Summary
Galleria mellonella sirve como un modelo de invertebrado para la candidiasis diseminada. Aquí detallamos la infección el protocolo y proporcionar datos de apoyo para la efectividad del modelo.
Abstract
Las especies de Candida son comensales hongos comunes de los seres humanos colonizando la piel, superficies mucosas y tracto gastrointestinal. Bajo ciertas condiciones, la Candida puede cubran sus nichos naturales dando por resultado debilitante mucosas infecciones como infecciones sistémicas así como peligrosa para la vida, que son un foco importante de la investigación debido a su alta mortalidad asociada. Modelos animales de infección diseminada existen para estudiar la progresión de la enfermedad y las características de patogenicidad de Candida de disección. De estos, el modelo de infección de waxworm Galleria mellonella proporciona una rentable herramienta experimental para investigaciones de alto rendimiento de virulencia sistémica. Muchos otros agentes infecciosos bacterianos y eucariotas han sido efectivamente estudiados en g. mellonella para entender patogenicidad, convirtiéndolo en un sistema modelo ampliamente aceptado. Sin embargo, variación en el método utilizado para infectar a g. mellonella puede alterar los resultados fenotípicos y complicar la interpretación de los resultados. Aquí describiremos las ventajas e inconvenientes del modelo waxworm estudiar patogenia de Candida sistémica y un enfoque para mejorar la reproducibilidad del detalle. Nuestros resultados destacan la gama de la cinética de mortalidad en g. mellonella y describen las variables que pueden modular la cinética de estos. En última instancia, este método se erige como un enfoque ético, rápido y rentable para el estudio de virulencia en un modelo de candidiasis diseminada.
Introduction
Las especies de Candida son comensales humanos comunes que son capaces de emerger como patógenos oportunistas en severamente inmunocomprometidos y pacientes disbiotica. Aunque muchas especies de Candida pueden causar enfermedad, C. albicans es la causa más frecuente de candidiasis diseminada1,2. Enfermedad sistémica resulta de C. albicans de acceso a la circulación sanguínea a través de cualquier penetración directa de las barreras del huésped previamente restrictivas o introducción en sitios quirúrgicos y otros incumplimientos del cuerpo3. Las especies de Candida utilizan una gama de procesos patógenos para causar enfermedad sistémica en el host incluyendo filamentación, formación de biopelículas, evasión inmune celular, escape y plancha limpieza4. Existen enfoques in vitro para investigar los mecanismos patogénicos, pero modelos animales continúan proporcionando la mejor opción para investigar la totalidad de la enfermedad resultado5,6. La investigación anterior ha detallado muchas instancias de prometedoras investigaciones en vitro de virulencia pudiendo reproducir en vivo7,8. Por lo tanto, se requiere evaluar virulencia modelos animales en vivo. Más modelos de la enfermedad dependen de ratones para servir como un sustituto para las infecciones humanas a pesar de la incapacidad de C. albicans coloniza naturalmente sistemas murinos como un comensal9. Los modelos invertebrados de candidiasis diseminada incluyen el nematodo elegans de Caenorhabditis, la fruta la mosca Drosophila melanogastery waxworm Galleria mellonella, aunque preocupaciones acerca de las diferencias fundamentales en fisiología básica, las temperaturas del cuerpo anfitrión y las rutas de exposición han obstaculizado su amplia aceptación10,11.
Más recientemente, se ha adoptado el modelo de infección de g. mellonella waxworm a patogenicidad de modelo de una amplia gama de bacterias y hongos patógenos12,13,14. Ventajas de este modelo son su relativamente bajo costo, mayor rendimiento, facilitan de uso y reducción preocupaciones éticas sobre beneficencia animal comparado con modelos murinos. Para los investigadores, esto se traduce en mayor capacidad de prueba de múltiples variables, intervalos de confianza más fuerte, más rápida experimentación y derivación de protocolos animal. G. mellonella ha servido como una plataforma para evaluar rápidamente la virulencia de C. albicans después de perturbación de los genes necesarios para biofilm formación, filamentación y gene regulación a través de aislamientos clínicos de11,15 ,16. Estudios recientes han incorporado la investigación de la eficacia antifúngica utilizando g. mellonella para evaluar la farmacocinética de la droga actividad y resistencia en vivo en configuración, que son otra manera desafiante y mucho tiempo 17,18. Sin embargo, estudios de virulencia de C. albicans en g. mellonella han sido complicados por presuntamente altos niveles de variación dentro de los experimentos y protocolos incompatibles entre grupos de investigación que producen distintos fenotipos de virulencia entre ratones y waxworms11,13,19,20,21. Aquí, describimos un protocolo de g. mellonella para normalizar la reproducibilidad de aumento de infecciones, C. albicans en experimentos de virulencia y demostrar coherencia con estudios previamente descritos de virulencia en murine modelos.
Estudios previos demostraron que C. albicans (MTL) de tipo-como locus en el cromosoma 5 de acoplamiento regula célula identidad y competencia similar a Saccharomyces cerevisiae y otros ascomiceto hongos22de apareamiento. La mayoría de los aislamientos de C. albicans es heterocigoto en el locus MTL , codificación de cada uno de los MTLuna y MTLα alelos (MTLun/α) y es por lo tanto estéril15, 23 , 24. pérdida de uno de los alelos MTL por la pérdida del heterocigoto (LOH) o mutación conduce a homocigótica MTLuna o MTLα cepas que pueden experimentar un cambio fenotípico desde el estado estéril 'blanco' a la apareamiento de estado 'opaco' competente25. Trabajo previo ha puesto de manifiesto que la pérdida de heterocigoto MTL reduce también virulencia en modelos murinos de infección sistémica por cepa diferente fondos26. Aquí detallamos el modelo de g. mellonella para candidiasis diseminada con un conjunto experimental genéticamente similar para representar la contribución de MTL heterocigoto a la virulencia en g. mellonella. Mostramos que la configuración de MTL influenciada patogenicidad de C. albicans , donde MTLα fueron menos virulenta con respecto aun/α MTLy MTLa las células, similares a resultados en modelo murino infección26.
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Protocol
Todos los métodos descritos dependen del uso de hospedadores invertebrados y no requieren de aprobación institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC).
1. larvas de galleria mellonella Waxworm
- Larvas del orden de mayoristas y proveedores que no introducen hormonas, antibióticos u otros tratamientos para las larvas y que son capaces de enviar y entregar a especímenes vivos.
- Asegúrese de comprar todas las larvas del mismo proveedor durante el curso de la experimentación. Tenga cuidado cuando ordene las larvas durante los meses de verano temperaturas superiores a 30 ° C disminuir la viabilidad de las larvas.
- Controlar las temperaturas en toda la ruta del envío previsto y planificar gastos de envío y entrega o elegir envío acelerado para minimizar su exposición a condiciones ambientales.
- Cuando las larvas llegan, compruebe cada contenedor para asegurar las larvas viables y saludables están presentes. Larvas sanas serán completamente sumergidas debajo de las camas, en movimiento y poseen una coloración amarillo/tan ligera con pocas larvas que contienen marcas negras o manchas en el cuerpo.
- Almacenar las larvas en su recipiente en un lugar ventilado a temperatura ambiente (25 ° C). Dependiendo de la condición inicial de las larvas, se pueden utilizar hasta dos semanas.
2. cultura preparación para la infección de Galleria mellonella
Nota: Se debe usar vestimenta de laboratorio adecuado a lo largo de esta parte del protocolo incluyendo guantes, bata y gafas de seguridad.
- Hacer dextrosa peptona de levadura (YPD) líquido y agar las placas. Preparar 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y soluciones de etanol 70%.
- Crecen las cepas de C. albicans que se inyecta durante la noche en 3 mL de YPD fresco en tubos de cultivo estándar en un tambor giratorio de velocidad media y 30 ° C.
- Desactivación células a 2.500 x g durante 5 min en una centrífuga de mesa. Retirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celulares.
- Resuspender las células en 5 mL de PBS 1 x por repetido pipeteo o vórtex. Repetir la centrifugación y la resuspensión de las células en PBS dos veces más para asegurar el retiro de todos los medios de cultivo.
- Después de un lavado final, resuspender las células en 1 mL de PBS y transferirlos a un tubo de microcentrífuga.
- Llevar a cabo una serie de diluciones seriadas en PBS para generar un 1: 100, 1:1, 000 y la serie de diluciones de 1: 100.000.
Nota: Diluciones alternativas pueden ser necesarias para llegar a las cuentas de célula deseada.- Utilizando un hemocitómetro, contar las células de la 1: 100 o la dilución de 1:1,000. Más a menudo, la dilución de 1:1,000 proporciona que el recuento apropiado para los cultivos de C. albicans .
- Calcular la concentración total de células dentro de la cultura inicial usando las matemáticas de la rejilla del hemocitómetro, con el objetivo de entre 30-300 células que se contará en la cuadrícula central de 5 x 5. Un contador de células automatizado puede ser utilizado como una alternativa; sin embargo, uso de densidad óptica para determinar un recuento se desaconseja como morfología de la célula (tamaño, forma, etc.) puede afectar considerablemente su precisión.
- Usando las cuentas de célula medida, haga una nueva dilución de 2.5x107 células/mL en 1 x PBS en un tubo de microcentrífuga. Esta dilución servirá como la base de cada inoculación de g. mellonella con C. albicans. Cada inyección requiere 10 μl de este inóculo para una dosis infecciosa de 250.000 células de C. albicans .
- Confirmar la exactitud de la dosis infecciosa por platear el volumen correcto de la dilución de 1: 100.000 para 100 unidades formadoras de colonias (UFC) en agar YPD para cada cultivo ser utilizado en la infección.
- Incube las placas de recuento de células de paso 2.7 durante 48 horas (h) a 30 ° C y contar el número de colonias por placa. Entre 80 y 120 colonias constituye un margen aceptable de exactitud en el inóculo.
3. infección de larvas de Galleria mellonella con cultivos de Candida
Nota: Se debe usar vestimenta de laboratorio adecuado a lo largo de esta parte del protocolo incluyendo guantes, bata y gafas de seguridad.
- Añadir 1 mL de etanol al 100% y 1 mL de 1 x PBS a dos tubos de microcentrífuga separado. El etanol y PBS se utilizará para lavar la aguja de inyección entre las infecciones.
- Esparza una pequeña cantidad de ropa de cama de waxworm en un vacío, estéril plato de Petri 100 x 15 mm, que albergará las larvas después de la inoculación para cada cepa independiente. Además de la ropa de cama limita la adherencia de muertos las larvas de g. mellonella a la superficie de la placa de Petri.
- Esterilizar un 26 G, jeringa de μl 10 por tomar y eliminar 10 μl de etanol al 70% tres veces seguido de tres lavados con 10 μl de 1 x PBS. Vórtice de la dilución de inoculación de C. albicans y tomar 10 μl de la cultura. Asegurar que no existen burbujas de aire dentro de la jeringa de inyección de aire promueve muerte y complicará el análisis descendente.
- Abra un contenedor de las larvas de g. mellonella y vuelta cama cuidadosamente con un dedo para descubrir las larvas. Seleccionar las larvas que están en buena salud por movimiento activo, color amarillo/tan claro y la falta de pigmentación negra en el cuerpo de las larvas. Estas larvas se deben de tamaño similar en el completo experimental establecer.
- Recoger una sola de las larvas y manténgalo suavemente entre el dedo índice o corazón y el pulgar similar a sostener un lápiz. Rollo de las larvas en su parte trasera por lo que las patas queden hacia arriba. Mantenga toda la longitud del cuerpo entre los dedos y el pulgar para que las larvas es incapaz de enrollamiento o sepárelo de la inyección.
Nota: Si lo desea, esterilizar el sitio de inyección con un hisopo de algodón empapado en etanol al 100%. - Gire la jeringa hasta que el bisel de la aguja quede hacia arriba y lentamente Inserte la punta de la aguja incluyendo la longitud del bisel en el cuerpo en el cruce con la pata izquierda trasera. Asegúrese de que la aguja penetra en el cuerpo y no simplemente empuja el cuerpo hacia dentro de las larvas. No haga fuerza en penetrar el cuerpo como la aguja puede perforar totalmente a través de las larvas rápidamente. Levantar suavemente con la aguja confirmará la adecuada penetración. El inóculo de Candida completo 10 μl de inyectar y extraer la aguja.
- Repita el paso 3.3-3.5 para cada larvas. Para evitar asentamiento, vórtice de la Candida de la célula las culturas para la inoculación después de cada tercera inyección. Como control, se inyectan una serie de g. mellonella con 10 μl de 1 X PBS.
- Casa Co 10 larvas inyectadas de la misma cultura de Candida en cada plato de Petri 100 x 15 mm después de la inoculación. Incubar larvas a 37 ° C durante ocho días, comprobando las larvas cada 24 h para monitorear la muerte.
- Evaluar la mortalidad inicialmente por la pigmentación oscura, la formación de manchas negras o cuerpos y la falta de movimiento. Para confirmar la mortalidad, utilice unas pinzas para rodar suavemente las larvas moribundas en la espalda y empujar ligeramente debajo de las larvas con las pinzas. No respuesta según lo observado por la falta de movimiento visible del cuerpo o la pierna se anotó como la muerte y las larvas se extraen de la caja Petri.
- Registrar la mortalidad de las larvas a lo largo del tiempo. Larvas empiezan a pupar en las polillas pueden incluirse en el análisis pero deben eliminarse si empiezan a mudar. Pupating larvas pueden ser censuradas desde el análisis de punto final como las diferencias de virulencia entre las larvas y pupas no son claros.
- Evaluar la significación estadística mediante el test estadístico de Mantel-Cox.
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Representative Results
Aquí, demostramos un método reproducible para el uso de g. mellonella waxworms investigar un modelo de candidiasis diseminada de la infección con C. albicans. El adecuado almacenamiento, mantenimiento y selección de larvas para la infección son componente fundamental de asegurar reproducibilidad en g. mellonella mortalidad (figura 1A). Larvas sanas que son activas, tienen un color amarillo/tan claro, y parches de falta negros en el cuerpo deben utilizarse para este sistema y son por lo general viable para la infección por hasta dos semanas después de su llegada. Para minimizar los efectos potencialmente confusión de g. mellonella fisiología, las larvas fueron seleccionadas de similar tamaño y peso. Un inóculo bien mezclado y constante inyección en el mismo sitio anatómico del cuerpo de las larvas también son variables importantes en la promoción de reproducibilidad entre experimentos. Un escaparate de imágenes de mantenimiento de larvas infectadas a través de la duración de la experimentación (figura 1B).
Para evaluar el impacto de la edad de las larvas en virulencia, control aparte de PBS infecciones causadas fueron realizadas con larvas de cero o diez días después de llegar. Ninguna diferencia significativa en la cinética de muerte de g. mellonella existió entre estos grupos (figura 2A). Signos característicos de la enfermedad se presentaron en larvas de ambos grupos que sucumbieran a la infección; la coloración amarillo/tan originalmente de las larvas se convirtió descolorida y dio lugar a manchas negras antes de pérdida total de la motilidad y, eventualmente, la muerte (figura 2B). La infección con C. albicans acelera este proceso de decoloración y la morbilidad pero no altera significativamente la cascada de marcadores fenotípicos conduce a la muerte en comparación con larvas no infectadas o PBS inyecta larvas (figura 2C).
La dosis infectiva también significativamente impacto cinética de mortalidad de las infecciones de g. mellonella . Para evaluar los efectos del tamaño del inóculo de C. albicans , infectados por g. mellonella con cuatro aislamientos clínicos diferentes (12 C, P60002, P75010 y SC5314: tabla 1) en tres dosis diferentes. Las larvas infectadas con SC5314 muestran la mortalidad en todas las dosis, consistentes con la mayor patogenicidad de esta cepa en relación a muchos otros utilizados en el experimento (figura 2D). Las larvas más sucumbieron a la infección con 1.0 x 105 SC5314 12 C células comparado con 1.0 x 104 células. La mayor dosis de 1.0 x 106 células resultó excesivamente letal con larvas mueren después de la infección de las cepas incluyendo cepas menos virulentas, P60002 y 12 C. Las larvas inyectadas con P75010 y SC5314 sucumbieron a la infección dentro de 24 h, lo que sugiere que una dosis infecciosa más moderada es apropiada para determinar las diferencias en virulencia. Por lo tanto, una dosis infecciosa de 2.5x105 fue utilizada para todos los experimentos posteriores.
Para demostrar la similitud en la virulencia entre murino y modelos de g. mellonella de enfermedad sistémica, ensayaron virulencia de cepas SC5314 derivado C. albicans codificación o heterozigótico (un/α u homocigótica (una/-o Α /-) MTL loci. Infección de g. mellonella con MTL heterocigotos de la SC5314 o su fondo genético de BWP17 derivado prototrophic producido altas tasas de mortalidad en comparación con animales inyectados de PBS. Tres cuartas partes de las larvas del control sobrevivieron al día 8 frente a pérdidas de más de la mitad de todos los animales de C. albicans inyectado dentro de los 3 días post infección (dpi) que más aumentó en 8 dpi (figura 3A, 3B). La infección con BWP17 humedecido mortalidad de C. albicans en este modelo (supervivencia del 27% en comparación con el 4% de supervivencia en SC5314 MTL heterocigotos en 8 dpi; Figura 3 C, 3D). Las larvas de g. mellonella infectadas con MTLα /-cepas sobrevividas significativamente mayor compararon con las cepas parentales heterocigotos MTL (prueba de log-rank, SC5314; p = 0,0006, BWP17; p = 0,0002). Curiosamente, virulencia del MTLacélulas- C. albicans había emparejado a su homólogo heterozigótica de MTL en antecedentes el SC5314 y BWP17. Por lo tanto, MTL configuración influyen en la virulencia de C. albicans con MTLα /-tensiones muestra matanza disminuida en comparación conun/α MTLo MTLuna/las células.
Figura 1 . Resumen del procedimiento de la infección. (A) un diagrama de flujo destaca los elementos fundamentales del procedimiento infección incluida la adquisición y almacenamiento de las larvas, infección cultura preparación y la inyección. (B) imágenes representativas muestran las condiciones de almacenamiento saludable, preparación del mantenimiento de espacio, inyección y larvas de infección después de la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Los efectos de procedimientos de infección de g. mellonella . (A) PBS controles fueron infectados inmediatamente después de su llegada (PBS-D0, azul) o después de 10 días (PBS-D10, rojo). (B) imágenes representativas destacan muerte y decoloración de las larvas. (C) una serie de imágenes de placas de infección detalle los efectos de la inyección con PBS (medio) o con SC5314 (inferior) en comparación con larvas no infectadas (arriba) los días 1, 3, 5 y 7 después de la inyección. (D) efectos de dosificación se muestran dentro de una colección de aislamientos clínicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . El MTLun alelo promueve el asesinato de C. albicans de g. mellonella. MTL locus heterocigoto (un/α) y homocigóticos (una/- y α /-) SC5314 derivados de (A) y BWP17 (C) se trazan para la mortalidad de las larvas durante ocho días. Intervalos de confianza se grafican para cada SC5314 (B) y BWP17 (D) tensión derivada para resaltar la consistencia en la cinética de mortalidad de las larvas a través de experimentos. La media (línea sólida) se traza con desviaciones de estándar (llenadas en el espacio) para tres réplicas biológicas de 10 larvas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cepa de Candida | Cepa parental | Genotipo | MTL | Referencia |
| MAY1 | SC5314 | Candida albicans cepa clínica | a/α | Wu et al., 2007 |
| MAY6 | P60002 | Candida albicans cepa clínica | un/a | Wu et al., 2007 |
| MAY11 | P75010 | Candida albicans cepa clínica | a/α | Wu et al., 2007 |
| MAY15 | 12C | Candida albicans cepa clínica | un/a | Wu et al., 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | Este estudio |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR | a /- | Este estudio |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | a/α | Este estudio |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α /- | Este estudio |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | a /- | Este estudio |
Tabla 1. S de C. albicanstrenes utilizados en este estudio.
| Componente variable | Control sugerido | Referencia |
| Edad de las larvas en el momento de la inyección | Minimizar el tiempo entre la llegada del gusano y la inoculación | Este estudio |
| Tamaño de las larvas en el momento de la inyección | Garantizar la coherencia al seleccionar gusanos | Fuchs et al., 2010 |
| Salud de las larvas en el momento de la inyección | Orden de gusanos en temperatura moderada, usar inmediatamente a su llegada | Este estudio |
| Dosis infecciosa con C. albicans | Seleccione una concentración infecciosa que presenta la gama más amplia de los resultados | Este estudio |
| Respuesta de las larvas a la inyección | Realizar controles de inyección de PBS con gusanos con ninguna inyección | Hirakawa et al 2015 |
Tabla 2. Consideraciones con respecto a g. mellonella infección.
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Discussion
El modelo de g. mellonella waxworm se erige como una herramienta eficaz para el análisis rápido y reproducible de la virulencia de C. albicans . Este protocolo detallado se basa en una implementación consistente de una dosis infecciosa definida al mismo sitio a través de un lote de larvas. Dosis infecciosa tiene un profundo impacto sobre la mortalidad de g. mellonella mientras que uso de larvas entre su llegada inicial y diez días siguientes a la recepción produjo resultados similares. Pérdida del C. albicansMTLun alelo resultados en consistente con los anteriores experimentos en ratones con menor virulencia aunque interrupción del alelo α MTLno alteró la muerte de las larvas.
El resultado de infecciones por g. mellonella puede ser significativamente afectado por el diseño experimental. En contraste con modelos de vertebrados de la infección, pequeña variación en el tamaño de inóculo, sitio de la inyección y volumen de inóculo puede afectar interpretaciones de los datos. Infecciones con un número creciente de células de C. albicans a morbilidad mayor y más rápida de larvas infectadas. En cierto punto, inyección de demasiados C. albicans aparece capaz de abrumar las defensas de host lleva a la muerte rápida de la hostia, potencialmente a través de choque tóxico. Sin embargo, SC5314 era constantemente la cepa más virulenta en todas las dosis, seguido de 12C y luego las otras cepas. Por lo tanto, parámetros de infección tienen un profundo impacto en la cinética absoluta de infecciones pero todavía pueden proporcionar estimaciones de virulencia relativa. Trabajo previo en estos experimentos demostró aún más la importancia de lavarse bien las células de Candida . YPD residual incluida en el bolo de inyección significativamente disminuye la supervivencia de las larvas (datos no mostrados).
Gusano la salud es una variable crítica al realizar los experimentos de g. mellonella . Las larvas transportadas mediante envío a mediados del verano a menudo llegan prematuramente envejecido o estresado, cubiertos con parches negros, con viabilidad disminuida. Ningún papel significativo para el tamaño de las larvas sobre la morbilidad se ha observado previamente aunque los experimentos descritos aquí se centraron en análisis de larvas de masa más o menos equivalente. Las larvas sanas y PBS control larvas se deben ejecutar siempre con grupos de infección para tener en cuenta los cambios en la viabilidad de larvas entre las réplicas biológicas realizadas en diferentes días. G. mellonella infectados diez días después de llegar emparejada la cinética de las larvas infectadas inmediatamente sobre el recibo. Por lo tanto, un único cargamento de larvas puede proporcionar suficiente material y tiempo para realizar experimentos completos. Estos experimentos dependían de 30 animales por cepa para determinar diferencias en virulencia, que es significativamente más animales que normalmente utilizados en modelos murinos, lo que resulta en mayor confianza de resultados observados11,27 , 28. este modelo reducido también preocupaciones éticas, tiempo y costos comparados con modelos de vertebrados de la infección. Así, el uso de larvas de cera puede facilitar la identificación de efectos más pequeños en virulencia sistémica que es posible en otros sistemas.
ADVERTENCIAS inherentes al sistema de g. mellonella existen que limitan su utilidad en el estudio de las interacciones huésped-patógeno. En primer lugar, g. mellonella carecen de un sistema inmune adaptativo y no puede utilizarse para investigar antigenicidad o memoria inmunológica como en eucariotas superiores29. El cuerpo de las larvas se compone de una sola cavidad continua llenada de hemolinfa, que funcionan para hacer circular los nutrientes, señalización de moléculas, las células inmunes y péptidos antimicrobianos. Estas células inmunitarias, hemocitos, comportarse de manera similar a los neutrófilos y pueden por lo tanto fagocitar, generar explosiones oxidativas y secretan enzimas líticas tras activación a través de receptores de reconocimiento de patógeno extracelular30. Sin embargo, esta función es un subconjunto de los procesos de la célula inmune innata dentro de sistemas de cordado que totalmente no pueden reflejar todas las actividades del leucocito. Otra salvedad importante es la falta de una Asamblea del genoma de g. mellonella aunque el genoma fue secuenciado recientemente31. Por lo tanto, se desconoce la magnitud de la diversidad genotípica dentro de la especie y probable mayoría de los proveedores nave poblaciones genéticamente heterogéneas que pueden afectar la mortalidad a través de experimentos. Además, las técnicas moleculares no existen para el organismo y complican cualquier intento de diseccionar contribuciones de host a la patogenesia. Sin embargo, resultados consistentes de la virulencia después de la infección con C. albicans a través de experimentos, proveedores, tiempo y laboratorios admite su utilidad en cuestiones fundamentales de patogenicidad.
Reducen las pérdidas de MTLuna virulencia de C. albicans en relación con la MTL heterocigotos y MTLα homozigoto antecedentes. Esta tendencia es consistente con trabajos previos realizados utilizando modelos de ratón de virulencia sistémica26. En contraste con modelos murinos, pérdida de MTLα no alteró de virulencia con respecto a la MTLun/α cepa parental. La discrepancia entre estos resultados es confusa pero puede incluir componentes de la inmunidad adaptativa que faltan en organismos invertebrados. Alternativamente, mayor virulencia asociada a MTL heterocigoto puede ser atribuible sólo al MTLα alelo SC5314, potenciando la necesidad de evaluación a través de múltiples fondos de cepa. Por lo tanto, sugerimos un papel diferencial de virulencia entre los dos alelos MTL .
En general, el modelo de g. mellonella sirve como un modelo rápido y reproducible para evaluar la candidiasis sistémica. Otras lecturas de virulencia pueden ensayarse con este modelo incluyendo hongos prevalencia por placas Homogenato de larvas para colonias formando unidades (UFC)11 o bioluminiscencia, que también proporciona localización hongos32. En el futuro, este modelo puede ser ampliado para evaluar características de virulencia de otras especies de Candida como resistencia elevada en la recién emergente de especies de Candida auris 33. Desarrollo de herramientas para visualizar linfocitos dentro de g. mellonella interactuando con infección de cándida, linajes endogámicos waxworm para reducir variabilidad en los resultados de las infecciones y visualización del proceso infectivo vía periodista Candida líneas34 aún más refinar este modelo de la enfermedad y permiten más profundas investigaciones de en vivo interacciones huésped-patógeno.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer la ayuda de Pamela Washington y Leah Anderson en la obtención de Galleria mellonella para su uso en este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
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