Summary
Aqui, apresentamos um protocolo gradual para investigar a respiração mitocondrial e função glicolítico em Candida Albicans usando um analisador de fluxo extra.
Abstract
As mitocôndrias são organelas essenciais para o metabolismo celular e a sobrevivência. Uma variedade de eventos chaves ocorrem nas mitocôndrias, tais como a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose. Por conseguinte, disfunção mitocondrial é relatada para desempenhar um papel importante na tolerância de droga antifúngica e virulência de fungos patogênicos. Dados recentes também levaram ao reconhecimento da importância das mitocôndrias como um contribuinte importante para a patogênese fúngica. Apesar da importância das mitocôndrias em biologia de fungosa, métodos padronizados para entender sua função estão pouco desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento para estudar a taxa de consumo de oxigênio basal (OCR), uma medida da respiração mitocondrial e taxas de acidificação do extracelular (ECAR), uma medida da função glicolítico em cepas de c. albicans . O método aqui descrito pode ser aplicado a qualquer Candidaspp. tensões sem a necessidade de purificar a mitocôndria das células fúngicas intactas. Além disso, esse protocolo também pode ser personalizado para triagem de inibidores da função mitocondrial em cepas de c. albicans .
Introduction
Infecções fúngicas invasivas matam mais 1,5 milhões de pessoas por ano em todo o mundo. Este número está a aumentar devido ao aumento do número de pessoas que vivem com imunidade comprometida, incluindo os idosos, prematuros bebês, transplantados e pacientes de câncer1. C. albicans é um patógeno oportunista de fungo humano que faz parte da microflora humana. Habita também superfícies mucosas e do trato gastrointestinal como um organismo comensal. C. albicans produz doença sistêmica grave em pessoas que têm deficiências imunitárias, que se submeteram à cirurgia, ou que tenham sido tratados com longos cursos de antibióticos. A classificação de espécies de Candida entre as causas de topo três ou quatro das doenças infecciosas nosocomiais (NID) em seres humanos,2,3,4,5,6,7. O número global anual de infecções da corrente sanguínea por Candida é estimado em ~ 400.000 casos, com mortalidade associada de 46-75%1. A mortalidade anual por causa da candidíase é aproximadamente 10.000 nos Estados Unidos sozinho. A extensão do NID causada por fungos também se reflete em gastos astronômicos de paciente5. Nos Estados Unidos, a despesa anual para o tratamento de infecções fúngicas invasivas supera US $ 2 bilhões, adicionando um esforço enorme para o sistema de saúde já sobrecarregado. Atualmente, terapias antifúngicas padrão disponíveis são limitadas por causa da resistência a drogas cada vez mais prevalente, toxicidade e interações medicamentosas. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar novos alvos de drogas antifúngicas que resultarão em melhores opções de tratamento para pacientes de alto risco. No entanto, a descoberta de novas drogas atuando em alvos fúngicos é complicada, porque os fungos são eucariontes. Isto grandemente limita o número de alvos de drogas de fungos específicos.
Estudos recentes têm indicado que as mitocôndrias são um contribuinte crítico para a virulência de fungo e tolerância às drogas antifúngicas, desde que as mitocôndrias são importantes para a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico e não-glicolíticas são essenciais para a sobrevivência de c. albicans no hospedeiro mamífero12,13,14,15,16. Além disso, vários mutantes de c. albicans , falta de proteínas mitocondriais, tais como Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc foram mostrados para ser defeituoso em filamentação, um factor de virulência importante de c. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Além disso, esses mutantes também foram mostrados para ser atenuado para virulência em um modelo do rato disseminada candidíase17,18,19,20,21 ,22. Assim, fungosas mitocôndrias representam um alvo atraente para a descoberta da droga. No entanto, o estudo da função mitocondrial em c. albicans é um desafio porque c. albicans é petite negativo23, que significa que não pode sobreviver sem o genoma mitocondrial.
Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para investigar a função mitocondrial e glicolítico em c. albicans , sem a necessidade de purificar as mitocôndrias. Esse método também pode ser otimizado para investigar o efeito da manipulação genética ou moduladores químicos sobre vias mitocondriais e glicolíticas em c. albicans.
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Protocol
Nota: O protocolo detalhado passo a passo do ensaio é descrito abaixo, e o protocolo esquemático é mostrado na Figura 1.
1. cepas de c. albicans e condições de crescimento
- Crescem as cepas de c. albicans em meio de levedura extrato-peptona-Dextrose (YPD) líquido a 30 °C em um shaker incubadora durante a noite.
Nota: Manter cepas de Candida como estoques congelados e crescem em ágar YPD (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, glicose 2% e 2% de ágar).
2. preparação dos reagentes
- Prepare o doseamento da seguinte forma:
- Para o ensaio da função mitocondrial, dissolver o pó de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g e 2G glicose (2%) em 90 mL de água estéril e morna a mídia a 37 ° C. Ajustar o pH para 7,4 usando 5 M de NaOH e perfazer o volume a 100 mL com água estéril.
- Para o ensaio do stress glicolítico, dissolver 1,04 g RPMI 1640 pó sozinho em 90 mL de água estéril, aquecer a mídia a 37 ° C e ajustar o pH para 7,4. Perfazer o volume a 100 mL com água estéril. RPMI 1640 pó tem sem bicarbonato de sódio, que é fundamental para acompanhar a mudança de pH como uma medida da glicólise durante o ensaio.
- Compostos de injeção.
- Preparar o estoque de glicose 1m em água estéril e loja a-20 ° C.
- Preparar 100 mM oligomicina estoque em dimetilsulfóxido (DMSO), alíquota em pequenos volumes e armazenar a-20 ° C.
- Preparar 100 mM antimycin A stock em DMSO, alíquota em pequenos volumes e armazenar a-20 ° C.
- Prepare 100 mM estoque SHAM (ácido salicylhydroxamic) em etanol no dia do ensaio.
- Prepare 1 M KCN em água estéril no dia do ensaio.
3. revestimento da placa de ensaio com poli-lisina-D (PDL)
Nota: Executar todas as etapas em uma capa laminar abaixo.
- D poli lisina em água de grau de cultura de tecido para fazer a concentração final de 50 µ g/mL, dissolva. Misturar bem e a alíquota para um tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e armazenar a-20 ° C para o longo prazo.
Nota: 50 µ l por alvéolo é necessária, e para 24 poços, 1,2 mL é necessária. Portanto, alíquota pelo menos 1,3 mL por tubo de microcentrifugadora. - Adicionar 50 µ l por bem e incubar a temperatura ambiente, com a tampa coberta por 1-2 h.
- Aspirar a solução e lave uma vez com 500 µ l cultura de tecido estéril grau de água.
- Abra a tampa e permitir que os poços ao ar seco. Use a placa no mesmo dia ou loja a 4 ° C por um período máximo de 2-3 dias.
4. hidratação do cartucho de sensor
Nota: Execute esta etapa um dia antes do experimento.
- Abra o fluxo extra Kit de ensaio e remover o conteúdo. Coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilitário (Figura 2).
- Encha cada um bem da placa utilitário com 1 mL de calibrant e coloque o cartucho de sensor de volta. Assegure-se de que os sensores que contêm fluorophores (para medir o oxigênio e pH) estão submersos no calibrant.
- Incubar o cartucho do sensor durante a noite em uma incubadora não-CO2 a 37 ° C.
5. crescimento e propagação de células nas placas de PDL-revestido
- Inocular a c. albicans no caldo YPD e crescer durante a noite a 30 ° C, em uma coqueteleira a 200 rpm.
Nota: Com base no design do ensaio e o interesse, c. albicans também pode ser cultivada em YPG ou meio mínimo. - No dia do ensaio, dilua um número adequado de células no meio de ensaio para produzir uma concentração final de 100.000 células por 100 µ l.
- Adicione 100 µ l de células diluídas em cada poço da placa de ensaio, exceto poços A1, B4, C3 e D6, na qual adicionar apenas 100 µ l do meio de ensaio para correcção de fundo (Figura 3).
- Transferir a placa para uma incubadora não-CO2 a 37 ° C e incubar por 60 min, que vai deixar as células aderem à superfície da placa.
6. protocolo do ensaio
Nota: O protocolo descrito aqui é para o formato de 24-poço do instrumento. Volumes precisará ser ajustada se outro formato for usado.
- Ensaio de função mitocondrial
- Preparação de compostos
- Preparar compostos na concentração de x 10 para o ensaio da função mitocondrial: preparar 20 mM SHAM, 100 µM oligomicina, KCN, de 100 mM e 20 µM Antimycin no meio de ensaio correspondente.
- Adicionar 50 µ l de Souza para o porto A, 55 µ l oligomicina na porta B, 62 µ l KCN a porta C e 68 µ l Antimycin A porta D (Figura 4).
- Preparação de compostos
- Ensaio de stress glicolítico
- Preparação de compostos
- Prepare compostos na concentração de x 10 para o ensaio do stress glicolítico. Preparar 100 mM de glicose, 100 µM oligomicina, 500 mM 2-Deoxy glicose (DG-2) e 20 µM Antimycin no meio de ensaio correspondente.
- Adicionar 50 glicose µ l para o porto A, 55 µ l oligomicina na porta B, 62 µ l 2-DG a porta C e 68 µ l Antimycin A porta D.
- Preparação de compostos
- Emprega o analisador de fluxo extra, que mede a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação do extracelular (ECAR) de células vivas em um formato de placa 24. Configure o protocolo de ensaio com antecedência.
- Abra o analisador de fluxo extra e configure o modelo de ensaio usando a guia Assistente de ensaio e siga as instruções passo a passo para preencher todas as informações que aparece durante a instalação. Gere o layout de grupo como semelhante ao mostrado na Figura 5. Configurar o protocolo, como mostrado na tabela 1. Definir esses layouts bem à frente antes do ensaio e salvar no computador. Na época do ensaio, restaure o protocolo salvo, abrindo o arquivo correspondente na opção Abrir arquivo na guia Assistente de ensaio (Figura 5).
- Carregar os compostos de 10x nos respectivos portos do cartucho sensor hidratado contendo o calibrant e carregar na bandeja do analisador fluxo extra do portador. Inicie a calibração pressionando o botão Start na tela.
- Adicione lentamente a 350 µ l do meio de ensaio para a placa de células ao longo do lado dos poços para minimizar a perturbação da célula para o volume final para 450 µ l.
- Substitua a placa de utilitário que contém o calibrant com a placa de ensaio e continuar.
- Remova o cartucho do sensor e a placa quando o ensaio for concluído. Salve o arquivo na pasta de destino apropriado.
7. análise de dados
- Use a área sob a curva - análise de variância (ANOVA-AUC) análise guia no software para calcular a diferença significativa entre os grupos, selecionando os respectivos parâmetros (OCR ou ECAR) conforme mostrado na Figura 6.
- Selecione os grupos que precisam ser comparados.
- Adicionar para os grupos de análise para ANOVA e clique Okey.
Nota: Esta análise de AUC ANOVA irá adicionar uma nova folha para o arquivo no qual o AUC é calculado para cada grupo e comparado entre eles por ANOVA. Isto dará uma tabela dos valores de p para mostrar o significado.
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Representative Results
O foco do presente protocolo é para determinar as funções bioenergética de c. albicans avaliados pelo analisador de fluxo extra. Um mutante de c. albicans , falta proteína mitocondrial Mam33 também está incluído, juntamente com a sua estirpe de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para estudar os efeitos da exclusão de uma proteína mitocondrial em OCR e ECAR. MAM33 codifica para uma proteína putativa matriz mitocondrial de ácidos e sua função na Candida não é conhecida.
Números de telemóvel para ensaio de fluxo extra
Utilizamos 1 x 105 células de c. albicans tipo selvagem por alvéolo no ensaio de fluxo extra, que mostrou um OCR de 145 de pmol/min (Figura 7), que está dentro da faixa ideal de 100-300 pmol/min para qualquer ensaio de fluxo extracelular. É igualmente importante que titula-se o número de celular para obter uma óptima OCR antes do ensaio, ou quando há uma mudança na composição média de crescimento entre diferentes ensaios.
Análise de dados
A área sob a curva - análise de variância (ANOVA-AUC) análise guia no software foi utilizada para calcular a diferença significativa entre os grupos, selecionando os respectivos parâmetros (OCR ou ECAR) conforme mostrado na Figura 7. Esta análise adicionou uma nova folha para o arquivo no qual o AUC foi calculado para cada grupo e comparado entre eles por ANOVA automaticamente, que deu uma tabela de valores p.
Ensaio de função mitocondrial
No teste de estresse de mitocondrial, o ensaio começa com medição da taxa de consumo de oxigênio basal (OCR) seguido por injeção de inibidores de uma oxidase alternativa (AOX), ATP sintase e complexos da cadeia de transporte de elétrons, IV e III. Além da clássica cadeia respiratória, c. albicans também utiliza o caminho AOX para geração de energia24. Portanto, nós investigamos o efeito do sistema AOX em OCR inibindo sua atividade usando salicylhydroxamic ácido (SHAM)25. A função mitocondrial, o que foi medida como uma taxa de consumo de oxigênio (OCR) em pmol/min no basal e após a injeção de inibidores respectivos é mostrada na Figura 7. O OCR basal de estirpes selvagens tipo, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 não mostrou nenhuma diferença (Figura 7A e B). Da mesma forma, nenhuma diferença significativa entre o basal ECAR foi observada entre estas linhagens (Figura 7C e D). No entanto, inibindo o complexo IV por KCN, tipo selvagem e mam33Δ/Δ::MAM33 mostraram uma mudança substancial para a glicólise em contraste com mam33Δ/Δ, que significativamente não conseguiram mostrar um turno glicolítico compensatório (Figura 7 E), sugerindo que via glicolítico dependente de C-IV é prejudicada em mutante em relação ao tipo selvagem e estirpes de mam33Δ/Δ::MAM33 mam33Δ/Δ .
Ensaio de stress glicolítico
No teste de estresse glicolítico, células estavam sedentos de glicose por 1h e o OCR basal e ECAR foi medido. Com fome, mam33Δ/Δ mostrou significativamente menor OCR (Figura 8A e B) e ECAR (Figura 8C e D) comparado ao tipo selvagem e estirpes de mam33Δ/Δ::MAM33 , sugerindo uma utilização deficiente de glicose para tanto, a respiração e glicólise quando as células são forçadas à condição de fome. Após a injeção de glicose, todas as estirpes mostraram estimulação de OCR e ECAR. Embora oligomicina tem menos efeito sobre ambos OCR e ECAR, 2-DG, que é um inibidor competitivo da glicólise, inibe tanto OCR e ECAR. Especificamente, 2-DG inibe parcialmente o OCR, que é ainda mais inibido por Antimycin A. Em contraste, 2-DG inibe quase completamente ECAR.
Tabela 1. Comandos do protocolo para o ensaio
Figura 1 . Representação esquemática da experiência clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Cartucho de sensor (verde) colocados de cabeça para baixo, perto da placa do utilitário antes de adicionar o calibrant. Fluorophores são indicados pelas setas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Celular placa de cultura mostrando poços de fundo A1, B4, C3 e D6. A marca azul mostra o entalhe, orientado para o canto inferior esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . A parte de cima do cartucho sensor mostrando portas A, B, C e D. O símbolo da seta mostra o entalhe, orientado para o canto inferior esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . O layout dos poços e atribuição do grupo como visualizado no software. WT - tipo selvagem; MT - mam33Δ/Δ mutante; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 complementar estirpe. Símbolo da seta mostra na guia Abrir arquivo por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . A área sob a guia de análise ANOVA curva (AUC) para calcular a significância entre os grupos. Selecione os grupos que precisam ser comparados e adicione os grupos de análise para ANOVA e clique okey. Esta análise AUC ANOVA irá adicionar uma nova folha para o arquivo no qual o AUC é calculado para cada grupo e comparado entre eles por ANOVA. Isto dará uma tabela dos valores de p para mostrar o significado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Ensaio de função mitocondrial em C. albicans. Consumo de oxigênio e a acidificação do extracelular tarifas foram medidas em estirpes selvagens tipo, mam33 Δ/Δ e mam33 Δ/Δ::MAM33 de c. albicans. A) um gráfico em tempo real da taxa de consumo de oxigênio (OCR) na respiração basal seguido de injeção sequencial de SHAM (2 mM), oligomicina (10 µM), KCN (10 mM) e Antimycin um (2 µM). B) comparação da área sob a curva (AUC) de OCR basal entre estirpes selvagens tipo, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 de c. albicans não mostrar nenhuma diferença significativa. Gráfico em tempo real C) A taxa de acidificação do extracelular (ECAR) na glicólise basal seguido de injeção sequencial de SHAM (2 mM), oligomicina (10 µM), KCN (10 mM) e Antimycin um (2 µM). D) comparação da área sob a curva (AUC) ECAR basal entre estirpes selvagens tipo, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 de c. albicans não mostrar nenhuma diferença significativa. E) comparação da área sob a curva (AUC) ECAR entre estirpes selvagens tipo, mam33Δ/Δ e mam33 Δ/Δ::MAM33 de c. albicans após a injeção de inibidor de C-IV KCN mostrar diminuição significativa no turno glicolítico em mam33Δ/Δ mutante comparado ao tipo selvagem e estirpes complementar os valores são expressos como média ± erro padrão. * p < 0.05, * * p < 0,001 é considerada significativa por One-Way ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 . Ensaio de stress glicolítico em c. albicans. Consumo de oxigênio e a acidificação do extracelular foram medidos no tipo selvagem, mam33Δ/Δ mutante depois que eles estavam sedentos de glicose seguido por injeção aguda da concentração de glicose saturada. A) um gráfico em tempo real da taxa de consumo de oxigênio após as células foram submetidas a ECAR basal seguido de injeção sequencial de glicose (10 mM), oligomicina (1 µM), 2-DG (40mm) e Antimycin um (2 µM). B) gráfico de barras mostrando a área sob a curva ECAR da glicólise basal entre estirpes selvagens tipo, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 de c. albicans. Gráfico em tempo real de C) um da função glicolítico depois que as células foram submetidas a ECAR basal seguido de injeção sequencial de glicose (10 mM), oligomicina (1 µM), 2-DG (40mm) e Antimycin um (2 µM). D) gráfico de barras mostrando a área sob a curva ECAR da glicólise basal entre tipo selvagem, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 cepas de c. albicans valores são expressos como média ± erro padrão. * p < 0.05, * * * p < 0,0005, * * * p < 0,0001 é considerada significativa por One-Way ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A bioenergética ensaio de fluxo extra serve como uma excelente ferramenta para ler a função mitocondrial medindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxigênio dependente em tempo real. Além disso, uma função glicolítico que é medida como uma taxa de acidificação do extracelular (alteração do pH extracelular) também pode ser investigada ao mesmo tempo em análise em tempo real.
Bem sucedido chapeamento de c. albicans em placa de ensaio é um dos passos críticos no ensaio porque a incubação das células nas placas de PDL revestido permitem que as células aderir à placa de ensaio. Visualização de células de c. albicans aderente é realizada pela microscopia de luz. Aderência de célula impróprio pode originar células flutuando em poços, que afetarão o resultado do ensaio com leituras inconsistentes entre repetições. Da mesma forma, é importante realizar a titulação de número de celular, como o primeiro passo neste ensaio para obter um OCR entre 100-300 pmol/min, que é uma gama óptima. Além disso, titulada os compostos para obter a concentração ideal também é fundamental para alcançar a resposta ideal. Isso pode ser realizada sempre que houver uma mudança na composição média basal.
DMEM é o meio basal mais comumente usado no ensaio de fluxo extra para pilhas mamíferas. No entanto, em nossas mãos, meio RPMI 1640 deu os resultados óptimos com c. albicans. Isto era principalmente devido a eficácia do transporte de elétrons mitocondrial cadeia complexa os inibidores que funcionou melhor em meio RPMI 1640 comparado com DMEM.
Neste ensaio, tipo selvagem, mam33Δ/Δ e mam33Δ/Δ::MAM33 cepas de c. albicans foram usadas para avaliar a respiração mitocondrial e eficiência glicolítico. Os resultados mostram claramente que a supressão do gene MAM33 reduzida a capacidade da c. albicans a mudança para glicólise sob condições de estresse, tais como inibição de C-IV (Figura 7C e 7E). Da mesma forma, quando as células foram submetidas a sublinhar a condição como glicose fome, tanto a respiração mitocondrial e a eficiência glicolítico é significativamente comprometida no mutante mam33Δ/Δ , mas não no tipo selvagem e estirpes de complemento ( Figura 8). Portanto, dependendo de experiências, fontes de carbono no RPMI 1640 também podem ser modificadas para glicerol ou galactose, que força as células a se usar OXPHOS em vez de glicólise.
O significado de usando o ensaio de fluxo extra é que, usando vários substratos e compostos que perturbam a função mitocondrial, a capacidade de células de utilizar OXPHOS versus glicólise pode ser inferida. Isso pode ser usado como uma ferramenta informativa para entender o efeito de quaisquer tratamentos ou gene na função mitocondrial e glicólise em Candida albicans sem isolar as mitocôndrias. O ensaio mede a taxa de consumo de oxigênio basal (OCR), que é uma medida da respiração mitocondrial, e taxa de acidificação do extracelular (ECAR), que é uma medida da função glicolítico em ambos a presença de glicose e depois da fome de glicose. O ensaio de fluxo extra celular é bem empregado em uma variedade de modelos de mamíferos26. Apesar da importância médica de c. albicans, pesquisa em mitocôndrias fúngicas tem sido dificultada um pouco devido à falta de procedimentos experimentais padronizados para estudar a função mitocondrial e glicólise em tempo real.
Este método fornece uma maneira fácil e conveniente de investigar a respiração mitocondrial e glicolítico eficiência por meio de ensaio de fluxo extracelular em tempo real em c. albicans. No futuro, este ensaio também pode ser aplicado para estudar a eficácia de drogas testes usando comumente empregados antifúngicos como o fluconazol. Além disso, outro potencial aplicação futura deste método está na descoberta de medicamentos, especialmente para a seleção de compostos visando a função mitocondrial de c. albicans.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Pesquisa no laboratório de NC é suportada por uma concessão do National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e uma bolsa da Fundação de saúde de Nova Jersey (NJHF), #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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