Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En ny Transportabel In Vitro eksponering kassette for Aerosol prøveudtagning

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58916
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Life Science Engineering, Virginia Commonwealth University

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at udføre bærbare cellulære aerosol engagementer og måle cellulære reaktion. Metoden bruger celler, dyrkes på grænsefladen luft-væske, efterligne i vivo fysiologi. Cellulære reaktion på kobber nanopartikel aerosoler blev observeret som oxidativt stress gennem reaktive ilt arter generation og cytotoksicitet som laktat dehydrogenase udgivelse.

Abstract

Denne protokol indfører et nyt in vitro- eksponering system, som kan bæres, herunder dens karakteristika og ydeevne. Air-liquid interface (ALI) in vitro- eksponering systemer er ofte store og pladskrævende, vanskeliggør transport til feltet og drift ved kilden af emission eller inden for indåndingszonen. Gennem miniaturisering af systemerne, kan laboratoriet bringes til feltet, fremskynde behandlingstid og giver en mere passende eksponering metode, der ikke ændrer aerosol før du kontakter cellerne. Transportabel In vitro eksponering kassette (PIVEC) tilpasser en 37 mm filter kassette til in vitro- toksicitet test uden for en traditionel laboratorium indstilling. PIVEC var kendetegnet ved hjælp af tre størrelser af kobber nanopartikler til at bestemme deposition effektivitet baseret på gravimetrisk og partikel nummer koncentration analyse. Indledende cytotoksicitet eksperimenter blev udført med udsatte Lungeceller at fastslå systemets evne til at deponere partikler samtidig opretholde cellernes levedygtighed. PIVEC giver et tilsvarende eller større deposition effektivitet hvor sammenligner hen til rådighed vinkelrette flow i vitro eksponering enheder. Trods lavere prøve overførselshastigheden giver den lille størrelse nogle fordele til nuværende in vitro- ALI eksponering systemer. Disse omfatter evnen til at blive båret til personlige overvågning, mobilitet fra laboratoriet til kilden til emission, og mulighed for at set-up flere systemer til rumlige opløsning samtidig opretholde en lavere bruger omkostninger. PIVEC er et system, der er i stand til at indsamle aerosoler i feltet og i indåndingszonen på en luft-interface, in vitro- model.

Introduction

Personlige prøvetagning ved hjælp af in vitro- teknikker kunne give omfattende oplysninger om de biologiske virkninger af aerosoler på arbejdspladsen. 1 udsættelse for forurenende stoffer i luften omfatte engagementer med kemiske, at de indsamlede Luftprøver neddykket betingelser hvor gassen er introduceret til cellesuspension, intermitterende engagementer ved hjælp af en enhed som en rocker eller direkte engagementer på luft-flydende interface (ALI). 2 mange af disse teknikker er udført med celler dyrket i suspension eller indsamling af prøver før eksponering, som kan påvirke den toksikologiske undersøgelse på grund af potentielle ændringer i aerosol. 3 for at undgå disse ændringer, laboratoriet kan bringes til feltet ved hjælp af flere in vitro- ALI kultur eksponering systemer, der anvendes i litteratur,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 dog få er kommercielt tilgængelige. 8 , 9 , 12 disse systemer er ofte voluminøse, især når herunder instrumenter til regulering af temperatur og luftfugtighed af det cellulære miljø og strømningshastigheden af prøven aerosol. Ved hjælp af PIVEC, kan aerosol engagementer udføres uden for en traditionel lab indstilling eller inden for indåndingszonen mens efterligne indånding betingelser.

Bestemmelse af aerosol deposition i vitro er vigtigt til undersøgelse af sundhedsvirkninger som følge af indånding. Indåndingszonen, området inden for 30 cm fra munden og næsen,14 er afgørende for forståelse eksponering for nanopartikler og linker til de biologiske virkninger i lungerne. 2 ofte, deposition på celler er defineret som en aflejring effektivitet, partikler deponeret på og taget af celler opdelt af partikler system6,15 eller på en masse grundlag af de samme beløb. 4 , 16 de nuværende metoder til måling af aerosoler i indåndingszonen er filter baseret, indfange partikler over en given stikprøveperioden og bruge filtre til at foretage yderligere test. 17 personlige overvågning kræver en lille system, der kommer med afvejning af færre prøver.

Der er mange tilgange til at bestemme de sundhedsmæssige virkninger af eksponering for en aerosol. ALI model giver mulighed for aerosol skal indgives direkte til celler gennem luften som en reel eksponeringsscenarie, men det er mere omkostningseffektivt og mindre tid på intensiv end in vivo undersøgelser mens efterligne luft-flydende hindringer såsom øjne, huden, og lunger. Lungeceller dyrkes i ALI har evnen til at generere en polariseret barriere lag,18,19 , som producerer fysiologiske træk, der ligner i vivo lunge epitel, herunder produktion af slim og overfladeaktivt stof i specifikke bronkial eller alveolær cellelinjer, cilia slå,19 stram vejkryds,19,20 og celle polarisering. 18 ændringer som disse kan påvirke det cellulære respons målt i undersøgelser af toksicitet. 21 desuden ALI i vitro model resultater er ofte mere følsomme end celler udsat via suspension modeller22 og er i stand til model akut i vivo toksicitet ved indånding. 23 , 24 derfor, en ALI eksponering system, der er i stand til at udføre målinger inden for indåndingszonen er et naturligt næste skridt.

Ved at udsætte celler til aerosol direkte ved kilden af emission, opstår undersøgelse af virkningerne af alle gasser, semi-flygtige forbindelser og partikler involveret i blandingen. Når blandingen er indsamlet på et filter, gasser og flygtige forbindelser er ikke fanget og hele blandingen kan ikke undersøges. Derudover kan rekonstituering af partikler i en pulver eller en flydende suspension føre til sammenlægning eller partikel-væske interaktioner, såsom opløsning, i flydende suspension. 25 , 26 når aerosol partikler føjes til væsken, der er en højere potentiale for byområdet,25,27 dannelse af et protein corona,28 eller interaktion med forbindelser i den væske, som kan påvirke deposition og påvirke den biologiske respons. 29 , 30

Eksponering på ALI er baseret på tre vigtigste aerosol profiler, cloud bilæggelse, parallelt flow og vinkelrette flow. Cloud afregning, anvendes af Air-Liquid Interface celle eksponering (ALICE),4 er et batchsystem hvor partikler deponere gennem gravitationel og diffusional afregning som aerosol behandles som én enhed. Parallelt flow, bruges til elektrostatiske Aerosol in vitro- eksponering System (TAGSKÆGGET)5 og multikultur eksponering kammer (MEC) II,6 giver mulighed for deposition gennem tilsætning af Brownske bevægelser gennem flow profil. Vinkelret på strømmen, anvendes af en microsprayer,7 Nano Aerosol kammer for In vitro-toksicitet (NACIVT),11 og kommercielle ALI systemer8,9,10,12, tilføjer impaction af partikler i regionen deposition. Mange af disse eksponering systemer er store og pladskrævende, kræver overskydende systemer for aerosol forudgående konditionering, pumper for strøm, eller endda varme kamre til inkubation af celler. Denne store størrelse falder portabilitet af systemet. I stedet for prøveudtagning direkte ved kilden af emission har disse systemer ofte prøver bringes til en lab eller model aerosoler genereret for analyse. Kompleksiteten af den udsendte aerosol kan gå tabt i oversættelsen fra feltet til laboratoriet. PIVEC er mindre end de nuværende systemer, med en ekstern areal af ca. 460 cm2 og vejer bare 60 gram, med varme og fugtighed kontrol indarbejdet i systemet giver mulighed for en yderst transportabel enhed. Nedsat størrelse og vægt Lad systemet være slidte eller taget til kilden til eksponering, tillader direkte prøveudtagning.

Den store størrelse af nuværende eksponering systemer reducerer også evnen til at udføre prøveudtagning for at undersøge rumlige forløb i koncentrationer. Denne beslutning er nøglen, når bestemmelse af toksikologiske effekter af mange potentielle miljømæssige og erhvervsbetingede risici såsom køreveje udstødning partikler sagen eller arbejdspladsen aktiviteter hvor aerosolization opstår. Straks efter emission, der bliver en rumlig varians i partikel koncentration. Dette vokser med tiden som partikler spredes i hele atmosfæren og disse effekter kan ændre baseret på de omgivende betingelser, såsom temperatur, tryk, vind og sol. Partikler kan begynder at alder og oxidere samt en gang udsendte31,32 og spredning satser påvirkes af topografi; højere koncentrationer vil blive fundet i kløfter og tunneller, hvor dispersion effekter er aftaget, og lavere koncentrationer kan findes hvor der er et stort område for spredning. 33 disse ændringer i dispersion satser kan have betydelige virkninger på menneskers sundhed og kan ses, når man sammenligner antallet af astmatiske voksne bor i urban versus i landdistrikterne indstillinger. 34 mens mange eksponering systemer giver flere prøver på én gang, flere systemer er nødvendigt med en overflod af store udstyr til at udføre rumlige opløsning.

Ved at bringe lab til feltet, kan tidspunktet for analyse være nedsat ved hjælp af hele cellen som en sensor. Følgende kendte biologiske mekanismer og slutpunkter kan støtte ved fastsættelsen af aerosol sammensætning og størrelse. På grund af langsom clearance metoder, herunder mucociliary clearance, fagocytose og omplantning, interagerer disse partikler ofte med celler i ca dage til uger3 generere oxidativ stress, betændelse og endda celledød. Disse biologiske slutpunkter kan være udgangspunktet for negative resultat veje for Kardiovaskulær sygdom eller kronisk obstruktiv lungesygdom. Derudover udførte Wiemenn et al. et array af in vitro- assays skal sammenlignes med litteratur værdier for kort sigt i vivo toksicitet ved indånding. 35 In vivo svar var forudsagt med to af fire positive resultater fra afprøvning cytotoksicitet via laktat dehydrogenase frigivelse, oxidativ stress fra glutathion reduktion og hydrogenperoxid dannelsen og frigivelse og betændelse potentielle fra tumor nekrose faktor alfa genet. Ud af ti nanosized metaloxider testet, seks testet som aktiv (titanium oxid, zinkoxid og fire forskellige cerium oxid) ved hjælp af engagementer in vitro med bekræftelse på vivo. 

For at studere virkningerne af aerosoler i erhvervsmæssig omgivelser, udviklet vores lab PIVEC for engagementer i feltet. Derudover, PIVEC kan bæres for personlige prøveudtagning overvåge og undersøge indåndingseksponering som 37 mm filter kassette36 eller flere systemer kan bruges til at opnå rumlige opløsning inden for et givet område. I denne protokol gennemgås karakterisering og brug af PIVEC. Efter eksponering observeres de biologiske virkninger gennem cytotoksicitet assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Operatørerne skal bære personlige værnemidler (f.eks. laboratoriekittel, handsker, beskyttelsesbriller) når udførelse af trin 1, 2, 3, 5 og 6.

1. forberedelse af materialer

  1. Forberede materiale til system forsamling og eksponering for repeterbarhed.
    1. Sørg for at bruge nye eller 70% ethanol renset ¼" indre diameter ledende slanger og ¼" ydre diameter stik for samlingen system.
    2. Butik test materialer herunder filtre, PIVEC komponenter, pincet og partikel pulver i en godt kontrolleret miljø med hensyn til temperatur og fugtighed i mindst 24 timer før eksperimentet.
      Bemærk: Temperaturen skal være nær stuetemperatur, ca 20 ° C, med relativ luftfugtighed mindre end 35%. Dette er meget vigtigt at opnå repeterbarhed mellem eksperimenter.
    3. Forberede partikel tællere med isopropanol til at rense dele og gøre det muligt for systemet warm-up efter fabrikantens anbefalinger, herunder scanning mobilitet partikel sizer (SMPS) og optisk partikel sizer (OPS) for måling.

2. generation af tørre Aerosol

Bemærk: Operatører bør udføre aerosol generation i et stinkskab.

  1. Samle et system til at generere tør aerosoler
    Bemærk: Suspension af partikler i gas eller væske skal være passende for den modellerede ansøgning og celle kultur. Følgende metode kan udføres ved hjælp af en væskebaseret aerosol. Design af tørre aerosol-systemet er fra Tiwari mfl. 37 en skematisk af tørre spredning system er vist i figur 1.
    1. Tilslut kugleventilen til hver ende af de 4" 1/8 størrelse gevind rør, dette vil tjene som partikel hopper. Tilsluttes en ventil 2" 1/8 størrelse rør.
    2. Vejer kobber nanopartikler, i denne undersøgelse massekoncentration for hver partikelstørrelse blev holdt konstant mens bestemmelse af deposition effektiviteten. Ca bruge 7,5 mg af 40 nm kobber nanopartikler, 7 mg 100 nm kobber nanopartikler og 13 mg af 800 nm kobber nanopartikler pr. eksponering. Placere kobber nanopartikler i partikel hopper gennem den åbne ende.
      Bemærk: Mængden af kobber nanopartikler vejes vil tjene som massen baseret administreret koncentration.
    3. Placer en 3" stykke af ½" udvendig diameter (OD) slanger omkring 2" rør og sted en HEPA filter inde i denne korte slangen sådan, at flowretning gennem kugleventilen.
    4. Tilsluttes andre kugleventil, ved hjælp af threading vakuum generator. Tilslut vakuum generator til luft tank ved at placere en OD slange 5/16" i push-til-lås-forbindelse. Brug ¼" OD slanger tilsluttes stikkontakt vakuum generator til den eksperimentelle set-up ved at placere slangen over outlet vakuum generator.
  2. Anvendelse af tør aerosol system til at generere tør aerosol
    1. Åbne luft tank ved at dreje hovedventilen og tillade luftstrøm til systemet. Åbne ventilen på flow regulator på air tank og indstillet således, at strømmen gennem systemet svarer til de ønskede indstillinger på vakuumpumpe.
    2. Åbn kugleventil tættest på HEPA filter og Åbn kugleventil tættest på vakuum generator. Holde disse åbne for ca. 3 s til tillader partikler at blive trukket ind i luftstrømmen.
    3. Luk kugleventil tættest på vakuum generator derefter lukke kugleventil tættest på HEPA filter. Tillad luft fra tank til at flyde til varigheden af forsøget som nødvendigt.
    4. Luk main og regulator ventiler på luft tank at stoppe strømmen. Ren Kugleventiler og vakuum generator med 70% ethanol. Autoklave metalrør til sterilisation.

3. deposition effektivitet måling ved hjælp af PIVEC

Bemærk: Operatører bør udføre aerosol engagementer i et stinkskab.

  1. Måle aflejring ved at indsamle kobber nanopartikel aerosol genereret i trin 2.2 på en pre vejes filter. Bruge den deponerede dosis, målt ved hjælp af indsamlet massen på filteret, og den administrerede dosis, målt ved hjælp af mængden af vejede kobber partikler, for at bestemme deposition effektivitet.
    1. Holde 1,00 µm pore glas fiber filtre betingelser lav luftfugtighed, beskrevet i punkt 1.1.2 i mindst 24 timer forud for pre-eksponering målinger. Vejer en ubrugt filter tre gange og optage filter vægte. Sted den ubrugte filter i en cellekultur indsætte.
    2. Vælge passende celle kultur Indsæt adapter (6 nå eller 24 godt) til PIVEC til at støtte den celle kultur indsætte med filteret. Sted i cellekultur indsætte adapter stykke øverst på bunden af PIVEC, indstilling på plads, således at bunden af adapteren stykke er bredere end toppen.
    3. Brug pincet til at placere filteret indlæses cellekultur indsætte inden for adapter stykke. Placer den øverste stykke oven på adapter stykke, slår sig ned i sted, således at bunden af den øverste stykke er bredere end toppen. Wrap PIVEC med et enkelt lag gaffatape.
    4. Tilslut 37 mm kassette stykker på toppen og bunden af PIVEC ved at trykke på plads. Placere ¼" pigtråd adaptere i kassette luftindtag og -udtag.
    5. Wrap den resistive varmelegeme omkring PIVEC, således at ledningerne er i bunden. Tape til at sikre.
    6. Wrap PIVEC med ~ 8 runder af aluminiumsfolie for isolering. Fastgør med tape.
    7. Tilslut 2" lang stykke af 1/2" ydre diameter slange til adapter på toppen af PIVEC. Fjerne porøse slangen fra sterilt vand og sted inden for slanger på toppen af PIVEC.
    8. Sted PIVEC i klemme på ringen stå og sikre. Komplet set-up med vakuumpumpe, partikel tællere og aerosol set-up.
      Bemærk: Det nummer-baserede deponerede dosis kan bestemmes, kun hvis partikel tællere placeret før PIVEC og efter PIVEC på separate kører.
    9. Udsætte filtre ved hjælp af trin 2.2 af protokollen og ønskede eksponering tid og flow priser, i denne undersøgelse en eksponeringstid på 10 min. på 0,5 LPM blev brugt. Fjern PIVEC fra set-up. Tag celle kultur Indsæt og Placer filteret udsatte i filterholderen betingelser lav fugtighed i mindst 24 timer før målinger.
    10. Ren PIVEC med 70% ethanol. Sterilisere med ultraviolet lys i mindst 30 min før den næste eksperiment.
    11. Vejer filteret udsat tre gange og optage filter vægte. Placer filteret eksponeret i en mærket filterholder til opbevaring.

4. beregning af deponerede dosis og Deposition effektivitet

Bemærk: Viden om depositionen er vigtigt for aerosol administration og fortolkning af cellulære reaktion.

  1. Beregne deposition fra mass-baserede målinger
    1. Beregne den deponerede masse på filtre som forskellen mellem pre-eksponering gennemsnitsvægt og efter eksponering gennemsnitsvægten. Denne værdi er den masse-baseret deponerede dosis for eksperimentet.
    2. Brug administreret massen, madmin, og masse-baseret deponeret dosis bestemmes i 4.1.1, mforhindring af datakørsel, til at beregne massen-baserede deposition effektivitet, ηm, for eksperimentet.
      Equation
    3. Gennemsnitlige værdier fra 4.1.1 og 4.1.2 for mindst 3 forsøg for at bestemme deposition og deposition effektivitet for PIVEC for partikelstørrelse.
  2. Beregne deposition fra nummer-baserede målinger
    1. Sikre, at målinger med partikel tællere er udført med tællere, efter PIVEC og til at bestemme partikel koncentrationen før PIVEC. Integrere partikel koncentration over tid for tælleren partikel og derefter integrere over partikel diameter til at bestemme det samlede antal partikler målt.
    2. Beregne det deponerede partikel tal som forskellen mellem partiklerne administreres og partikler målt post-PIVEC. Denne værdi er det antal-baserede deponerede dosis for eksperimentet.
    3. Brug administreret partikler, nadmin, antal-baserede deponeret dosis, ndep, volumetriske strømningshastighed, V og tid, t, til at beregne antallet-baserede deposition effektivitet, ηn, for eksperimentet.
      Equation
    4. Gennemsnitlige værdier fra 4.2.2 og 4.2.3 for mindst 3 forsøg for at bestemme deposition og deposition effektivitet for PIVEC for partikelstørrelse.

5. aerosol eksponering af celler

Bemærk: For cellen kultur på grænsefladen air-liquid læseren henvises til tom mfl. 38 operatører bør udføre celle kultur Indsæt indlæsning (trin 5.1.2-5.1.4) inden for en fryser biosikkerhed. Operatørerne bør udføre aerosol engagementer i et stinkskab.

  1. Kultur celler på Air-Liquid Interface
    1. Løft A549 celler fra kultur kolben ved at tilføje trypsin-EDTA, 3 mL til en T75 kolbe eller 1 mL til en T25 kolbe og Inkuber i 5 min. ved 37 ° C. Tilføje 7 mL af komplette medier til en T75 kolbe eller 4 mL af komplette medier til T25 kolbe til kolbe og skyl kolbens væg med cellesuspension til at maksimere den gendannede celle nummer. Overføre cellesuspension til en steril 15 mL konisk slange derefter centrifugeres celler ved 800 x g i 3 min.
    2. Fjerne den supernatanten med trypsin-EDTA og celle resuspenderes i 10 mL af komplette medier. Fjerne 10 µL af cellesuspension og tilføje til hemocytometer. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer til at bestemme koncentrationen og den samlede antal celler.
    3. Sted 0,5 mL af komplette medier til hver brønd indenfor en 24 godt plade. Placere ubrugte celle kultur skær i brønde. Frø cellekultur skær på den apikale side på en celle tæthed nær 1 x 105 celler/cm2 for celletyper, der vokser med en hastighed nær fordobling pr. dag. Til frø af A549 celler inden for en 24 godt Indsæt Indsæt frø celler med en tæthed på 1 x 105 celler/cm2 ved at tilføje 35.000 celler til cellekultur.
      Bemærk: Celler med en langsommere vækst kan være seedet på en øget celle tæthed.
    4. Tilføje komplet media til den apikale side af celle kultur insert for at nå det endelige rumfang (for 24 godt plade endelige rumfang er 0,25 mL).
    5. Kultur i 7 dage i undersøiske betingelser, udskiftning media hver 1-2 dage. Efter 7 dage, skal du fjerne den apikale medier og kultur for mindst 1 dag i ALI betingelser, udskiftning kun basolateral medierne.
  2. Samle PIVEC
    1. Tillad celler til Reagensglasset grænsefladen luft-væske i mindst 24 timer før eksponering.
    2. Vælge passende celle kultur Indsæt adapter til PIVEC til at støtte den celle kultur indsætte med filteret. Sted cellekultur indsætte adapter stykke oven på PIVEC base, indstilling på plads, således at bunden af adapteren stykke er bredere end toppen. Der tilsættes 4 mL celle kultur medier hul i bunden af PIVEC.
    3. Brug pincet til at placere cellekultur indsætte inden for adapter stykke placeret i trin 5.2.3. Placer øverste stykke oven på adapter stykke, slår sig ned i sted, således at bunden af den øverste stykke er bredere end toppen. Omhyggeligt, wrap PIVEC med et enkelt lag gaffatape.
    4. Tilslut 37 mm kassette stykker på toppen og bunden af PIVEC, ved at trykke på plads. Placere ¼" pigtråd adaptere i kassette luftindtag og -udtag.
    5. Wrap resistive varmelegeme omkring PIVEC, således at ledningerne er i bunden. Tape til at sikre.
    6. Wrap PIVEC med ~ 8 runder af aluminiumsfolie for isolering. Fastgør med tape.
    7. Tilslut kort stykke af 1/2" ydre diameter slange til adapter på toppen PIVEC. Fjerne porøse slangen fra sterilt vand og sted inden for slanger på toppen af PIVEC.
    8. Sted PIVEC i klemme på ringen stå og sikre. Komplet set-up med vakuumpumpen og aerosol set-up.
  3. Udsætte celler på ALI ved hjælp af PIVEC
    1. Bruge deposition effektivitet bestemt i trin 2 til at beregne massen af partikler at være aerosolmaterialer. Vejer passende masse og tilføje til aerosol systemet oprettet følgende trin 2 inden for stinkskab.
    2. Expose celler ved at følge trin 2.2, i denne undersøgelse af biologiske slutpunkter celler blev udsat for ca. 3,5 mg kobber nanopartikler med en gennemstrømningshastighed på 0,5 LPM og en eksponeringsvarighed 10 min. kontrol undersøgelser udført anvendes befugtet luft til at bestemme indflydelse af luft alene. Fjern PIVEC fra set-up. Tag celle kultur Indsæt, anbringes i det sterile godt plade og vende tilbage til CO2 inkubator (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).
    3. Opsug medier fra PIVEC. Hvis udføre yderligere forsøg, bufferet skyl bunden af PIVEC med phosphat løsning og derefter Gentag trin 5.1 og 5.2.
    4. Ren PIVEC med 70% ethanol når du er færdig. Sterilisere med ultraviolet lys i mindst 30 min før den næste eksperiment.
  4. Biologisk styrkebestemmelse procedurer
    Bemærk: Assays udført i denne undersøgelse var oxidativt stress generation gennem DCFH-DA analysen og cytotoksicitet gennem laktat dehydrogenase (LDH) release.
    1. Opløse 24.4 mg af DCFH-DA i 50 mL methanol at gøre 1 mM DCFH-DA løsning. Denne løsning kan opbevares ved-20 ° C i op til 4 måneder. Fortyndes 1 mM DCFH-DA løsning ved at blande 0,1 mL af 1 mM DCFH-DA løsning med 9,9 mL HBSS at gøre 10 mL af 10 µM DCFH-DA.
    2. Fjerne celle kultur medier og vask celle kultur Indsæt med ca. 1 mL PBS. Tilsæt 0,5 mL af 10 µM DCFH-DA løsning til hver brønd, udskiftning af skær når du er færdig. Dække plade med alufolie forhindre photoactivation af farvestoffet og vende tilbage til 37° C inkubator for 1 h.
    3. Fjerne celler fra rugemaskinen og Opsug DCFH-DA brugsopløsning fra brøndene. Der tilsættes 0,5 mL HBSS til brønde og erstatte celle kultur skær.
    4. Indlæse den godt plade til plade læser og foranstaltning baseline fluorescens ved hjælp af excitation/emission bølgelængder af 485/530 nm. Fjerne pladen fra plade læser og belastning, Indsæt i PIVEC for eksponering.
    5. Udsætte celler for ønskede eksponeringsvarighed. Fjern Indsæt fra PIVEC og vende tilbage til godt plade. Fjerne 50 µL af basolateral væske fra godt plade og sted i hvid 96 godt plade. Måle fluorescens af DCF ved hjælp af excitation/emission bølgelængder af 485/530 nm hvert 30 min efter eksponering for 2 h.
    6. Lad basolateral væske reagensglasset stuetemperatur for 20-30 min. tilsættes 50 µL af LDH assay løsning, blandet følgende producent protokol, til basolateral væske fra godt plade og lad reagere i 10 min. Tilføj 25 µL stopopløsning til godt. Læs fluorescens af resorufin produkt ved hjælp af excitation/emission bølgelængder af 560/590 nm.
    7. Fjerne yderligere basolateral væske og Gentag trin 5.4.6 på 4 h og 24 timer efter eksponering.

6 statistiske metoder

  1. Analyse af biologiske Assay Data
    1. Betænkning ROS produktion som fluorescens intensitet stigning af behandlede celler i forhold til baseline målinger. Betænkningen LDH aktivitet som fluorescens intensitet stigning af behandlede celler i forhold til ubehandlede celler.
    2. Udfør enkelt faktor ANOVA at bestemme statistiske forskelle mellem datasættene. Eventuelt udføre student t-test til en værdi af betydning på 0,05. Rapportdata som gennemsnit ± standardafvigelse for mindst tre eksponering målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Erhvervsmæssig in vitro- toksikologi indebærer opretholdelse cellulære levedygtighed mens de udfører aerosol eksponering. PIVEC systemet er vist i figur 2, herunder temperaturen og fugtighed kontrol og den slidte PIVEC. Temperaturen blev opretholdt ved hjælp af en batteridrevet resistive varmelegeme og aerosol fugtet, ved hjælp af øget naturlige befugtning gennem en porøs, fugtet rør. I en kontrolleret aerosol indstilling inde i et laboratorium, kan PIVEC være set-up for eksponering vist i figur 1. Karakterisering af systemet giver mulighed for bestemmelse af den deponerede dosis på de celler, som derefter kan være korreleret til den cellulære reaktion.

Deposition effektivitet er afhængig af størrelsen af partikler føjes til systemet, da deposition styrker omfatter impaction, bundfældning og diffusion. Derudover er deposition afhængig af strømningshastigheden, eksponeringstid og Karakteristik af eksponering system. Med denne information, kan deposition forudsiges. Deposition effektiviteten af PIVEC er fastslået gennem to metoder, gravimetrisk analyse og partikel nummer optælling. Ligninger 1 og 2 blev brugt til at bestemme deposition effektivitetsfordele i tabel 1 bruger filteret baseret, scanning mobilitet partikel sizer (SMPS) og optisk partikel sizer (OPS) målinger, figur 3. Øget deposition er observeret samlet set for 24 godt design end 6 godt design og lidt falder for 100 nm i forhold til 40 nm og 800 nm kobber partikler. Deposition i 24 brøndene er meget ensartet over skæret, deposition i de 6 godt design mangler dog ensartethed som de fleste af partikler depositum nær centrum af indsatsen. Efter eksponering analyse kan fremskyndes ved at bestemme dosis forholdet mellem 37 mm filter og celle kultur Indsæt, faldende nødvendighed at bestemme dosis efter cellulære eksponering. Sammenligning af depositionen inden for 37 mm filter kassette og PIVEC viser en stærk korrelation til alle størrelser og brønde med en Pearson korrelation af ovenfor 0,7, dog kun for 800 nm er korrelationen signifikant med en p < 0,05, se figur 4. I forhold til lignende systemer i hele litteratur, er11,12 deposition effektiviteten af PIVEC over vifte af partikelstørrelser testet sammenlignelige eller øget over rapporterede værdier, observeret i figur 5. Deposition effektivitet inden for PIVEC kan forbedres gennem minimere tab til systemet ved hjælp af elektrostatisk dissipative eller ledende plast eller lignende materialer til at designe PIVEC.

Hvis filtre ikke er godt tørret i en luftfugtighed-kontrolleret miljø før eksponering, overskydende vand øger den oprindelige masse og kan producere ikke-fysiske, negative deponerede doser. Varierende strømningshastigheder kan også fremme inkonsekvent deponerede doser inden for systemet. For at undgå disse problemer, give mindst én dag før og efter udsættelse for filtre til tørre i en luftfugtighed-kontrolleret miljø.

Cellulære svar vil blive påvirket af den deponerede dosis og kan påvirkes af eksponeringsvarighed, hvis cellerne ikke er ordentligt vedligeholdt. A549 celler, en alveolær epitelial karcinom cellelinie, blev udsat for 10 min til varierende størrelser af kobber nanopartikler med en væskehastighed på 0,5 LPM. Alternative vinkelret flow eksponering systemer brug mellem 0,005 LPM og 1,5 LPM for en vedvarende eksponeringstid, der henviser til, at denne metode bruger et moderat strømningshastighed under en hurtig eksponering. Ved hjælp af masse-baseret deposition effektivitet målt og administrerede dosis, 1,58 ± 0,04 mg/cm2 40 nm kobber, 0,30 ± 0,00 mg/cm2 for 100 nm kobber partikler, og 0.32 ± 0,01 mg/cm2 for 800 nm kobber partikler blev deponeret på cellerne. Cytotoksicitet og oxidativ stress blev observeret inden for de første 24 timer efter eksponering. Cytotoksicitet blev målt ved hjælp af frigivelsen af laktat dehydrogenase (LDH) fra beskadigede celler straks, 4 timer og 24 timer efter eksponering. Der var ingen signifikant toksicitet fra kobber nanopartikler nedenfor 1.62 mg/cm2 senest 4 timer efter eksponering, fig. 6b. Fireogtyve timer efter eksponering der var en statistisk signifikant fald i cellernes levedygtighed på mindre end 20% levedygtighed for celler udsat for kobber nanopartikler. Den intracellulære oxidativt stress blev undersøgt ved hjælp af DCFH-DA analysen gennem oxidation af DCFH af reaktive ilt arter inden for de første to timer efter eksponering, figur 6a. Betydelige niveauer af oxidativt stress blev målt til 30 minutter efter eksponering for celler udsat for kobber nanopartikler i alle størrelser. Niveauet af oxidativt stress fortsatte med at stige i samme takt for alle størrelser testet inden for de to timer observeret.

Succes for engagementerne kan bestemmes gennem repeterbarhed af cellulære respons. To acceptkriterier foreslået for cytotoksicitet assays omfatter: 1) den % total LDH lækage for den positive kontrol bør være større end 50%, og 2) den positive og prøve Repliker koefficient for variationer bør være inden for 50%. 39 hvis disse kriterier ikke er opfyldt, denne suggest forskelle mellem eksperimenter, som ændrede deposition beløb eller dårlig fugtighed og temperatur kontrol. Desuden kan observere cytotoksicitet målinger føre til forståelse af de eksperimentelle kontrol og støtte til at bestemme fejlen. Når flowet er for høj, kan cellerne dø fra høje mængder af shear stress. Ved at sænke strømningshastigheden, kan stress på celler fra strømmen nedskrives.

Figure 1
Figur 1. Skematisk af tørre spredning System og eksperimenterende Set-up. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. PIVEC Design. A) fuld Design afbilledet med 30 cm høje Box til sammenligning. B) PIVEC med temperatur og fugtighed kontrol afbilledet med 30 cm høje Box til sammenligning. C) slidte PIVEC. D) PIVEC øverste stykke. E) celle kultur Adapter til 24 godt (til venstre) og 6 nå (til højre). F) nederste stykke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Antal baseret Deposition effektivitet (%) Masse baseret Deposition effektivitet (%)
6 godt 40 nm 17.83 ± 32.13 5,85 ± 0,85
100 nm 0,47 ± 4,06 5.11 ± 0,94
800 nm 3.70 ± 35,00 6.39 ± 1,01
24 godt 40 nm 1.43 ± 2.43 12.61 ± 1.34
100 nm 1,37 ± 19,45 2,95 ± 0,75
800 nm 6.98 ± 3,93 15,95 ± 0,53

Tabel 1. PIVEC Deposition effektivitet.

Figure 3
Figur 3. Partikel nummer koncentration af kobber nanopartikel aerosoler. A) SMPS måling. B) OPS måling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Forholdet mellem deposition på celle Indsæt og SKC 37 mm filter. Fejl ± 0,002 mg. A) 40 nm kobber partikler. B) 100 nm kobber partikler. C) 800 nm kobber partikler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Deposition effektiviteten af PIVEC i forhold til vinkelrette Flow eksponering systemer i litteratur. Litteratur værdier fra vinkelrette Flow eksponering systemer er afbildet i Solid markører og PIVEC værdier er i tomme markører. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Cellulære reaktion på kobber nanopartikler efter eksponering (PE). For alle målinger, n = 3 og p < 0,05. A) oxidativ Stress bestemmes ved hjælp af DCFH-DA Assay. B) cytotoksicitet bestemmes ved hjælp af LDH Assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Filterkassetter giver en enkel og billig metode til indsamling af aerosoler i indåndingszonen; dog aerosol prøver udvundet fra filtre ikke repræsenterer den hele aerosol (dvs. gasser, flygtige stoffer og partikler) og således begrænse vurderingen af relaterede biologiske virkninger. Ved hjælp af det oprindelige design af 37 mm filter kassette, er PIVEC designet til at opretholde portabiliteten skulle og efterligne i vivo aflejring af partikler fra indånding. PIVEC er væsentligt mindre end nuværende ALI eksponering systemer, omtrent på størrelse med en væv boks med temperatur og fugtighed kontrol inkluderet. Størrelsen er svarende til personlige cascade slaglegemer mens tilbyder data på cellulære reaktion på aerosol hertil. Mens PIVEC indeholder plads til én prøve i forhold til andre aktuelle eksponering systemer, tillader den lille størrelse flere systemer til at blive brugt på en gang, derfor øge stikprøvestørrelse og giver mulighed for fysisk distribution skal overvåges.

Der er flere kritiske trin i protokollen. For at bestemme deposition effektivitet, er det afgørende for korrekt betingelse filtre, som beskrevet i trin 1. Desuden er det vigtigt at ordentligt vejer den kobber nanopartikler før eksponering og filter post eksponering til at bestemme massen-baserede deposition effektivitet. Antal deposition effektivitet skal bestemmes ved hjælp af forskellen i deposition første aerosol koncentration og endelige koncentration bestemmes ved hjælp af partikel tællere. Hvis deposition effektiviteten ikke afgøres korrekt, er det vanskeligt at bestemme de biologiske respons forskelle mellem aerosol typer. Ændringer af depositionen omfatter at ændre deposition. Deposition kan øges ved at ændre flow sats og eksponering varigheden. Dette kan også påvirke cellernes levedygtighed med potentiale til at tørre ud af cellerne. Konditionering af aerosoler er ofte udføres for at kompensere for fysiologiske attributter såsom kropstemperatur og befugtning i luftvejene. Øget luftfugtighed, over 50%, efterligner inhalerede luft og nedsætter celledød på grund af køretøjets eksponering. 43 når temperaturen og luftfugtigheden ikke styres godt, den cellulære reaktion kan påvirkes. Ved at reducere strømningshastigheden, vil yderligere partikler i alle størrelser deponere, øge deposition. Udsættelsens varighed er proportional med deposition, tillader flere partikler til at deponere over en udvidet forsøgsperioden. Konditionering af aerosol er vigtigt, når stigende eksponeringsvarighed, således at cellerne ikke udtørre som kan påvirke biologiske svar.

PIVEC bruger vinkelrette flow til at deponere partikler via impaction, bundfældning og diffusion på de celler, som har potentiale til at tørre ud celler gennem strømmen og tilføjet stress på cellerne. Deposition effektivitet er afhængig af størrelsen af partiklen som følge af deposition kræfter. Mange af de nuværende eksponering systemer med vinkelrette flow har en aflejring effektivitet under 10% og meget tættere på 1%. PIVEC har en aflejring effektivitet bestemmes gravimetrisk analyse på 3% til 16% for en 24 godt celle kultur Indsæt. Partikel nummer-baserede deposition effektivitet er ca 1% til 7% for den samme Indsæt. Når du bruger en 6 godt cellekultur indsætter, disse tal falde, undtagen den mindste partikelstørrelse, på grund af strømliningen af aerosol som flere partikler er begrænset i celle kultur Indsæt uden plads til flow til at udvikle. 6 godt celle kultur indsætter tillade aerosol-streams til omgå deposition. Andre vinkelrette flow systemer har været kendetegnet på en masse grundlag ved hjælp af 60 nm fluorescein partikler40, 80 nm og 180 nm kobber partikler16og 60 nm adipinsyre syre partikler41. De resulterende deposition effektivitetsgevinster er generelt mellem 0,05% og 11%. På grundlag af tal, er disse systemer blevet karakteriseret ved hjælp af polystyren partikler12,15, carbon nanopartikler12og silica partikler42, giver effektivitet mellem 0,2% og 11%. PIVEC giver, lignende eller øget, deposition i forhold til rådighed cellulære eksponering enheder.

Celle engagementer blev udført ved hjælp af kobber nanopartikler af 40 nm, 100 nm, og 800 nm. Cellernes levedygtighed blev defineret ved hjælp af LDH assay med ingen signifikant fald i rentabilitet inden for fire timer efter eksponering. LDH analysen blev brugt med en erhvervsmæssig eksponering system til 74 ng/cm2 efter 2 timer og 148 ng/cm2 efter 4 timers 9,2 nm Kobber oxid partikler44 og 1 µg/cm2 deponeres efter en sekventiel udsættelse 4 timers inkubation i 2 timer, så en anden eksponering for 4 timer 25 nm Kobber oxid partikler40, begge måling betydelige fald i cellernes levedygtighed. Cytotoksicitet blev observeret i et andet system for 1,6-7,6 µg/cm2 180 nm partikler kobber nanopartikler16 målt ved trypan blå farvestof udstødelse. Eksponeringer på 15 minutter til 40-80 nm kobber metaloxid faldt levedygtighed, målt 24 timer post eksponering. Lavere toksicitet observeret ved hjælp af PIVEC var sandsynligvis på grund af den kortere eksponeringstid på 10 minutter og kortere indlæg eksponering måling gange. Efter fire timer efter eksponering faldt rentabiliteten af celler udsat i PIVEC. Celler udsat for fugtige luft kontrol observeret nogen væsentlige cytotoksicitet, efter aftale med andre undersøgelser 9,40,44,45,46. Den oxidative stress blev bestemt ved hjælp af DCFH-DA assay. Produktion af reaktive ilt arter, som f.eks hydrogenperoxid eller ilt radikaler, genereret en mængde af stress, der kan føre til vækst anholdelse eller celle død. Efter celle engagementer var der en minimal stigning i oxidativ stress for celler holdes i inkubator som kontrol og celler udsat for fugtige luft. Forhøjede oxidativt stress opstod for alle partikelstørrelser, øge inden for 30 minutter efter eksponering. I en undersøgelse, 9,2 nm kobberoxid partikler44 og 25 nm kobberoxid partikler induceret40 også oxidativt stress målt via carboxy-DCFH-DA assay. Øget eksponeringstid fra 2 timer til 4 timer forhøjede oxidativ stress for 9,2 nm kobberoxid partikler44. Efter fire timers eksponering, 9,2 nm Kobber oxid partikler produceret en lignende oxidative svar som den sekventielle eksponering af 25 nm Kobber oxid partikler40, tyder på, at eksponering varighed har større indflydelse på oxidativ stressrespons end partikelstørrelse. Celler udsat inden for PIVEC produceret forhøjede oxidativt stress i forhold til denne undersøgelse, men partiklerne udsat i det alternative system er kobberoxid og vil opløse mindre hurtigt end kobber udsat inden for PIVEC. Undersøgelser udført på opløsning af kobber baseret på sammensætning og størrelse af partikler er enige om, at større partikler og de metaloxider frigive ioner langsommere end metal partikler eller deres nanopartikel modparter16,47 , 48 , 49 som den fugtige luft kontrol ikke producere betydelige mængder af oxidative stress i forhold til kontrolelementet inkubator, påvirkning af kobber partikler til at fremkalde oxidativt stress er konsistente inden for PIVEC til lignende in vitro- eksponering systemer. De biologiske svar observeret ved hjælp af PIVEC tyder på, at PIVEC er et passende system til cellulære eksponering.

Mens karakterisering og cellular undersøgelser af PIVEC er enig godt med litteratur, har9,16,40,44,46 enheden begrænsninger. Den lille design reducerer antallet af prøver, der kan blive eksponeret samtidig inden for en enkelt enhed i forhold til andre eksponering systemer. Andre systemer giver mulighed for mindst tre cellulære engagementer med den samme aerosol9,12 lette gentagne målinger. Selv om PIVEC tillader kun én Indsæt pr. system, den lille størrelse giver mulighed for flere systemer til at nemt bruges, bidrage til at mildne problemet. Mens andre personlige overvågningssystemer ikke brug celler, skal PIVEC holdes i nærheden af lodret at reducere breder celle Kulturmedier nødvendigt at bevare cellulære levedygtighed. Selv om PIVEC ikke har endnu blevet optimeret til specifikke partikel intervaller (f.eks. PM10, PM2.5, PM0,1), har PIVEC været karakteriseret for en række partikelstørrelser. I lighed med andre vinkelrette flow systemer, PIVEC viser en nedsat evne til at deponere partikler nær 100 nm i diameter, mens 40 nm og 800 nm partikler deponeret med samme effektivitet.

Analyse af celler efter eksponering kan fremskyndes ved at udføre en parallel samling af aerosoler inden for PIVEC og en SKC 37 mm filter kassette. En høj korrelation af gravimetrisk baseret deposition tillader til vurdering af partikel massen indsamlet på celler fra data indsamlet ved hjælp af 37 mm filtre. Sammenligning af Indsæt til filter kassette reducerer behovet for at indsamle yderligere prøver og yderligere målinger til at bestemme dosis. Igangværende arbejde omfatter integration af en real-time overvågningssystem for cytotoksicitet, oxidativ stress eller andre biologiske slutpunkter. Den lille størrelse af PIVEC tillader det kan bruges i en række forskellige indstillinger, såsom på kroppen som en personlig skærm på en drone over en kemisk fabrik, eller udenfor i miljøet for rumlige opløsning. Denne metode har vist brug af PIVEC til indsamling af aerosol partikler på cellekulturer vokset på ALI. Ved konditionering aerosol 37 ± 1 ° C og > 80% relativ luftfugtighed, kan cellulære levedygtighed opretholdes under akut engagementer. Denne metode er velegnet til både flydende droplet og solid partikel-baserede aerosoler og har vist sig at deponere partikler mellem 40 nm og 800 nm i celle kultur skær. Alsidigheden i PIVEC tillader denne metode skal anvendes i flere indstillinger med en bred vifte af biologiske slutpunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tilknytning af forfatterne er som vist på forsiden. Forfatterne er støttet økonomisk af Virginia Commonwealth University, hvor arbejdet blev afsluttet i Richmond, VA Forfatterne har eneansvar for at skrive og indholdet af dette dokument. Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Boris Solomonov og Virginia Commonwealth Innovation Machine Shop for hjælp med rapid prototyping enheden. Forfatterne vil også gerne takke Cristian Romero-Fuentes af gruppen Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov og Virginia Commonwealth nanomaterialer Core karakterisering faciliteten for deres hjælp med partikel karakterisering. Dette arbejde blev støttet af startup midler til Dr. Lewinski fra College of Engineering på Virginia Commonwealth University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. , Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26 (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).

Tags

Miljøvidenskab spørgsmålet 144 eksponering system indånding nanopartikel toksikologi Deposition effektivitet personlige overvågning
En ny Transportabel <em>In Vitro</em> eksponering kassette for Aerosol prøveudtagning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Secondo, L. E., Wygal, N. J.,… More

Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter