose etterfulgt av akutt injeksjon av mettet glukose konsentrasjon. A) en real-time diagrammet av oksygen forbruksraten etter celler ble utsatt for basale ECAR etterfulgt av sekvensiell injeksjon av glukose (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM), og Antimycin en (2 µM). B) stolpediagrammet viser området under kurven ECAR av basale Glykolysen mellom wild, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer av C. albicans. C) A real-time diagrammet glycolytic funksjonen etter celler ble utsatt for basale ECAR etterfulgt av sekvensiell injeksjon av glukose (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM), og Antimycin en (2 µM). D) stolpediagrammet viser området under kurven ECAR av basale Glykolysen mellom wild type, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer av C. albicans verdiene uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardfeil. * p < 0,05, *** p < 0,0005, *** p < 0,0001 regnes som betydelig av veis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bioenergi ekstra fluks analysen fungerer som et utmerket verktøy for å lese ut funksjonen mitokondrie ved å måle oxidative fosforylering (OXPHOS)-avhengige oksygenforbruk i sanntid. I tillegg kan en glycolytic funksjon som måles som en ekstracellulære forsuring rate (endre i ekstracellulære pH) også undersøkes samtidig i sanntid analyse.
Vellykket plating av C. albicans i analysen platen er en av de viktige trinnene i analysen fordi inkubasjonstiden for cellene i PDL belagt plater at cellene å følge analysen platen. Visualisering av overholde C. albicans celler oppnås ved * lys. Overholdelse av uriktig cellen kan føre til celler flytende i brønnene, som vil påvirke analysen utfallet med inkonsekvente målinger mellom gjentak. Tilsvarende er det viktig å utføre celle nummer titrering som første trinn i denne analysen vil ha en OCR mellom 100-300 pmol/min, som er et optimalt spekter. Også er titrating forbindelser for å få optimal konsentrasjon også kritisk for å oppnå optimal respons. Dette kan utføres når det er en endring i den basale medium komposisjonen.
DMEM er det mest brukte basale mediet ekstra fluks analysen for pattedyrceller. Men i våre hender ga RPMI 1640 medium de optimale resultatene med C. albicans. Dette skyldtes hovedsakelig effekten av mitokondrie elektronet transport kjeden komplekse hemmere som fungerte bedre i RPMI 1640 medium i forhold til DMEM.
I denne analysen, wild type, ble mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer av C. albicans brukt til å vurdere mitokondrie åndedrett og glycolytic effektivitet. Resultatene viser tydelig at sletting av MAM33 genet redusert evne til C. albicans å skifte til Glykolysen under stress forhold som hemming av C-IV (figur 7C og 7E). Tilsvarende når celler ble utsatt for stress tilstand som glukose sult, er både mitokondrie åndedrett og glycolytic effektivitet betydelig svekket i mam33Δ/Δ mutant men ikke i det vill type og supplement stammer ( Figur 8). Derfor avhengig av eksperimenter, kan karbon kilder i RPMI-1640 også endres til glyserol eller galaktose, som tvinger cellene å bruke OXPHOS i stedet for Glykolysen.
Betydningen av bruker ekstra fluks analysen er at ved å bruke ulike underlag og forbindelser som forurolige mitokondrie funksjon, celler muligheten til å utnytte OXPHOS versus Glykolysen kan konkluderes. Dette kan brukes som en informativ verktøy for å forstå effekten av behandlinger eller genet på mitokondrie funksjonen og Glykolysen i Candida albicans uten isolere mitokondrier. Analysen måler basale oksygen forbruk sats (OCR), som er et mål på mitokondrie åndedrett, og ekstracellulære forsuring rate (ECAR), som er et mål på glycolytic funksjonen i begge tilstedeværelsen av glukose og etter glukose sult. Ekstra fluks mobilnettet analysen er også ansatt i en rekke pattedyr modeller26. Til tross for medisinsk betydningen av C. albicans, har forskning fungal mitokondrier vært noe hemmet skyldes mangel på standardisert eksperimentelle prosedyrer mitokondrie funksjon og Glykolysen i sanntid.
Denne metoden gir en enkel og praktisk måte å undersøke mitokondrie åndedrett og glycolytic effektivitet ved hjelp av sanntids ekstracellulære flux analysen i C. albicans. I fremtiden kan denne analysen også brukes for å studere narkotika-effekt testing bruker ofte ansatt antifungals som fluconazole. Dessuten er en annen potensiell fremtidig anvendelse av denne metoden i stoffet funnet, spesielt for screening forbindelser målretting mitokondrie funksjon C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Forskning i NC lab støttes av National Institutes of Health (NIH) stipend R01AI24499 og New Jersey Health Foundation (NJHF) stipend, #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
