Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/58913
* These authors contributed equally

Summary

Burada, mitokondrial solunum ve Candida Albicans glycolytic işlevinde araştırmak için kademeli bir protokol bir ilave akı çözümleyicisini kullanarak mevcut.

Abstract

Mitokondri temel organellerin hücre metabolizması ve hayatta kalmak için vardır. Önemli olaylar çeşitli hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve Apoptozis gibi mitokondri içinde yer alır. Sonuç olarak, mitokondrial disfonksiyon antifungal ilaç hoşgörü ve patojenik mantar virülans önemli bir rol oynamaya bildirilmektedir. Son veri mitokondri önemini mantar patogenezinde önemli bir katkı olarak tanınması da açmıştır. Mitokondri mantar Biyolojide önemini rağmen onun işlevini anlamak için standartlaştırılmış yöntemler kötü geliştirilir. Burada, çalışma Bazal oksijen tüketim oranını (OCR), bir ölçü mitokondrial solunum ve ekstraselüler asitleştirme oranları (D.H.T.), C. albicans suşları glycolytic işlevinde bir ölçü için bir yordam mevcut. Burada açıklanan yöntemi herhangi bir soy Candidaspp. mitokondri sağlam mantar hücrelerden arındırmak için gerek kalmadan uygulanabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı Ayrıca özelleştirilebilir için C. albicans suşları mitokondriyal işlevde inhibitörleri ekran.

Introduction

İnvazif mantar enfeksiyonları yılda dünya çapında 1,5 milyonun üzerinde kişi öldür. Yaşlı, prematüre bebeklerde, organ nakli alıcılar ve kanser hastaları1de dahil olmak üzere tehlikeye dokunulmazlık ile yaşayan insanların sayısında bir artış nedeniyle yükselişte sayıdır. C. albicans insan mikrofloranın parçasıdır fırsatçı bir insan mantar patojen var. Bu da Mukozal yüzeyler ve gastrointestinal sistem komensal bir organizma olarak yaşıyor. C. albicans bağışıklık eksiklikler, kim cerrahi undergone ya da kim uzun kursları antibiyotik ile tedavi edilmiş olan kişilerde ciddi sistemik hastalık üretir. Candida türleri sırası Nozokomiyal enfeksiyon hastalıkları (NID) insanlar2,3,4,5,6,7ilk üç-dört nedenleri arasında. Candida kan dolaşımına enfeksiyonların yıllık genel sayısı ~ 400.000 talepleriyle ilişkili Scotlan 46-%751olduğu tahmin edilmektedir. Kandidiyazis nedeniyle yıllık mortalite yaklaşık 10.000 ABD tek başına olduğunu. NID mantarlar tarafından neden olduğu ölçüde astronomik hasta giderleri5' da yansıtılır. Amerika Birleşik Devletleri'nde, yıllık masraf invazif mantar enfeksiyonları tedavisi için $2 milyar, zaten aşırı yüklenmiş sağlık sistemi için çok büyük bir yük ekleyerek aşan. Şu anda, mevcut standart antifungal tedavilerin toksisite, giderek yaygın ilaç direnci ve ilaç-ilaç etkileşimleri nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, yüksek riskli hastalar için daha iyi tedavi seçenekleri neden olur yeni antifungal ilaç hedefler belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır. Ancak, yeni ilaçlar mantar hedef üstünde hareket keşfi mantarlar ökaryotlarda olduğundan karmaşıktır. Bu büyük ölçüde özel mantar uyuşturucu hedef sayısını sınırlar.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda mitokondri hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve apoptosis8 için önemli olduğundan mitokondri mantar virülans için önemli bir katkı ve antifungal ilaçlar için hoşgörü olduğunu belirttiler ,9,10,11. Glycolytic ve glycolytic metabolizma C. albicans hayatta memeli ev sahibi12,13,14,15,16için önemlidir. Ayrıca, birkaç C. albicans mutantlar mitokondrial proteinler, Goa1 gibi eksik Srr1, Gem1, Sam37 vb filamentation, bir önemli virülans faktörü C. albicans17, arızalı olduğu gösterilmiştir 18 , 19 , 20 , 21 , 22. buna ek olarak, bu mutant Ayrıca, bir fare modeli virülans kandidiyazis17,18,19,20,21 Dissemine için zayıflatılmış gösterildi ,22. Böylece, mantar mitokondri ilaç keşfi için cazip bir hedef gösterir. C. albicans mitokondrial genom yaşayamaz anlamına gelir petite negatif23, çünkü ancak, C. albicans mitokondriyal işlevde çalışmanın meydan okuyor.

Burada, biz C. albicans mitokondrial ve glycolytic işlevinde mitokondri arındırmak için gerek kalmadan araştırmak için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem aynı zamanda genetik manipülasyon veya kimyasal modülatörler C. albicansmitokondrial ve glycolytic yollar üzerindeki etkisini araştırmak için optimize edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Testin detaylı kademeli Protokolü aşağıda anlatılan ve şematik protokolü şekil 1' de gösterilen.

1. C. albicans suşları ve büyüme koşulları

  1. C. albicans suşları sıvı Maya özü-pepton-dekstroz (YPD) orta 30 °C bir kuluçka shaker gecede büyümek.
    Not: Candida suşları donmuş hisse senetleri olarak korumak ve YPD agar (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, %2 dekstroz ve %2 agar) büyümek.

2. reaktifler hazırlanması

  1. Tahlil Orta şekilde hazırlayın:
    1. 1,04 g Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 tozu ve 2 gr glukoz (% 2) mitokondriyal işlev tahlil için çözmek 90 mL steril su ve sıcak ortam ile 37 ° c PH 5 M NaOH kullanarak 7.4 için ayarlamak ve ses seviyesi açma 100 mL steril su ile yapın.
    2. Glycolytic stres tahlil için 1,04 g RPMI 1640 toz 90 mL steril su yalnız dağıtılması, 37 ° C ortam sıcak ve pH 7.4 için ayarlayın. Sesini 100 mL steril su ile yapın. RPMI 1640 toz pH değişikliği sırasında tahlil Glikoliz bir ölçüsü olarak izlemek için önemlidir yok bikarbonat vardır.
  2. Enjeksiyon bileşikler.
    1. Steril su ve mağaza-20 ° C'de 1 M glikoz hisse senedi hazırlamak
    2. 100 mM oligomycin stok Dimetil sülfoksit (DMSO), küçük miktarlar aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
    3. 100 mM antimycin A stok DMSO, küçük miktarlar aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
    4. 100 mM SHAM (salicylhydroxamic asit) stokta etanol tahlil gününde hazır olun.
    5. Testin gün 1 M KCN steril su hazırlamak.

3. kaplama tahlil plaka ile Poly-D-lizin (PDL)

Not: tüm yerine aşağıdaki adımları Laminer Hood.

  1. Poly-D 50 µg/mL nihai toplama yapmak için lisin doku kültürü sınıf suda çözülür. İyi ve aliquot bir 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine karıştırın ve uzun vadede-20 ° C'de depolayın.
    Not: iyi başına 50 µL gereklidir ve 24 kuyular için 1.2 mL gereklidir. Bu nedenle, aliquot en az 1.3 mL microcentrifuge tüp başına.
  2. İyi ücret 50 µL ekleyin ve 1-2 h için kapalı kapak ile oda sıcaklığında kuluçkaya.
  3. Çözüm Aspire edin ve bir kez 500 µL steril doku kültürü sınıf su ile durulayın.
  4. Kapağı açın ve hava Kuyu kuru izin. Plaka aynı gün veya mağaza 4 ° C'de en fazla 2-3 gün için kullanın.

4. hidrasyon sensör kartuş

Not: bir gün deneme önce bu adımı gerçekleştirin.

  1. İlave akı tahlil Kit açın ve içeriğini kaldırın. Baş aşağı yanında yardımcı programı plaka (Şekil 2) sensör kartuşu yerleştirin.
  2. Dolgu her yardımcı programı saçtan calibrant 1 mL ile iyi ve sensör kartuş geri yerleştirin. Fluorophores (oksijen ve pH ölçmek için) içeren sensörler içinde calibrant batık emin olun.
  3. Sensör kartuşta gecede bir sigara-CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya

5. büyüyen ve PDL kaplı plakalar hücrelerde tohumlama

  1. C. albicans YPD et suyu içinde aşılamak ve gecede 200 devirde bir shaker 30 ° C'de büyür.
    Not: tahlil tasarım ve faiz dayanarak, C. albicans Ayrıca YPG veya en az orta yetiştirilir.
  2. Tahlil günde 100 µL başına 100.000 hücre son bir konsantrasyon verim için tahlil orta hücrelerde uygun sayıda sulandırmak.
  3. Tahlil plaka wells A1, B4, C3 ve hangi tahlil orta arka plan düzeltme (şekil 3) için sadece 100 µL eklemek D6 dışında her kuyuya seyreltilmiş hücre 100 µL ekleyin.
  4. 60 dk, plaka yüzeyine bağlı hücreler olanak vermek için kuluçkaya ve sigara-CO2 kuluçka 37 ° C'de plaka transfer.

6. tahlil Protokolü

Not: Burada özetlenen araç 24-şey biçimi için iletişim kuralıdır. Birimleri başka bir biçimde kullanılırsa ayarlanması gerekir.

  1. Mitokondriyal işlev tahlil
    1. Bileşikler hazırlanması
      1. Bileşikleri, 10 x konsantrasyon mitokondriyal işlev tahlil için hazırlamak: 20 mM SHAM, 100 µM hazırlamak Oligomycin, 100 mM KCN ve 20 µM Antimycin A karşılık gelen tahlil orta.
      2. 50 µL SHAM A bağlantı noktası 55 µL içine eklemek Oligomycin bağlantı noktasına B, 62 µL C ve bağlantı noktasına KCN 68 µL Antimycin A D bağlantı (şekil 4).
  2. Glycolytic stres tahlil
    1. Bileşikler hazırlanması
      1. Bileşikleri, 10 x konsantrasyon glycolytic stres tahlil için hazırlayın. 100 mM glikoz, 100 µM hazırlamak Oligomycin, 500 mM 2-Deoksi glikoz (2DG) ve 20 µM Antimycin A karşılık gelen tahlil orta.
      2. Bağlantı noktası A, 55 µL 50 µL glikoz Ekle Oligomycin bağlantı noktasına B, 62 µL 2-DG bağlantı noktasına C ve 68 µL Antimycin A bağlantı noktasına ö.
  3. Hangi oksijen tüketim oranını (OCR) ve ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) 24-şey plaka kartvizitlere canlı hücrelerin ilave akı Analyzer'ı kullanır. Tahlil Protokolü önceden ayarlayın.
  4. İlave akı Analyzer'ı açın ve tahlil Sihirbazı sekmesini kullanarak tahlil şablon ayarlama ve kurulum sırasında pops dışarı tüm bilgileri doldurmak için adım adım talimat izleyin. Grup düzeni benzer olarak şekil 5' te gösterilen oluşturur. Protokolü Tablo 1' de gösterildiği gibi ayarlayın. Bu düzenleri önde önce tahlil ayarlayın ve bilgisayara kaydedin. Tahlil zaman kaydedilmiş Protokolü tahlil Sihirbazı sekmesinde (şekil 5) dosyasını açın seçeneğine karşılık gelen dosya açarak geri yükleyin.
  5. Calibrant içeren sulu sensör kartuş ilgili bağlantı noktalarından 10 x bileşikler yük ve ilave akı analyzer taşıyıcı tepsisine yükleyin. Kalibrasyon ekranda Start düğmesine basarak başlatın.
  6. Tahlil orta 350 µL yavaşça hücre plakasına son hacim 450 µL getirmek için hücre rahatsızlık en aza indirmek için kuyu tarafındaki ekleyin.
  7. Calibrant tahlil plakalı içeren yeni plaka değiştirmek ve devam edin.
  8. Bir kez tahlil tam sensör kartuş ve plaka çıkarın. Dosyayı uygun hedef klasöre kaydedin.

7. veri analizi

  1. Eğri - Varyans analizi (AUC-ANOVA) analiz sekmesi yazılım alanında ilgili parametre (OCR veya D.H.T.) şekil 6' da gösterildiği gibi seçerek gruplar arasında anlamlı bir fark hesaplamak için kullanın.
  2. Karşılaştırılacak grupları seçin.
  3. İçin ANOVA analizi gruplara ekleyin ve Tamam' ı tıklatın.
    Not: Bu AUC ANOVA analizi hangi AUC her grup için hesaplanan ve ANOVA tarafından aralarında karşılaştırıldığında dosya yeni bir sayfa ekler. Bu önemini göstermek için p değerlerinin bir tablosu verecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. albicans ilave akı Çözümleyicisi tarafından değerlendirildi biyo-enerjetik işlevlerini belirlemek için bu iletişim kuralını odak noktasıdır. Mitokondrial protein Mam33 eksik bir C. albicans mutant Ayrıca onun tamamlayıcı zorlanma, mitokondriyal bir protein silme etkilerini OCR ve D.H.T. çalışmaya mam33Δ/Δ::MAM33 ile birlikte bulunur. MAM33 için sözde mitokondrial asidik matris protein kodlar ve Candida onun işlevinde bilinen değil.

İlave akı tahlil için cep numaraları
145 pmol/dk (Şekil 7), 100-300 pmol/dak herhangi bir hücre dışı akı tahlil için optimum aralığı içinde olan bir OCR gösterdi ilave akı tahlil bir kuyu başına 1 x 105 C. albicans vahşi türü hücre çalıştırmaya başladık. Önce tahlil veya farklı deneyleri arasında büyüme orta bileşiminde bir değişiklik olduğunda bir Optimum OCR edinmek için telefon numarası titre önemlidir.

Veri analizi
Eğri - Varyans analizi (AUC-ANOVA) analiz sekmesi yazılım alanında ilgili parametre (OCR veya D.H.T.) Şekil 7' de gösterildiği gibi seçerek gruplar arasında anlamlı bir fark hesaplamak için kullanıldı. Bu analiz yeni bir sayfa p değerlerinin bir tablosu verdi hangi AUC her grup için hesaplanan ve aralarında ANOVA tarafından otomatik olarak karşılaştırıldığında dosyaya eklenen.

Mitokondriyal işlev tahlil
Mitokondrial stres testinde tahlil Bazal oksijen tüketim oranını (OCR) inhibitörleri bir alternatif oksidaz (AOX), ATP sentaz ve elektron taşıma zinciri kompleksleri, IV ve III enjeksiyonu ile takip ölçme ile başlar. Klasik solunum zinciri yanı sıra, C. albicans da enerji üretimi24için AOX yolu kullanır. Bu nedenle, biz salicylhydroxamic asit (sahte)25kullanarak faaliyetini engelleyerek OCR AOX sistem etkisini araştırdık. Pmol/dak, Bazal ve sonra ilgili inhibitörü enjekte Şekil 7' de gösterilen bir oksijen tüketim oranını (OCR) olarak ölçülen mitokondriyal işlev. Vahşi türü, mam33Δ/Δ ve mam33Δ/Δ::MAM33 suşlarının Bazal OCR hiçbir farkı yoktur (Şekil 7A ve B) gösterdi. Benzer şekilde, Bazal D.H.T. olarak anlamlı bir fark (Şekil 7C ve D) bu suşlar arasında gözlendi. Ancak, karmaşık IV tarafından KCN, vahşi türü ve mam33Δ/Δ::MAM33 mam33Δ/Δ, aksine Glikoliz yönünde önemli bir değişimi gösterdi engelleyerek hangi önemli ölçüde telafi glycolytic shift (Şekil 7 göstermek için başarısız E), C-IV bağımlı glycolytic yolu vahşi türü ve mam33Δ/Δ::MAM33 suşları ile karşılaştırıldığında mam33Δ/Δ mutant içinde Engelli düşündüren.

Glycolytic stres tahlil
Glycolytic stres testi, hücrelerin glikoz için 1 h için aç ve kırılmaya karşı Bazal OCR ve D.H.T.. Açlık, önemli ölçüde daha düşük OCR (şekil 8A ve B) ve vahşi türü ve bir bozulmuş glikoz kullanımını düşündüren mam33Δ/Δ::MAM33 suşları ile karşılaştırıldığında D.H.T. (şekil 8C ve D) mam33Δ/Δ gösterdi hem solunum ve hücreleri açlıktan durumuna zorunda zaman Glikoliz. Glikoz enjekte sonra tüm suşların uyarılması OCR ve D.H.T. gösterdi. OCR ve D.H.T., 2-DG, üzerinde daha az etkisi Glikoliz rekabetçi bir inhibitörü olan oligomycin sahip olmasına rağmen OCR ve D.H.T. engeller. Özellikle, 2-DG kısmen daha fazla Antimycin A. tarafından inhibe OCR engeller Buna ek olarak, 2-DG neredeyse tamamen D.H.T. engeller.

Table 1
Tablo 1. Tahlil için protokol komutları

Figure 1
Resim 1 . Denemenin şematik gösterim Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Sensör kartuş (yeşil) yerleştirilen baş aşağı yardımcı programı plaka calibrant eklemeden önce. Fluorophores oklarla belirtilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Hücre arka plan wells A1, B4, C3 ve D6 gösterilen kültür plaka. Mavi bir işareti sol alt odaklı çentik, gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Üst kısmındaki bağlantı noktaları A, B, C ve d gösterilen sensör kartuş Ok işareti sol alt odaklı çentik, gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Wells ve yazılımda görselleştirildiği gibi grup atama düzenini. WT - vahşi türü; MT - mam33Δ/Δ mutant; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 tamamlayıcı zorlanma. Ok işareti gösterir açık dosya sekmesini Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 . Gruplar arasında önemi hesaplamak için eğri (AUC) ANOVA analizi sekmesinin altındaki alan. Karşılaştırılır ve için ANOVA analizi gruplara ekleyin ve Tamam'ı tıklatın gerekiyor gruplarını seçin. Bu AUC ANOVA analizi hangi AUC her grup için hesaplanan ve ANOVA tarafından aralarında karşılaştırıldığında dosya yeni bir sayfa ekler. Bu önemini göstermek için p değerlerinin bir tablosu verecektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7Mitokondriyal işlev tahlil C. albicans. Oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları vahşi türü, mam33 Δ/Δ ve mam33 Δ/Δ::MAM33 soy-in C. albicansölçüldü. A) oksijen tüketim oranını (OCR) Bazal solunum, gerçek zamanlı grafik SHAM (2 mM), Oligomycin sıralı enjeksiyon tarafından takip (10 µM), KCN (10 mM) ve Antimycin (2 µM). B) alanı altında eğrisi (AUC) Bazal OCR C. albicans vahşi türü, mam33Δ/Δ ve mam33Δ/Δ::MAM33 suşları arasında karşılaştırılması anlamlı bir fark gösterir. C) A gerçek zamanlı grafik ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) Bazal Glikoliz, SHAM (2 mM), Oligomycin sıralı enjeksiyon tarafından takip (10 µM), KCN (10 mM) ve Antimycin (2 µM). D) eğri altındaki alan karşılaştırılması (AUC) Bazal D.H.T. C. albicans vahşi türü, mam33Δ/Δ ve mam33Δ/Δ::MAM33 suşları arasında anlamlı bir fark gösterir. E) C-IV inhibitörü KCN Haritayı önemli azalma mam33Δ/Δ glycolytic vardiyada enjeksiyon sonra C. albicans (AUC) D.H.T. vahşi türü, mam33Δ/Δ ve mam33 Δ/Δ::MAM33 suşları arasında eğri altındaki alan karşılaştırılması mutant karşılaştırıldığında vahşi türüne ve tamamlayıcı suşları değerleri ortalama ± standart hata ortalama dile getirdi. * p < 0,05, ** p < 0,001 tarafından tek yönlü ANOVA olarak anlamlı sayılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8 . Glycolytic stres tahlil C. albicans. Oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme vahşi yazın, sonra doymuş glikoz konsantrasyonu akut enjeksiyonu ile takip glikoz için açlıktan mam33Δ/Δ mutant ölçüldü. A) gerçek zamanlı grafik hücrelerin Bazal D.H.T. tabi tutuldu sonra oksijen tüketim oranını takip glikoz (10 mM), Oligomycin sıralı enjeksiyon tarafından (1 µM), 2-DG (40 mM) ve Antimycin (2 µM). B) Bar vahşi türü, mam33Δ/Δ ve mam33Δ/Δ::MAM33 C. albicanssuşları arasında Bazal Glikoliz D.H.T. eğri altındaki alan gösteren grafik. C) A gerçek zamanlı grafik hücrelerin Bazal D.H.T. tabi tutuldu sonra glycolytic işlevinin glikoz (10 mM), Oligomycin sıralı enjeksiyon tarafından takip (1 µM), 2-DG (40 mM) ve Antimycin (2 µM). D) Bar arasında vahşi türü, Bazal Glikoliz D.H.T. eğri altındaki alan mam33Δ/Δ ve mam33Δ/Δ::MAM33 soy-in C. albicans değerleri ortalama ± standart hata ortalama ifade edilir gösteren grafik. * p < 0,05, *** p < 0.0005, *** p < 0,0001 tarafından tek yönlü ANOVA olarak anlamlı sayılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bioenergetics mitokondriyal işlev oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ölçerek okumak için mükemmel bir araç olarak hizmet veren ilave akı tahlil-bağımlı oksijen tüketimi içinde gerçek-zaman. Buna ek olarak, bir hücre dışı asitleştirme oranı (ekstrasellüler pH değişikliği) olarak ölçülen glycolytic bir fonksiyonu da aynı anda gerçek zamanlı analiz soruşturma olmaktır.

PDL kaplamalı plakalar hücrelerde kuluçka izin verdiğinden tahlil plakasına uygun hücrelere C. albicans başarılı kaplama tahlil plaka tahlil önemli adımlardan biri. Görselleştirme yapışan C. albicans hücre ışık mikroskobu tarafından gerçekleştirilir. Uygun olmayan hücre yapışma çoğaltır arasında tutarsız değerler ile tahlil sonucu etkileyecek wells, yüzen hücreleri neden olabilir. Benzer şekilde, bu tahlil bir OCR arasında 100-300 pmol/bir optimum menzili olan min, elde etmek için ilk aşama olarak cep numarası titrasyon işlemi yapılması önemlidir. Ayrıca, en iyi konsantrasyon elde etmek için bileşikleri titrating da en iyi yanıt ulaşmak için çok önemlidir. Bazal orta bileşiminde değişiklik yapıldığında bu gerçekleştirilebilir.

DMEM en sık kullanılan Bazal orta memeli hücreleri için ilave akı tahlil olduğunu. Ancak, bizim elimizde, RPMI 1640 orta C. albicansile en iyi sonuçlar verdi. Bu daha iyi DMEM için karşılaştırıldığında RPMI 1640 ortamda çalıştı mitokondrial elektron taşıma zinciri karmaşık inhibitörleri etkinliği nedeniyle öncelikle oldu.

Bu tahlil, vahşi türü, mitokondrial solunum ve glycolytic etkinliğini değerlendirmek için mam33Δ/Δ ve mam33Δ/Δ::MAM33 C. albicans suşları kullanılmıştır. Sonuçlar açıkça MAM33 gen silinmesi C. albicans yeteneği Glikoliz C-IV (Şekil 7C ve 7E) inhibisyonu gibi stres koşullarında kaymak için azaltılmış gösterir. Benzer şekilde, ne zaman hücre durum glukoz açlık gibi strese tabi tutuldu, mitokondrial solunum ve glycolytic verimliliği önemli ölçüde tehlikeye mam33Δ/Δ mutant ama vahşi türü ve tamamlayıcı suşları ( içinde Şekil 8). Bu nedenle, deneyler bağlı olarak, karbon kaynakları RPMI 1640 yılında da gliserol veya Glikoliz yerine OXPHOS kullanacağınız hücre zorlar galaktoz için değiştirilebilir.

İlave akı tahlil kullanmanın önemi çeşitli yüzeyler ve mitokondriyal işlev huzursuz bileşikleri kullanarak, OXPHOS Glikoliz karşı kullanma hücreleri özelliğini varılabilir ki. Mitokondri izole olmadan herhangi bir tedavi veya gen mitokondriyal işlev ve Candida albicans Glikoliz üzerindeki etkisini anlamak için bilgilendirici bir aracı olarak kullanılabilir. Tahlil mitokondrial solunum bir ölçüsüdür, Bazal oksijen tüketim oranını (OCR) ve her iki glikoz ve glukoz açlık sonra varlığı glycolytic işlevinde bir ölçüsüdür ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.), ölçer. İlave akı hücresel tahlil de memeli modelleri26çeşitli istihdam edilmektedir. C. albicanstıbbi önemi rağmen araştırma içine mantar mitokondri biraz mitokondriyal işlev ve Glikoliz gerçek zamanlı olarak çalışmaya deneysel standartlaştırılmış yordamlar eksikliği nedeniyle engel olmuştur.

Bu yöntem araştırma mitokondrial solunum ve glycolytic verimliliği gerçek zamanlı ekstraselüler akı tahlil kullanarak kolay ve kullanışlı bir yol sağlar C. albicans. Gelecekte, bu tahlil ilaç etkinliğini test Flukonazol gibi yaygın istihdam Antifungaller kullanarak eğitim için de uygulanabilir. Ayrıca, başka bir potansiyel gelecek bu yöntemin ilaç keşif, özellikle C. albicansmitokondriyal işlev hedefleme bileşikler süzmek için bir uygulamadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

NC laboratuarında Araştırma Ulusal kurumları Sağlık (NIH) grant R01AI24499 ve bir New Jersey Sağlık Vakfı (NJHF) grant, #PC40-18 tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning MT50020PB
Antimycin A Sigma A8674
KCN
Mito stress kit Agilent 103015-100
Oligomycin Calbiochem 495455
pH meter Accumet AR20
Phenol red Sigma P5530
Poly-D lysine Sigma P6407
Rotenone Santa cruz 203242
Seahorse XF24 FluxPak Agilent 100850-001
SHAM
Sodium Chloride Amresco  241
Sodium hydroxie pellets J.T Baker 3722
Tissue culture grade water Gibco 1523-0147
XF assay calibrant solution Agilent 100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose Fisher scientific, BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar Sigma A1296
Yeast extract Peptone Glycerol Sigma G2025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
  4. Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
  5. Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
  6. Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
  7. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
  8. Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
  9. Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
  10. Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
  11. Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  12. Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
  13. Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
  14. Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
  15. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
  16. Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
  17. Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
  18. Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
  19. Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
  20. Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
  21. Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
  22. Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
  23. Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
  24. Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
  25. Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
  26. de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).

Tags

Tıp sayı: 145 Candida albicans bioenergetics metabolizma mitokondri solunum oksijen tüketimi hücre dışı asitleştirme Glikoliz
<em>Candida albicans</em> kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkatesh, S., Chauhan, M., Suzuki,More

Venkatesh, S., Chauhan, M., Suzuki, C., Chauhan, N. Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58913, doi:10.3791/58913 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter