Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Galleria mellonella Waxworm infektion modell för disseminerad Candidiasis

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58914

Summary

Galleria mellonella fungerar som en ryggradslösa modell för disseminerad candidiasis. Här, vi detalj infektionen protokoll och ge underlag för modellens effektivitet.

Abstract

Candida -arter är gemensamma svamp förknippas av människor kolonisera den hud, slemhinnor och mag-tarmkanalen. Under vissa förutsättningar, kan Candida växa över sina naturliga nischer som resulterar i försvagande slemhinne infektioner som väl som livshotande systemiska infektioner, som är ett stort fokus på utredning på grund av deras associerade hög dödlighet. Djurmodeller av disseminerad infektion finns för att studera sjukdomsutveckling och dissekera kännetecknen av Candida patogenicitet. Av dessa ger Galleria mellonella waxworm infektion modellen en kostnadseffektiv experimentella verktyg för hög genomströmning undersökningar av systemisk virulens. Många andra bakteriella och eukaryota infektiösa agens har effektivt studerats i G. mellonella att förstå patogenicitet, gör det allmänt accepterade modellsystem. Ännu, variation i den metod som används för att infektera G. mellonella kan ändra fenotypiska utfall och komplicera tolkningen av resultaten. Här, beskriver vi fördelar och nackdelar av waxworm modell att studera systemisk Candida patogenes och beskriva en strategi för att förbättra reproducerbarheten. Våra resultat belysa utbudet av dödlighet kinetics i G. mellonella och beskriver de variabler som kan modulera dessa kinetik. I slutändan står denna metod som en etisk, snabb och kostnadseffektiv metod att studera virulens i en modell av disseminerad candidiasis.

Introduction

Candida -arter är vanliga mänskliga förknippas som kan utvecklas till opportunistiska patogener i kraftigt nedsatt immunförsvar och dysbiotic patienter. Även om många Candida arter kan orsaka sjukdom, är C. albicans den vanligaste orsaken till disseminerad candidiasis1,2. Systemisk sjukdom resulterar från C. albicans åtkomst till blodomloppet genom antingen direkt penetration av tidigare restriktiva värd hinder eller introduktion på kirurgiska webbplatser och andra överträdelser av kroppen3. Candida -arter utnyttja en rad patogena processer att orsaka systemisk sjukdom inom värden inklusive filamentation, biofilm bildning, immunceller skatteflykt och fly och järn rensning4. In vitro -metoder finns för att undersöka enskilda patogena mekanismer, men djurmodeller fortsätta att tillhandahålla det bästa alternativet att undersöka hela sjukdomen resultatet5,6. Tidigare forskning har detaljerade många förekomster av lovande in vitro- undersökningar av virulens underlåta att reproducera i vivo7,8. Således, djurmodeller är fortfarande krävs för att bedöma virulens invivo. De flesta sjukdomsmodeller lita på möss att tjäna som ett surrogat för mänskliga infektioner trots C. albicans oförmåga att naturligt kolonisera murina system som en kommensaler9. Ryggradslösa modeller av disseminerad candidiasis inkluderar Nematoden Caenorhabditis elegans, frukten flyga Drosophila melanogaster, och waxworm Galleria mellonella, trots farhågor om grundläggande skillnader grundläggande fysiologi, har mottagande organ temperaturer, och exponeringsvägar hindras deras bred acceptans10,11.

G. mellonella waxworm infektion modellen har nyligen antagits till modell patogenicitet av ett brett utbud av bakterie- och svamp patogener12,13,14. Fördelar med denna modell inkluderar dess relativt låga kostnader, ökad genomströmning, användarvänlighet och minskad etiska betänkligheter angående djur Godhetsprincipen jämfört med murin modeller. För forskare leder detta till ökad förmåga att testa flera variabler, starkare konfidensintervall, mer snabb experimenterande och förbikopplingen av animaliskt protokoll. G. mellonella har fungerat som en plattform för att snabbt bedöma C. albicans virulens efter störning av gener krävs för biofilm bildning, filamentation och gen förordning över kliniska isolat11,15 ,16. Nyligen genomförda studier har införlivat utredning av svampdödande effekt använder G. mellonella för att utvärdera farmakokinetiken av drogen aktivitet och motstånd under i vivo inställningar, som är annars utmanande och tidskrävande 17,18. Ännu, studier av C. albicans virulens i G. mellonella har komplicerats av enligt uppgift höga variation inom experiment och inkonsekvent protokoll mellan forskargrupper som producerar olika virulens fenotyper mellan möss och waxworms11,13,19,20,21. Här, beskriver vi ett G. mellonella protokoll för att standardisera C. albicans infektioner, ökning reproducerbarhet i virulens experiment och visa deras överensstämmelse med tidigare beskrivna studier av virulens i murin modeller.

Tidigare studier har visat att den C. albicans parning typ-liknande (MTL) locus på kromosom 5 reglerar cellidentiteten och parning kompetens liknar Saccharomyces cerevisiae och andra Ascomycete svampar22. Majoriteten av C. albicans isolat är heterozygot på det MTL locus, kodning en av varje av de MTLen och MTLα allelerna (MTLen/α), och är följaktligen steril15, 23 , 24. förlusten av en av de MTL allelerna genom förlust av heterozygositet (LOH) eller mutation leder till homozygot MTLen eller MTLα stammar som kan genomgå en fenotypisk switch från steril 'vit' staten till den parning behöriga 'ogenomskinlig' statens25. Tidigare arbeten har belyst att förlust av MTL heterozygositet också minskar virulens i murina modeller av systemisk infektion över annan stam bakgrunder26. Här, detalj vi G. mellonella modellen för disseminerad candidiasis med en genetiskt lika experimentell för att skildra MTL heterozygositet till virulens i G. mellonellabidrag. Vi visar att MTL konfiguration påverkat C. albicans patogenicitet, där MTLα stammar var mindre virulenta med avseende på både MTLen/α och MTLen celler, liknande fynd inom murina infektion modell26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder beskrivs förlita sig på användning av ryggradslösa värdar och kräver inte institutionella djur hand och använda kommittén (IACUC) godkännande.

1. galleria mellonella Waxworm larver

  1. Beställa larver från grossister och leverantörer som inte introducerar hormoner, antibiotika eller andra behandlingar för att larverna och som klarar att transportera och leverera levande exemplar.
    1. Glöm inte att köpa alla larver från samma leverantör under loppet av experimenterande. Var försiktig när du beställer larver under sommarmånaderna när temperaturer över 30 ° C minskar larver livskraft.
    2. Övervaka temperaturer över sträckan beräknade frakt och planera frakt och leverans eller välja skyndsam sjöfarten att minimera deras exponering för miljöfaktorer.
  2. När larverna anländer, kontrollera varje behållare för att säkerställa livskraftiga, friska larver finns. Friska larver kommer att vara helt nedsänkt under sängkläder, flytta, och äger en ljus gul/tan färg med några larver som innehåller svarta märken eller missfärgningar längs kroppen.
  3. Lagra larver i deras behållare i ett ventilerat utrymme vid rumstemperatur (25 ° C). Beroende på det inledande villkoret av larverna, kan de användas i upp till två veckor.

2. kultur förberedelse för Galleria mellonella infektion

Obs: Ordentlig lab klädsel bör bäras under hela denna del av protokollet inklusive handskar, laboratorierock och skyddsglasögon.

  1. Gör jäst pepton dextros (YPD) vätska och agar plattor. Bered 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 70% etanol lösningar.
  2. Växa C. albicans stammar ska injiceras under natten 3 ml färsk YPD i standard kultur rören på en roterande trumma på medellång hastighet och 30 ° C.
  3. Snurra celler ner vid 2500 x g i 5 min i en bordsskiva centrifug. Häll av supernatanten, vara noga med att inte störa cellpelleten.
    1. Att resuspendera cellerna helt i 5 mL 1 x PBS av upprepad pipettering eller vortexa. Upprepa de centrifugering och resuspension av celler i PBS två gånger mer för avlägsnande av alla kultur media.
  4. Efter en sista tvätt, Omsuspendera cellerna i 1 mL PBS och överföra dem till en mikrocentrifug rör.
  5. Genomföra en uppsättning seriespädningar i PBS att generera en 1: 100, 1:1, 000, och 1:100,000 spädningsserien.
    Obs: Alternativa utspädningar kan vara nödvändigt att nå önskad blodkroppar.
    1. Använder en hemocytometer, räkna celler från antingen den 1: 100 eller 1:1,000 utspädning. Oftast, ger 1:1,000 utspädning cellen lämpliga räknas för C. albicans kulturer.
    2. Beräkna total koncentration av celler inom den ursprungliga kulturen med hjälp av rutnätet matten av den hemocytometer, siktar på mellan 30-300 celler som ska räknas i den centrala 5 x 5 rutnätet. En automatiserad cell räknare kan användas som ett alternativ; användning av optiska densitet att bestämma blodkroppar avråds som cellmorfologi (storlek, form, etc.) kan dock påverka dess riktighet.
  6. Använda de uppmätta blodkroppar, göra en ny utspädning av 2.5x107 celler/mL i 1 x PBS i en mikrocentrifug rör. Denna utspädning kommer att ligga till grund för varje inokulering av G. mellonella med C. albicans. Varje injektion behöver 10 µL av denna inokulum för en smittsam dos av 250.000 C. albicans celler.
  7. Bekräfta riktigheten av infektiös dos av plätering den korrekta volymen av 1:100,000 utspädning för 100 kolonin bildar enheter (CFUs) på YPD agar för varje kultur som ska användas i infektion.
  8. Inkubera cell count tallrikar från steg 2,7 i 48 timmar (h) vid 30 ° C och räkna antalet kolonier per platta. Mellan 80 och 120 kolonier utgör ett godtagbart intervall för riktigheten i inokulatet.

3. infektion av Galleria mellonella larver med Candida kulturer

Obs: Ordentlig lab klädsel bör bäras under hela denna del av protokollet inklusive handskar, laboratorierock och skyddsglasögon.

  1. Tillsätt 1 mL 100% etanol och 1 mL 1 x PBS till två separata mikrocentrifugrör. Den etanol och PBS används för att tvätta injektionsnålen mellan infektioner.
  2. Sprid en liten mängd waxworm sängkläder i en tom, 100 x 15 mm steril petriskål, som kommer huset larvaena efter ympning för varje oberoende stam. Tillägg av sängkläder begränsar följsamhet av döda G. mellonella larver till petriskål ytan.
  3. Sterilisera en 26 G, 10 µL sprutan genom att ta och utplåna 10 µL av 70% etanol tre gånger följt av tre tvättar med 10 µL 1 x PBS. Vortex inympning utspädning av C. albicans och tar upp 10 µL av kultur. Se till att det inte finns några luftbubblor i sprutan som injektion av luft främjar död och kommer att komplicera nedströms analys.
  4. Öppna en container med G. mellonella larverna och noggrant vänd sängkläder med ett finger för att avslöja larver. Välj larver som är vid god hälsa som identifierats av aktiv rörelse, en ljus gul/tan färg och brist på svart pigmentering på larver kroppen. Dessa larver fastställas av liknande storlek över hela experimentella.
  5. Plocka upp ett enda larver och håll den försiktigt mellan index-och/eller långfingret och tummen liknar hålla en penna. Rulla larverna på dess rygg så benen vänd uppåt. Håll hela längden av kroppen mellan fingrarna och tummen så att larverna är oförmögen att krypa eller dra bort från injektionen.
    Obs: Om du vill sterilisera injektionsstället med en bomullstuss indränkt i 100% etanol.
  6. Rotera sprutan så nålens avfasning vänd uppåt och långsamt in nålspetsen inklusive längden på avfasningen in i kroppen vid korsningen med bakersta vänster ben. Se till att nålen penetrerar kroppen och inte helt enkelt tvingar kroppen av larver inåt. Använd inte kraft tränger in kroppen som nålen kan genomborra helt genom larver snabbt. Försiktigt lyfta med nålen kommer att bekräfta lämplig penetration. Injicera det full 10 µL Candida inokulatet och extrahera nålen.
  7. Upprepa steg 3,3-3,5 för varje larver. Att förhindra cell avveckling, vortex Candida kulturer för inympning efter varje tredje injektionen. Som en kontroll, injicera en uppsättning G. mellonella 10 µL 1 X PBS.
  8. Samtidig hus 10 larver injiceras från samma Candida kultur i varje 100 x 15 mm petriskål efter ympning. Inkubera larver vid 37 ° C i åtta dagar, kontroll larver varje 24 h för att övervaka död.
    1. Utvärdera dödlighet initialt av mörka pigmentering, bildandet av svarta fläckar eller organ, och en avsaknad av rörelse. För att bekräfta dödlighet, använda pincett att rulla försiktigt döende larver på sin rygg och lätt peta larvernas undersida med pincetten. Icke-lyhördhet som observerats av en avsaknad av synliga kroppen eller benet rörelsen poängsätts som döden och larverna tas bort från petriskål.
  9. Spela in larver dödlighet över tid. Larver som börjar att förpuppas i nattfjärilar kan inkluderas i analysen men bör tas bort om de börjar molt. Pupating larver kan censureras från slutpunkten analys som virulens skillnaderna mellan larver och puppor är oklart.
  10. Bedöma statistisk signifikans med Mantel-Cox statistiska test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här visar vi en reproducerbar metod för användning av G. mellonella waxworms att undersöka en disseminerad candidiasis modell av infektion med C. albicans. Den lämplig för förvaring, underhåll och urval av larver för infektion är kritisk komponent i försäkring reproducerbarhet i G. mellonella dödlighet (figur 1A). Friska larver som är aktiva, har en ljus gul/tan färg, och brist på svarta fläckar på kroppen bör användas för detta system och är vanligtvis bärkraftiga för infektion upp till två veckor efter ankomst. För att minimera eventuella potentiellt störande effekter av G. mellonella fysiologi, valdes larver av liknande storlek och vikt. En välblandad inokulum och förenlig injektion på samma anatomiska platsen av larver kroppen står också som viktiga variabler att främja reproducerbarhet mellan experiment. Bilder Visa upp underhåll av infekterade larver genom varaktigheten av experiment (figur 1B).

För att bedöma effekterna av larver ålder på virulens, utfördes separat PBS kontroll infektioner med larver antingen noll eller tio dagar efter ankomsten. Ingen signifikant skillnad i kineticsen av G. mellonella döden fanns mellan dessa grupper (figur 2A). Karakteristiska tecken på sjukdom uppstod i larver från båda grupperna som dukade under till infektionen; Ursprungligen gul/tan färgning av larverna blev missfärgad och gav vika för svarta fläckar innan total förlust av motilitet och så småningom död (figur 2B). Infektion med C. albicans påskyndar denna process av missfärgning och sjuklighet men ändrar inte avsevärt kaskaden av fenotypiska markörer leder till döden jämfört med icke-infekterade larver eller PBS injiceras larver (figur 2C).

Den smittsam dos också avsevärt påverkar dödlighet kinetik av G. mellonella infektioner. För att bedöma effekterna av C. albicans inokulum storlek, vi smittade G. mellonella med fyra olika kliniska isolat (12 C, P60002, P75010 och SC5314: tabell 1) vid tre olika doser. Larver som smittats med SC5314 visas dödlighet vid alla doser, förenliga med ökad patogenicitet av denna isolatet i förhållande till de flesta andra används inom experimentet (figur 2D). Fler larver dukade under till infektion med 1,0 x 105 SC5314 eller 12 C-celler jämfört med 1,0 x 104 celler. Den högsta dosen av 1,0 x 106 celler visade sig vara alltför dödliga med larverna dör efter infektion av alla stammar som är inklusive de mindre virulenta isolat, P60002 och 12 C. Larver som injiceras med P75010 och SC5314 dukade under till infektion inom 24 h, vilket tyder på en mer måttlig infektiös dos är lämpligt att fastställa skillnader i virulens. Följaktligen användes en infektiös dos 2.5x105 för alla efterföljande experiment.

För att Visa likheten i virulens mellan murint och G. mellonella modeller av systemisk sjukdom, vi analyseras virulens SC5314-derived C. albicans stammar kodning antingen heterozygot (en/α eller homozygot (en/-eller Α /-) MTL loci. Infektion av G. mellonella med MTL heterozygoter från antingen i SC5314 eller dess prototrophic härledda BWP17 genetiska bakgrund producerat höga andelen dödlighet jämfört med PBS-injiceras djur. Tre fjärdedelar av larvaena kontroll överlevde till dag 8 jämfört med förlust av över hälften av alla C. albicans injiceras djur inom 3 dagar efter infektion (dpi) som ytterligare ökade på 8 dpi (figur 3A, 3B). Infektion med BWP17 dämpade C. albicans dödlighet i denna modell (27% överlevnad jämfört med 4% överlevnad i SC5314 MTL heterozygoter 8 dpi; Figur 3 C, 3D). G. mellonella larver smittats med MTLα /-stammar överlevde betydligt längre jämfört med de MTL heterozygota föräldrarnas stammarna (log-rank-test, SC5314; p = 0,0006, BWP17; p = 0,0002). Intressant, matchade virulens MTLen/-C. albicans celler dess MTL heterozygot motsvarighet i både SC5314 och BWP17 bakgrunder. Således, MTL konfiguration har en påverkan på C. albicans virulens med MTLα /-stammar visar minskad dödande jämfört med antingen MTLen/α eller MTLen/-celler.

Figure 1
Figur 1 . Översikt av infektion förfarande. (A) ett flödesschema belyser de viktigaste beståndsdelarna av förfarandet infektion inklusive beställning och lagring av larver, infektion kultur beredning och injektion. (B) representativa bilder visar friska förvaring, beredning av infektion utrymme, injektion och larver underhåll efter infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Effekterna av G. mellonella infektion förfaranden. (A) PBS kontroller var infekterade antingen omedelbart efter ankomsten (PBS-D0, blå) eller efter 10 dagar (PBS-D10, röd). (B) representativa bilder belysa larver missfärgning och döden. (C) en bild serie av infektion plattor detalj effekterna av injektion med PBS (mitten) eller SC5314 (lägre) jämfört med icke-infekterade larver (överst) på dag 1, 3, 5 och 7 efter injektion. (D) dosering effekter visas inom en samling av kliniska isolat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . MTLen allel främjar C. albicans dödandet av G. mellonella. MTL locus heterozygot (en/α) och homozygot (en/- och α /-) SC5314 (A) och BWP17 (C) derivat är ritade för larver dödlighet under åtta dagar. Konfidensintervallen är ritade för varje SC5314 (B) och BWP17 (D) derivat stam att belysa konsekvens i kineticsen av larver dödlighet över experiment. Genomsnittligt (heldragen linje) ritas med standardavvikelser (ifyllt utrymme) för tre biologiska replikat av varje 10-larver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Candida stam Föräldrarnas stam Genotyp MTL Referens
MAY1 SC5314 Candida albicans kliniska isolatet a/α Wu et al. 2007
MAY6 P60002 Candida albicans kliniska isolatet en/ett Wu et al. 2007
MAY11 P75010 Candida albicans kliniska isolatet a/α Wu et al. 2007
MAY15 12C Candida albicans kliniska isolatet en/ett Wu et al. 2007
MAY61 SC5314 MTLa:: SAT1 Α /- Denna studie
MAY71 SC5314 MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-HYGR en /- Denna studie
MAY313 BWP17 ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 a/α Denna studie
MAY314 BWP17 ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 Α /- Denna studie
MAY315 BWP17 ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 en /- Denna studie

Tabell 1. C. albicans ståg som används i denna studie.

Rörlig del Föreslagna kontroll Referens
Larverna ålder vid tidpunkten för injektion Minimera tiden mellan mask ankomst och inympning Denna studie
Larverna storlek vid tiden för injektion Säkerställa enhetlighet när du väljer maskar Fuchs et al. 2010
Larverna hälsa vid tiden för injektion Beställa maskar under måttlig temperatur, använda omedelbart vid ankomsten Denna studie
Smittsam dos med C. albicans Välj en infektiös koncentration som presenterar bredaste utbud av resultat Denna studie
Larverna svar till injektion Utföra PBS insprutning kontroller tillsammans med maskar med ingen injektion Hirakawa et al. 2015

Tabell 2. Överväganden avseende G. mellonella infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

G. mellonella waxworm modellen står som ett effektivt verktyg för snabba och reproducerbara analys av C. albicans virulens. Detta detaljerade protokoll förlitar sig på konsekvent leverans av en definierad infektiös dos till samma plats över ett parti av larver. Smittsam dos har en djupgående inverkan på G. mellonella dödlighet medan användning av larver mellan sin första ankomst och tio dagar från mottagandet gav liknande resultat. Förlust av C. albicansMTLen allel resulterar i minskad virulens överensstämmer med tidigare experiment på möss även om störningar av MTLα-allelen inte förändrade larver död.

Resultatet av G. mellonella infektioner kan avsevärt påverkas av experimentell design. I motsats till ryggradsdjur modeller av infektion, kan liten variation i injektionsstället, inokulum volym och inokulum storlek påverka tolkningar av data. Infektioner med ökande numrerar av C. albicans celler ledde till större och snabbare sjuklighet av infekterade larver. Vid en viss punkt visas injicera alltför många C. albicans kan överväldigande värd försvar leder till snabb döden för värden, eventuellt genom toxisk chock. SC5314 var dock konsekvent den mest virulenta påfrestningen vid alla doser, följt av 12C, och sedan de andra stammarna. Således, infektion parametrar har en djupgående inverkan på absoluta kineticsen av infektioner men kan fortfarande ge uppskattningar av relativa virulens. Tidigare arbete inom dessa experiment visat ytterligare vikten av att tvätta noga Candida cellerna. Kvarstående YPD inkluderad i injektionen bolus avsevärt minskar larver överlevnad (inga data anges).

Masken hälsa är en avgörande variabel när genomföra G. mellonella experiment. Larver som transporteras med standardleverans mitt i sommaren ofta anländer tidigt åldern eller stressad, täckt med svarta fläckar, med minskad lönsamhet. Ingen betydande roll för larver storlek på sjuklighet har observerats tidigare även om de experiment som beskrivs här fokuserat på testmetoder larver av ungefär motsvarande massa. Friska larver och PBS kontroll larver ska alltid köras tillsammans med infektion grupper att ta hänsyn till eventuella ändringar i larver viabilitet mellan biologiska replikat utförs på separata dagar. G. mellonella infekterade tio dagar efter anländer matchas kineticsen av larver smittats omedelbart vid mottagandet. En enda sändning av larver kan således ge tillräckligt material och tid för att utföra fullständig experiment. Dessa experiment åberopas 30 djur per stam att avgöra skillnader i virulens, vilket är betydligt mer djur än vanligtvis utnyttjas i murina modeller, vilket resulterar i starkare förtroende av observerade resultat11,27 , 28. denna modell minskade också etiska frågor, tid och kostnader jämfört med ryggradsdjur modeller av infektion. Således, användning av vax larver kan underlätta identifiering av mindre effekter på systemisk virulens än är möjligt i andra system.

Inneboende varningar till G. mellonella systemet finns som begränsar dess användbarhet i studerar värd-patogen interaktioner. Först G. mellonella saknar en adaptiva immunsystemet och kan inte användas för att undersöka antigenicitet eller immunologiskt minne som i högre eukaryotes29. Kroppen av larverna består av en enda kontinuerlig hålighet fylld med hemolymph, som funktion för att cirkulera näringsämnen, signaling molekyler, immunceller och antimikrobiella peptider. Dessa immunceller, hemocytes, kan beter sig på samma sätt som neutrofiler och därför phagocytose, generera oxidativ skurar och utsöndrar lytisk enzymer efter aktivering via extracellulära patogener erkännande receptorer30. Ändå, denna funktion är en delmängd av medfödda immunceller processer inom Ryggsträngsdjur system som inte kanske helt återspeglar alla leukocyt aktiviteter. En annan stor förbehållet är avsaknaden av en genomet församling för G. mellonella även om genomet var nyligen sekvenserat31. Följaktligen, omfattningen av genotypisk mångfald inom arter är okänd och de flesta leverantörer sannolikt fartyg genetiskt heterogena populationer som kan påverka dödlighet över experiment. Dessutom molekylärbiologiska metoder inte finns för organismen och komplicera alla försök att dissekera värd bidrag till patogenes. Ännu, konsekvent virulens resultat efter infektion med C. albicans över experiment, leverantörer, tid och labs stöder deras nytta i grundläggande frågor för patogenicitet.

Förlust av MTLen minskad virulens av C. albicans i förhållande till MTL heterozygoter och MTLα homozygote bakgrunder. Denna trend är förenligt med tidigare arbete som utförs med hjälp av mus-modeller av systemisk virulens26. I motsats till murina modeller förändrade inte förlust av MTLα virulens i förhållande till MTLen/α föräldraledighet stammen. Skillnaden mellan dessa resultat är oklart men kan innehålla komponenter av adaptiv immunitet som saknas i ryggradslösa organismer. Alternativt, ökad virulens associerade med MTL heterozygositet kan vara endast tillskrivas den MTLα allelen i SC5314, potentierande bedömning över flera stam bakgrunder. Vi föreslår därför en differentiell roll för virulens mellan de två MTL allelerna.

Övergripande, G. mellonella modell tjänar som snabba och reproducerbara modell för bedömning av systemisk candidiasis. Andra avläsning av virulens kan analyseras med denna modell inklusive svamp prevalensen av plätering larver Homogenatet för kolonibildande enheter (CFUs)11 eller Mareld, som också ger svamp lokalisering32. I framtiden kommer denna modell kan utökas för att bedöma virulens kännetecken för andra Candida arter såsom förhöjd resistens i den nya framväxande Candida auris arter33. Fortsatt utveckling av verktyg för att visualisera lymfocyter inom G. mellonella interagerar med infektera Candida, inavlade waxworm härstamningar att minska variationen i infektioner utfall och visualisering av infektiös processen via reporter Candida linjer34 kommer att ytterligare förfina denna modell av sjukdom och tillåta djupare utredningar av in vivo värd-patogen interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna hjälp av Pamela Washington och Leah Anderson att erhålla Galleria mellonella för användning i denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Galleria mellonella Snackworms.com Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe Hamilton 80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack Fisher FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack VWR 87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL VWR 97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL Millipore Sigma EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
  2. Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
  3. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
  4. Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
  5. Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
  6. Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
  7. Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
  8. Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
  9. Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
  10. Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
  11. Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
  12. Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
  13. Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
  14. Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
  15. Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
  16. Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
  17. Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  18. Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
  19. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
  20. Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
  21. Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
  22. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
  23. Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
  24. Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
  25. Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
  26. Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
  27. Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
  28. Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
  29. Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
  30. Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
  31. Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
  32. Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
  33. Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
  34. Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).

Tags

Immunologi och infektion fråga 141 Candida albicans Galleria mellonella waxworm candidiasis virulens sjukdomsmodeller insekt modell infektion
<em>Galleria mellonella</em> Waxworm infektion modell för disseminerad Candidiasis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunn, M. J., Woodruff, A. L.,More

Dunn, M. J., Woodruff, A. L., Anderson, M. Z. The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis. J. Vis. Exp. (141), e58914, doi:10.3791/58914 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter