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एयरोसोल नमूनाकरण के लिए विट्रो एक्सपोजर कैसेट में एक नया पोर्टेबल

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58916
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Life Science Engineering, Virginia Commonwealth University

Summary

यहां, हम पोर्टेबल सेलुलर एयरोसोल एक्सपोजर प्रदर्शन और सेलुलर प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । विधि कोशिकाओं का उपयोग करता है, हवा में बड़े-तरल इंटरफेस, विवो फिजियोलॉजी में नकल उतार. कॉपर नैनोपैर्टिकल एयरोसोलों के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों पीढ़ी और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिहाई के रूप में cytotoxicity के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव के रूप में मनाया गया ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल विट्रो एक्सपोजर सिस्टम में एक नया परिचय, अपने लक्षण वर्णन और प्रदर्शन सहित पहना जा रहा है, में सक्षम । वायु-तरल इंटरफेस (ALI) इन विट्रो एक्सपोज़र सिस्टम अक्सर बड़े और भारी होते हैं, उत्सर्जन के स्रोत पर क्षेत्र और ऑपरेशन के लिए परिवहन कर रहे हैं या श्वास क्षेत्र के भीतर मुश्किल है । इन प्रणालियों के miniaturization के माध्यम से, प्रयोगशाला क्षेत्र के लिए लाया जा सकता है, प्रसंस्करण समय में तेजी लाने और एक अधिक उपयुक्त जोखिम विधि है कि एयरोसोल कोशिकाओं से संपर्क करने से पहले बदल नहीं करता प्रदान. विट्रो एक्सपोजर कैसेट (pivec) में पोर्टेबल एक ३७ मिमी फिल्टर कैसेट के लिए एक पारंपरिक प्रयोगशाला की स्थापना के बाहर विट्रो विषाक्तता परीक्षण में अनुमति के लिए adapts । pivec तांबे नैनोकणों के तीन आकारों का उपयोग करने के लिए साठा दक्षता gravimetric और कण संख्या एकाग्रता विश्लेषण के आधार पर निर्धारित की विशेषता थी । प्रारंभिक cytotoxicity प्रयोगों को उजागर फेफड़ों की कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था, जबकि सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के कणों को जमा करने के लिए प्रणाली की क्षमता का निर्धारण । pivec विट्रो एक्सपोजर डिवाइस में उपलब्ध लम्बवत प्रवाह की तुलना करते समय एक समान या बढ़ी हुई जमाव दक्षता प्रदान करता है । कम नमूना throughput के बावजूद, छोटे आकार विट्रो अली एक्सपोजर सिस्टम में मौजूदा करने के लिए कुछ लाभ देता है । ये व्यक्तिगत निगरानी के लिए पहना जा करने की क्षमता शामिल, प्रयोगशाला से उत्सर्जन के स्रोत के लिए गतिशीलता, और एक कम उपयोगकर्ता लागत को बनाए रखते हुए स्थानिक संकल्प के लिए कई प्रणालियों सेट अप करने के लिए विकल्प. पीवीओसी एक ऐसी प्रणाली है जो क्षेत्र में एयरोसोलों और श्वास क्षेत्र के भीतर एक हवा-interfaced पर, विट्रो मॉडल में एकत्रित करने में सक्षम है ।

Introduction

व्यक्तिगत नमूना इन विट्रो तकनीकों का उपयोग कार्यस्थल में एयरोसोलों के जैविक प्रभावों के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकता है । 1 हवा में contaminants के लिए जोखिम रासायनिक खुद को एक्सपोजर शामिल हैं, एकत्र हवा के नमूनों के लिए, जलमग्न परिस्थितियों के तहत जहां गैस सेल निलंबन के लिए शुरू की है, एक घुमाव के रूप में एक उपकरण का उपयोग आंतरायिक Exposures, या प्रत्यक्ष हवा में एक्सपोजर-तरल इंटरफेस (अली) । 2 इन तकनीकों के कई निलंबन या नमूनों के संग्रह में वृद्धि हुई कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन से पहले कर रहे हैं, जिनमें से प्रत्येक विष विज्ञान एयरोसोल में संभावित परिवर्तन के कारण अध्ययन को प्रभावित कर सकते हैं । 3 इन परिवर्तनों से बचने के लिए, प्रयोगशाला को उन विट्रो अली कल्चर एक्सपोजर सिस्टम में कई का उपयोग करके क्षेत्र में लाया जा सकता है जिनका उपयोग साहित्य में किया जाता है,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 हालांकि, कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । 8 , 9 , 12 ये प्रणालियाँ अक्सर भारी होती हैं, खासकर जब सेलुलर वातावरण के तापमान और आर्द्रता और नमूना एयरोसोल के प्रवाह की दर को विनियमित करने के लिए उपकरण शामिल हैं । pivec का उपयोग करके, एरोसोल एक्सपोजर एक पारंपरिक प्रयोगशाला की स्थापना के बाहर या श्वास क्षेत्र के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि साँस लेना शर्तों की नकल उतार.

विट्रो में एयरोसोल जमाव का दृढ़ संकल्प साँस लेना के कारण स्वास्थ्य के प्रभाव की जांच के लिए महत्वपूर्ण है । श्वास क्षेत्र, मुंह और नाक से 30 सेमी के भीतर क्षेत्र,14 नैनोकणों के लिए जोखिम को समझने और फेफड़ों में जैविक प्रभावों को जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । 2 अक्सर, कोशिकाओं पर जमाव एक जमाव दक्षता के रूप में परिभाषित किया गया है, पर जमा कणों और प्रणाली6,15 या एक ही राशि के एक बड़े पैमाने पर आधार पर प्रशासित कणों से विभाजित कोशिकाओं द्वारा उठाए गए । 4 , 16 श्वास क्षेत्र में एयरोसोलों को मापने के लिए वर्तमान तरीके फिल्टर आधारित हैं, किसी दिए गए नमूनाकरण की अवधि में कणों पर कब्जा कर रहे हैं और आगे परीक्षण करने के लिए फिल्टर का उपयोग कर रहे हैं । 17 व्यक्तिगत निगरानी एक छोटी सी प्रणाली है कि कम नमूनों की tradeoff के साथ आता है की आवश्यकता है ।

एक एयरोसोल के संपर्क से स्वास्थ्य प्रभाव निर्धारित करने के लिए कई दृष्टिकोण हैं । अली मॉडल एयरोसोल के लिए अनुमति देता है एक असली जोखिम परिदृश्य में के रूप में हवा के माध्यम से कोशिकाओं को सीधे प्रशासित, अभी तक यह अधिक लागत प्रभावी और कम समय vivo अध्ययन की तुलना में गहन है जबकि हवा तरल बाधाओं जैसे आंखों की नकल उतार, त्वचा, और फेफड़ों । फेफड़ों की कोशिकाओं को अली में हो एक polarized बाधा परत उत्पंन करने की क्षमता है,18,19 जो शारीरिक लक्षण पैदा करता है कि विवो फेफड़ों उपकला में , बलगम और विशिष्ट में सर्फैक्टेंट उत्पादन सहित के समान ब्रोंकियल या वायुकोशीय सेल लाइनों, पक्ष्माभ पिटाई,19 तंग जंक् शन,19,20 और सेल ध्रुवीकरण । इन के रूप में 18 परिवर्तनों को प्रभावित कर सकते हैं सेलुलर प्रतिक्रिया विषाक्तता अध्ययन में मापा. 21 इसके अलावा, इन विट्रो मॉडल परिणाम अक्सर निलंबन मॉडल22 के माध्यम से उजागर कोशिकाओं की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं और vivo इनहेलेशन विषाक्तता में तीव्र मॉडल करने में सक्षम हैं । 23 , 24 इसलिए, एक अली जोखिम प्रणाली है कि श्वास क्षेत्र के भीतर माप करने में सक्षम है एक प्राकृतिक अगले कदम है ।

उत्सर्जन के स्रोत पर सीधे एयरोसोल के लिए कोशिकाओं को उजागर करके, सभी गैसों के प्रभाव की जांच, अर्द्ध वाष्पशील यौगिकों, और मिश्रण में शामिल कणों होता है । जब मिश्रण एक फिल्टर पर एकत्र किया जाता है, गैसों और अस्थिर यौगिकों पर कब्जा नहीं कर रहे हैं और पूरे मिश्रण की जांच नहीं की जा सकती । इसके अलावा, एक पाउडर या एक तरल निलंबन में कणों के पुनर्गठन के एकत्रीकरण या कण तरल पदार्थ बातचीत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इस तरह के विघटन के रूप में, तरल निलंबन में. 25 , 26 जब एयरोसोल के कणों को तरल में जोड़ा जाता है, तो एक प्रोटीन कोरोना,28 या तरल में यौगिकों के साथ बातचीत के ढेर,25,27 के गठन के लिए एक उच्च क्षमता है, जो जमाव को प्रभावित कर सकता है और जैविक प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैं । 29 , 30

अली पर एक्सपोजर तीन मुख्य एयरोसोल प्रोफाइल, बादल बसने, समानांतर प्रवाह, और सीधा प्रवाह पर आधारित है । बादल बसने, हवा-तरल इंटरफेस सेल एक्सपोजर (ऐलिस) द्वारा इस्तेमाल किया,4 एक बैच प्रणाली है जहां गुरुत्वाकर्षण और विसरणी बसने के माध्यम से कणों जमा के रूप में एयरोसोल एक इकाई के रूप में इलाज है । समानांतर प्रवाह, विट्रो एक्सपोजर सिस्टम में इलेक्ट्रोस्टैटिक एयरोसोल द्वारा प्रयोग किया जाता है (बढिया)5 और बहुसंस्कृति एक्सपोज़र चैंबर (mec) II,6 प्रवाह प्रोफ़ाइल के माध्यम से ब्राउनीन गति के अलावा बयान के लिए अनुमति देता है । सीधा प्रवाह, एक microsprayer द्वारा प्रयुक्त,7 नैनो एयरोसोल चैंबर इन-विट्रो विषाक्तता के लिए (nacivt),11 और वाणिज्यिक अली सिस्टम8,9,10,12, के impaction कहते हैं जमाव क्षेत्र के भीतर कण । इन जोखिम प्रणालियों के कई बड़े और भारी हैं, एयरोसोल पूर्व कंडीशनिंग, प्रवाह के लिए पंपों, या कोशिकाओं की ऊष्मायन के लिए भी हीटिंग कक्षों के लिए अतिरिक्त प्रणालियों की आवश्यकता होती है । इस बड़े आकार सिस्टम की पोर्टेबिलिटी घटाता है । उत्सर्जन के स्रोत पर सीधे नमूने के बजाय, इन प्रणालियों अक्सर नमूनों प्रयोगशाला या मॉडल एयरोसोलों विश्लेषण के लिए उत्पंन करने के लिए लाया है । उत्सर्जित एयरोसोल की जटिलता क्षेत्र से प्रयोगशाला में अनुवाद में खो सकती है । pivec वर्तमान प्रणालियों की तुलना में छोटा है, लगभग ४६० सेमी2 के बाहरी सतह क्षेत्र के साथ और केवल ६० ग्राम वजनी, थर्मल और आर्द्रता नियंत्रण के साथ एक उच्च पोर्टेबल डिवाइस के लिए अनुमति प्रणाली में शामिल किया गया । घटी हुई आकार और वजन प्रणाली को पहना या जोखिम के स्रोत पर ले जाया जा करने के लिए अनुमति देते हैं, प्रत्यक्ष नमूना अनुमति ।

वर्तमान एक्सपोजर सिस्टम का बड़ा आकार भी सांद्रता में स्थानिक ढ़ाल की जांच करने के लिए नमूना प्रदर्शन करने की क्षमता कम हो जाती है । यह संकल्प महत्वपूर्ण है जब कई संभावित पर्यावरणीय और व्यावसायिक खतरों के जहरीले प्रभाव का निर्धारण करते हैं जैसे वाहनों का निकास पार्टिकुलेट मैटर या कार्यस्थल की गतिविधियां जहां एयरोसोलाइजेशन होता है । तुरंत उत्सर्जन के बाद, वहां कण एकाग्रता में एक स्थानिक विचरण हो जाता है । इस समय के साथ बढ़ता है कणों वातावरण भर में फैलाने और इन प्रभावों जैसे तापमान, दबाव, हवा, और सूरज के रूप में परिवेश की स्थिति के आधार पर बदल सकते हैं । कणों की उम्र और ऑक्सीकरण के रूप में अच्छी तरह से एक बार उत्सर्जित करने के लिए शुरू कर सकते हैं31,३२ और प्रसार दर स्थलाकृति से प्रभावित कर रहे हैं; उच्च सांद्रता घानों और सुरंगों में पाया जाएगा, जहां फैलाव प्रभाव धीमा कर रहे हैं, और कम सांद्रता पाया जा सकता है जहां फैलाव के लिए एक बड़ा क्षेत्र है । ३३ फैलाव दरों में इन परिवर्तनों का मानव स्वास्थ्य पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है और शहरी बनाम ग्रामीण सेटिंग्स में रहने वाले दमा वयस्कों की संख्या की तुलना करते समय देखा जा सकता है. ३४ जबकि कई एक्सपोजर सिस्टम एक ही बार में कई नमूने प्रदान करते हैं, कई सिस्टम स्थानिक संकल्प प्रदर्शन करने के लिए बड़े उपकरणों की एक बहुतायत के साथ आवश्यक हैं ।

क्षेत्र में लैब लाकर, विश्लेषण के समय पूरे सेल का उपयोग कर एक संवेदक के रूप में कमी की जा सकती है । जैविक तंत्र और अंतिमबिंदु ज्ञात के बाद एयरोसोल संरचना और आकार के निर्धारण में सहायता कर सकते हैं । धीमी निकासी के तरीकों के कारण, म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस, फैगोसाइटोसिस, और स्थानांतरण सहित, इन कणों को अक्सर सप्ताह के लिए लगभग दिनों के लिए कोशिकाओं के साथ बातचीत कर रहे हैं3 ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करना, सूजन, और यहां तक कि कोशिका मृत्यु. ये जैविक अंतिमबिंदु हृदय रोग या क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज के लिए प्रतिकूल परिणाम मार्ग के लिए प्रारंभिक बिंदु हो सकते हैं । इसके अलावा, wiemenn एट अल. विट्रो में एक सरणी के प्रदर्शन के लिए vivo साँस लेना विषाक्तता में अल्पावधि के लिए साहित्य मूल्यों के साथ तुलना assays । ३५ विवो प्रतिक्रिया में दो चार सकारात्मक परिणामों के साथ लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिहाई के माध्यम से cytotoxicity परीक्षण से भविष्यवाणी की गई थी, ग्लूटाथियोन कमी और हाइड्रोजन पेरोक्साइड गठन और रिहाई से ऑक्सीडेटिव तनाव, और सूजन क्षमता से ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा जीन । दस नैनोसाइज्ड धातु आक्साइड का परीक्षण किया, छह सक्रिय के रूप में परीक्षण (टाइटेनियम ऑक्साइड, जस्ता ऑक्साइड, और चार अलग सेरियम ऑक्साइड) vivo मेंपुष्टि के साथ विट्रो में exposures का उपयोग कर । 

एक व्यावसायिक सेटिंग में एयरोसौल्ज़ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमारे प्रयोगशाला क्षेत्र में exposures के लिए pivec विकसित की है । इसके अतिरिक्त, pivec व्यक्तिगत नमूने के लिए की निगरानी और ३७ मिमी फिल्टर कैसेट३६ या एकाधिक प्रणालियों की तरह इनहेलेशन एक्सपोजर की जांच के लिए पहना जा सकता है एक दिए गए क्षेत्र के भीतर स्थानिक संकल्प को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, pivec के लक्षण वर्णन और उपयोग की चर्चा की है । जोखिम के बाद, साइटोटॉक्सिसिटी assays के माध्यम से जैविक प्रभाव मनाया जाता है ।

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Protocol

ऑपरेटरों व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनना चाहिए (उदा लैब कोट, दस्ताने, काले चश्मे) जब कदम 1, 2, 3, 5, और 6 प्रदर्शन ।

1. सामग्री की तैयारी

  1. सिस्टम असेंबली के लिए सामग्री तैयार करें और दोहराव सुनिश्चित करने के लिए एक्सपोज़र ।
    1. नए या ७०% इथेनॉल साफ 1/4 "भीतरी व्यास प्रवाहकीय ट्यूबिंग और 1/4" प्रणाली विधानसभा के लिए बाहरी व्यास connectors का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. एक अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में फिल्टर, pivec घटकों, चिमटी, और कण पाउडर सहित परीक्षण सामग्री, तापमान और आर्द्रता के संबंध में, प्रयोग करने से पहले कम से 24 एच के लिए ।
      नोट: तापमान कमरे के तापमान के पास होना चाहिए, लगभग 20 डिग्री सेल्सियस, सापेक्ष आर्द्रता ३५% से कम है । प्रयोगों के बीच दोहराव को प्राप्त करने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है.
    3. भागों को साफ करने के लिए isopropanol का उपयोग कर कण काउंटरों तैयार करने और माप के लिए स्कैनिंग गतिशीलता कण sizer (एसएमपीएस) और ऑप्टिकल पार्टिकल sizer (ऑप्स) सहित निर्माता सिफारिशों, के अनुसार प्रणाली गर्म अप के लिए अनुमति देते हैं ।

2. शुष्क एयरोसोल का उत्पादन

नोट: ऑपरेटरों एक धूआं हुड में एयरोसोल पीढ़ी प्रदर्शन करना चाहिए ।

  1. सूखी एयरोसोलों उत्पन्न करने के लिए एक प्रणाली को इकट्ठा
    नोट: गैस या तरल में कणों के निलंबन मॉडलिंग की आवेदन और सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त होना चाहिए । निम्नलिखित विधि एक तरल आधारित एयरोसोल का उपयोग किया जा सकता है । ड्राई एयरोसोल सिस्टम का डिजाइन तिवारी एट अलसे है । ३७ सूखी प्रसार प्रणाली के एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है ।
    1. 4 "1/8 आकार पिरोया पाइप के प्रत्येक अंत करने के लिए गेंद वाल्व कनेक्ट, यह कण कूदनेवाला के रूप में काम करेंगे । कनेक्ट 2 "एक वाल्व के लिए 1/8 आकार पाइप ।
    2. कॉपर नैनोकणों वजन, इस अध्ययन में प्रत्येक कण के आकार के लिए जन एकाग्रता लगातार रखा गया था जबकि जमाव दक्षता का निर्धारण । लगभग उपयोग ७.५ ४० एनएम कॉपर नैनोकणों की मिलीग्राम, 7 १०० एनएम कॉपर नैनोकणों की मिलीग्राम, और 13 की मिलीग्राम ८०० एनएम कॉपर नैनोकणों के प्रति एक्सपोजर । खुले अंत के माध्यम से कण कूदनेवाला में तांबे नैनोकणों प्लेस ।
      नोट: तांबे नैनोकणों की राशि तौला जनता के आधार पर प्रशासित एकाग्रता के रूप में काम करेंगे ।
    3. प्लेस एक 3 "1/2 का टुकड़ा" बाहरी व्यास (आयुध डिपो) 2 "पाइप के आसपास टयूबिंग और इस तरह के छोटे टयूबिंग के अंदर एक HEPA फिल्टर जगह है कि प्रवाह की दिशा गेंद वाल्व के माध्यम से है ।
    4. थ्रेडिंग का उपयोग कर अन्य गेंद वाल्व के लिए वैक्यूम जनरेटर से कनेक्ट करें । पुश-टू-लॉक कनेक्शन में एक 5/16 "ओडी ट्यूबिंग रखकर वैक्यूम जनरेटर को एयर टैंक से कनेक्ट करें । का प्रयोग करें 1/4 "ओडी टयूबिंग वैक्यूम जनरेटर के आउटलेट वैक्यूम जनरेटर के आउटलेट पर रखकर प्रायोगिक सेट अप करने के लिए कनेक्ट करने के लिए ।
  2. शुष्क एयरोसोल प्रणाली का उपयोग सूखी एरोसोल उत्पन्न करने के लिए
    1. मुख्य वाल्व मोड़ और प्रणाली के लिए हवा के प्रवाह की अनुमति से हवा टैंक खोलें । एयर टैंक पर फ्लो रेगुलेटर पर वाल्व खोलें और ऐसे सेट करें कि सिस्टम के माध्यम से फ्लो वैक्यूम पंप पर वांछित सेटिंग्स के बराबर हो ।
    2. हेपा फ़िल्टर के निकटतम गेंद वाल्व खोलें तो वैक्यूम जनरेटर के लिए निकटतम गेंद वाल्व खोलें । लगभग 3 s के लिए इन खुले रखें कणों हवा धारा में खींच लिया जा करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. बंद गेंद वाल्व के निकटतम वैक्यूम जनरेटर तो बंद गेंद वाल्व के निकटतम HEPA फ़िल्टर करने के लिए । आवश्यकता के अनुसार प्रयोग की अवधि के लिए टैंक से हवा को प्रवाहित करने की अनुमति दें ।
    4. बंद मुख्य और एयर टैंक पर नियामक वाल्व प्रवाह को रोकने के लिए । स्वच्छ गेंद वाल्व और वैक्यूम जनरेटर का उपयोग कर ७०% इथेनॉल । नसबंदी के लिए आटोक्लेव मेटल पाइप ।

3. निक्षेपण दक्षता मापन pivec का उपयोग करना

नोट: ऑपरेटरों एक धूआं हुड में एयरोसोल जोखिम प्रदर्शन करना चाहिए ।

  1. एक पूर्व तौला फिल्टर पर चरण २.२ में उत्पन्न तांबे नैनोपैर्टिकल एयरोसोल इकट्ठा करके जमाव को मापने । जमा की गई खुराक का उपयोग करें, फ़िल्टर पर एकत्र द्रव्यमान का उपयोग करके मापा जाता है, और प्रशासित खुराक, मापा तांबे के कणों की मात्रा का उपयोग करते हुए, जमाव दक्षता का निर्धारण करने के लिए ।
    1. कम नमी की स्थिति के तहत १.०० μm रंध्र ग्लास फाइबर फिल्टर रखें, 1.1.2 में वर्णित, पूर्व जोखिम मापन से पहले कम से 24 एच के लिए । एक अप्रयुक्त फिल्टर तीन बार वजन और फिल्टर वजन रिकॉर्ड. अनुपयोगी फ़िल्टर को किसी कक्ष संस् कृति संमिलित करें में रखें ।
    2. फ़िल्टर के साथ सेल कल्चर डालने का समर्थन करने के लिए pivec के लिए उपयुक्त सेल कल्चर डालें एडाप्टर (6 well या 24 well) चुनें । प्लेस सेल संस्कृति pivec के आधार के शीर्ष पर अनुकूलक टुकड़ा डालने, जगह में स्थापित है कि एडाप्टर टुकड़ा के आधार शीर्ष से अधिक व्यापक है ।
    3. उपयोग चिमटी फिल्टर लोड सेल संस्कृति अनुकूलक टुकड़ा भीतर डालने जगह के लिए । इस तरह के शीर्ष टुकड़ा के आधार शीर्ष से अधिक व्यापक है कि जगह में बसने, एडाप्टर टुकड़ा के शीर्ष पर शीर्ष टुकड़ा रखें । पीवीओसी को डक्ट टेप की एकल परत के साथ लपेटें ।
    4. कनेक्ट ३७ मिमी कैसेट टुकड़े शीर्ष पर और pivec के नीचे जगह में धक्का द्वारा । प्लेस 1/4 "कैसेट इनलेट और आउटलेट में कंटीले एडाप्टर ।
    5. पीवीईसी के चारों ओर प्रतिरोधक हीटर लपेटें जैसे कि तारों के आधार पर हैं । सुरक्षित करने के लिए टेप ।
    6. इंसुलेशन के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के 8 राउंड के साथ pivec लपेटें । टेप के साथ सुरक्षित ।
    7. कनेक्ट 2 "1/2 का लंबा टुकड़ा" बाहरी व्यास लचीला टयूबिंग pivec के शीर्ष पर एडाप्टर के लिए । बाँझ पानी और pivec के शीर्ष पर टयूबिंग के भीतर जगह से झरझरा टयूबिंग निकालें ।
    8. अंगूठी खड़े और सुरक्षित पर दबाना भीतर pivec प्लेस । वैक्यूम पंप, कण काउंटरों, और एयरोसोल सेट अप के साथ पूरा सेट अप ।
      नोट: संख्या आधारित जमा खुराक निर्धारित किया जा सकता है केवल अगर कण काउंटरों pivec से पहले रखा जाता है और पीवीओसी अलग रन पर के बाद ।
    9. प्रोटोकॉल और वांछित जोखिम समय और प्रवाह दरों के चरण २.२ का उपयोग कर फिल्टर बेनकाब, इस अध्ययन में ०.५ lpm पर 10 मिनट का एक जोखिम समय इस्तेमाल किया गया था. सेट-अप से pivec निकालें । सेल संस्कृति डालने के बाहर ले लो और कम नमी की स्थिति के तहत फिल्टर धारक में उजागर फिल्टर के लिए ंयूनतम 24 एच माप से पहले जगह है ।
    10. ७०% इथेनॉल के साथ स्वच्छ pivec । अगले प्रयोग से पहले कम से 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के साथ जीवाणुरहित ।
    11. उजागर फिल्टर तीन बार वजन और फिल्टर वजन रिकॉर्ड । भंडारण के लिए एक लेबल फिल्टर धारक में उजागर फिल्टर रखें ।

4. जमा खुराक और जमाव दक्षता की गणना

नोट: बयान का ज्ञान एयरोसोल प्रशासन और सेलुलर प्रतिक्रिया की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है ।

  1. द्रव्यमान-आधारित मापन से जमाव की गणना करें
    1. पूर्व एक्सपोजर औसत वजन और पोस्ट-एक्सपोज़र औसत वजन के बीच अंतर के रूप में फ़िल्टर पर जमा किए गए द्रव्यमान की गणना करें । यह मान प्रयोग के लिए द्रव्यमान आधारित जमा की गई खुराक है ।
    2. प्रयोग के लिए जन-आधारित साठा दक्षता, ηमीटर, की गणना करने के लिए 4.1.1, एमरवानगीमें निर्धारित प्रशासित मास, एमएडमिन, और द्रव्यमान आधारित जमा की गई खुराक का उपयोग करें ।
      Equation
    3. पीवीओसी के लिए कण आकार के लिए जमाव और जमाव दक्षता निर्धारित करने के लिए कम से 3 प्रयोगों के लिए 4.1.1 और 4.1.2 से औसत मान.
  2. संख्या-आधारित मापन से जमाव की गणना करें
    1. सुनिश्चित करें कि कण काउंटरों के साथ माप pivec के बाद काउंटरों के साथ प्रदर्शन किया गया है और पीवीओसी से पहले कण एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए । कण काउंटर के लिए समय पर कण एकाग्रता एकीकृत तो कण व्यास पर एकीकृत कुल मापा कणों का निर्धारण करने के लिए.
    2. प्रस्तुत कण संख्या के रूप में प्रशासित कणों के बीच अंतर का परिकलन करें और कणों मापा बाद pivec. यह मान प्रयोग के लिए संख्या आधारित जमा की गई खुराक है ।
    3. प्रयोग के लिए संख्या-आधारित साठा दक्षता, ηn, की गणना करने के लिए प्रशासित कणों, nव्यवस्थापक, संख्या-आधारित जमा खुराक, एनरवानगी, volumetric प्रवाह दर, वी, और समय, टी का उपयोग करें ।
      Equation
    4. 4.2.2 और 4.2.3 से औसत मानों के लिए न्यूनतम 3 प्रयोगों के लिए पिव्क कण आकार के लिए साठा और साठा दक्षता निर्धारित करने के लिए.

5. कोशिकाओं के एयरोसोल एक्सपोजर

नोट: एयर-तरल अंतरफलक पर सेल संस्कृति के लिए पाठक रिक्त एट अलको संदर्भित किया जाता है । ३८ ऑपरेटरों सेल संस्कृति एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर लदान (चरण 5.1.2-5.1.4) डालने प्रदर्शन करना चाहिए । ऑपरेटरों एक धूआं हुड में एयरोसोल जोखिम प्रदर्शन करना चाहिए ।

  1. हवा में संस्कृति कोशिकाओं-तरल इंटरफेस
    1. एक T25 फ्लास्क के लिए ट्रिप्सिन-edta, 3 एमएल T75 फ्लास्क या 1 एमएल जोड़कर संस्कृति फ्लास्क से A549 कोशिकाओं को लिफ्ट करें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं । एक T75 कुप्पी या एक T25 फ्लास्क के लिए पूरा मीडिया के 4 मिलीलीटर के लिए पूरा मीडिया के 7 मिलीलीटर जोड़ें और को सेल निलंबन के साथ कुप्पी दीवार कुल्ला करने के लिए बरामद सेल संख्या को अधिकतम । सेल निलंबन को एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर 3 मिनट के लिए ८०० एक्स जी पर अपकेंद्री कोशिकाओं ।
    2. पूर्ण मीडिया के 10 मिलीलीटर में ट्रिप्सिन-edta युक्त सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल गोली resuspend । सेल निलंबन के 10 μl निकालें और hemocytometer में जोड़ें । एकाग्रता और कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
    3. प्लेस एक अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली के भीतर पूरा मीडिया के ०.५ मिलीलीटर । कुओं में अप्रयुक्त सेल संस्कृति आवेषण प्लेस । बीज कोशिका संवर्धन सेल के प्रकार के लिए 1 x 105 कोशिकाओं/सेमी2 के पास एक सेल घनत्व में ऊपर की ओर पर एक कक्ष में सम्मिलित करता है जो प्रति दिन दोहरीकरण के पास एक दर पर बढ़ता है । करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से डालने के भीतर A549 कोशिकाओं बीज, 1 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज कोशिकाओं/मुख्यमंत्री2 सेल संस्कृति डालने के लिए ३५,००० कोशिकाओं को जोड़कर ।
      नोट: एक धीमी वृद्धि दर के साथ कोशिकाओं को एक वृद्धि हुई सेल घनत्व पर बीज किया जा सकता है ।
    4. अंतिम वॉल्यूम तक पहुंचने के लिए सेल कल्चर डालने के लिए पूर्ण मीडिया जोड़ें (24 अच्छी तरह प्लेट के लिए अंतिम वॉल्यूम ०.२५ mL है) ।
    5. 7 दिनों के लिए संस्कृति जलमग्न परिस्थितियों में, हर 1-2 दिन मीडिया की जगह । 7 दिनों के बाद, एपिकल मीडिया और संस्कृति को अली की स्थितियों में कम से 1 दिन के लिए निकालें, केवल बासोटेरल मीडिया की जगह ।
  2. पीवीओसी इकट्ठा
    1. कोशिकाओं को हवा के लिए equilibrate करने की अनुमति-तरल अंतरफलक के लिए कम से 24 एच जोखिम से पहले ।
    2. फ़िल्टर के साथ सेल कल्चर डालने का समर्थन करने के लिए pivec के लिए उपयुक्त सेल कल्चर insert एडेप्टर चुनें. प्लेस सेल संस्कृति pivec आधार के शीर्ष पर डालें एडाप्टर टुकड़ा, जगह में स्थापित करने के लिए ऐसी है कि एडाप्टर टुकड़ा के आधार शीर्ष से अधिक व्यापक है । pivec के आधार के कुआं के लिए सेल संस्कृति मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. का प्रयोग करें चिमटी के लिए जगह अनुकूलक चरण 5.2.3 में रखा टुकड़ा के भीतर सेल संस्कृति डालने के लिए । इस तरह के शीर्ष टुकड़ा के आधार शीर्ष से अधिक व्यापक है कि जगह में बसने, एडाप्टर टुकड़ा के शीर्ष पर शीर्ष टुकड़ा जगह है । सावधानीपूर्वक, डक्ट टेप की एक परत के साथ pivec लपेटो ।
    4. कनेक्ट ३७ मिमी कैसेट टुकड़े pivec के ऊपर और नीचे, जगह में धकेलने के द्वारा । प्लेस 1/4 "कैसेट इनलेट और आउटलेट में कंटीले एडाप्टर ।
    5. pivec के चारों ओर प्रतिरोधक हीटर लपेटें ऐसी कि तारों के आधार पर हैं. सुरक्षित करने के लिए टेप ।
    6. इंसुलेशन के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के 8 राउंड के साथ pivec लपेटें । टेप के साथ सुरक्षित ।
    7. कनेक्ट 1/2 के छोटे टुकड़े "बाहरी व्यास लचीला टयूबिंग के लिए pivec के शीर्ष पर एडाप्टर । बाँझ पानी और pivec के शीर्ष पर टयूबिंग के भीतर जगह से झरझरा टयूबिंग निकालें ।
    8. अंगूठी खड़े और सुरक्षित पर दबाना भीतर pivec प्लेस । वैक्यूम पंप और एयरोसोल सेट-अप के साथ सेट-अप को पूरा करें ।
  3. अली पर प्रकोष्ठों बेनकाब pivec का उपयोग
    1. aerosolized किया जा करने के लिए कणों के द्रव्यमान की गणना करने के लिए चरण 2 में निर्धारित साठा दक्षता का उपयोग करें । उचित द्रव्यमान तौलना और एयरोसोल प्रणाली को जोड़ने के धूआं हुड के भीतर चरण 2 निंनलिखित सेट ।
    2. कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए कदम २.२ का पालन करके, जैविक अंतिमबिंदु के इस अध्ययन में कोशिकाओं को उजागर किया गया लगभग ३.५ की एक प्रवाह दर के साथ तांबे नैनोकणों की मिलीग्राम ०.५ lpm और 10 मिनट की एक जोखिम अवधि. नियंत्रण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया ह्यूमिफाइड हवा का पता लगाया अकेले हवा का प्रभाव । सेट-अप से pivec निकालें । बाहर सेल संस्कृति डालें, बाँझ अच्छी थाली में जगह ले लो और सह2 इनकोबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, ९०% आरएच) के लिए वापस ।
    3. पीवीओसी से महाप्राण मीडिया । यदि अतिरिक्त प्रयोग प्रदर्शन, पीवीओसी के नीचे कुल्ला फॉस्फेट buffered समाधान के साथ तो चरण ५.१ और ५.२ दोहराएं ।
    4. ७०% इथेनॉल के साथ स्वच्छ pivec जब समाप्त हो गया । अगले प्रयोग से पहले कम से 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के साथ जीवाणुरहित ।
  4. जैविक परख प्रक्रियाएं
    नोट: इस अध्ययन में प्रदर्शन assays dcfh के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव पीढ़ी थे दा परख और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (ldh) रिहाई के माध्यम से cytotoxicity ।
    1. भंग २४.४ dcfh की मिलीग्राम-डीए में ५० एमएल मेथनॉल बनाने के लिए 1 मिमी dcfh-डीए समाधान. इस घोल को 4 महीने तक-20 ° c पर संग्रहित किया जा सकता है । 1 मिमी dcfh-डीए समाधान के ०.१ मिलीलीटर मिश्रण से 10 मिलीलीटर के साथ 1 मिमी डीसीएफएच-डीए समाधान ९.९ मिलीलीटर hbss के 10 μm dcfh-da को पतला बनाने के लिए ।
    2. सेल संस्कृति मीडिया और धोने सेल संस्कृति pbs के लगभग 1 मिलीलीटर के साथ डालने निकालें । एक अच्छी तरह से 10 μm dcfh-DA समाधान के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें, जब समाप्त आवेषण की जगह । एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर प्लेट डाई की photoactivation को रोकने के लिए और के लिए 37 ° c इनक्यूबेटर वापस 1 ज.
    3. इनकोबेटर से कोशिकाओं को हटाने और कुओं से dcfh दा काम कर समाधान महाप्राण. कुओं को ०.५ मिलीलीटर hbss जोड़ें और सेल संस्कृति आवेषण की जगह ।
    4. प्लेट रीडर में अच्छी तरह से थाली लोड और 485/530 एनएम के उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग आधारभूत प्रतिदीप्ति उपाय । थाली रीडर से थाली निकालें और जोखिम के लिए pivec में डालने लोड ।
    5. वांछित जोखिम अवधि के लिए कोशिकाओं को बेनकाब । pivec से डालें निकालें और अच्छी तरह से थाली में लौटें । अच्छी तरह से थाली और सफेद ९६ अच्छी तरह से थाली में जगह से बेसोलैटरल द्रव के ५० μl निकालें । 2 ज के लिए हर 30 मिनट के बाद जोखिम 485/530 एनएम के उत्तेजना/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके डीसीएफ के प्रतिदीप्ति को मापें ।
    6. 20-30 मिनट के लिए के लिए कमरे के तापमान के लिए basolateral तरल पदार्थ equilibrate चलो, अच्छी तरह से थाली से basolateral तरल पदार्थ के लिए ldh परख समाधान, मिश्रित निम्नलिखित निर्माता प्रोटोकॉल के ५० μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करते हैं । अच्छी तरह से बंद करो समाधान के 25 μl जोड़ें । 560/590 एनएम के उत् तेजन/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके रिसोरूफिन उत् पाद की प्रतिदीप्ति पढ़ें ।
    7. अतिरिक्त बेसोलैटेरल द्रव निकालें और चरण 5.4.6 को 4 एच और 24 एच पोस्ट-एक्सपोजर पर दोहराएं ।

6 सांख्यिकीय विधियां

  1. जैविक परख डेटा का विश्लेषण
    1. रिपोर्ट ROS उत्पादन आधारभूत मापन के सापेक्ष इलाज किया कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता वृद्धि के रूप में । इलाज की कोशिकाओं के सापेक्ष कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता वृद्धि के रूप में ldh गतिविधि रिपोर्ट.
    2. डेटा सेट के बीच सांख्यिकीय अंतर निर्धारित करने के लिए एकल फ़ैक्टर anova निष्पादित करें. जहां उपयुक्त हो, ०.०५ के महत्व के मूल्य पर छात्र टी परीक्षण प्रदर्शन । न्यूनतम तीन एक्सपोज़र मापन के माध्य ± मानक विचलन के रूप में डेटा की रिपोर्ट करना ।

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Representative Results

व्यावसायिक विट्रो विष विज्ञान में सेलुलर व्यवहार्यता बनाए रखने शामिल है जबकि एयरोसोल जोखिम प्रदर्शन । पीवीओसी सिस्टम चित्रा 2में दिखाया गया है, जिसमें तापमान और आर्द्रता नियंत्रण और पहना हुआ pivec शामिल है । तापमान एक बैटरी संचालित प्रतिरोधी हीटर और एयरोसोल का उपयोग कर बनाए रखा गया था एक झरनी, गीला ट्यूब के माध्यम से वृद्धि की प्राकृतिक ह्यूमेडिफिकेशन का उपयोग कर humidified । एक प्रयोगशाला के अंदर एक नियंत्रित एयरोसोल सेटिंग में, pivec चित्रा 1में दिखाया जोखिम के लिए सेट अप किया जा सकता है । प्रणाली के लक्षण वर्णन कोशिकाओं है जो फिर सेलुलर प्रतिक्रिया करने के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है पर जमा खुराक के निर्धारण के लिए अनुमति देता है ।

निक्षेपण दक्षता सिस्टम में जोड़े गए कणों के आकार पर निर्भर होती है क्योंकि जमाव बलों में impaction, अवसादन, और प्रसार शामिल है । इसके अलावा, जमाव प्रवाह दर, एक्सपोजर समय, और जोखिम प्रणाली की विशेषताओं पर निर्भर है । इस जानकारी के साथ, जमाव का अनुमान लगाया जा सकता है । pivec के साठा दक्षता दो तरीकों के माध्यम से निर्धारित किया गया है, gravimetric विश्लेषण, और कण संख्या गिनती. समीकरण 1 और 2 फ़िल्टर आधारित, स्कैनिंग गतिशीलता कण sizer (smps), और ऑप्टिकल पार्टिकल sizer (OPS) माप, चित्रा 3का उपयोग कर तालिका 1 में साठा क्षमता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया । बढ़ा हुआ जमाव 6 अच्छी तरह से डिजाइन की तुलना में 24 अच्छी तरह से डिजाइन के लिए कुल मिलाकर मनाया जाता है और ४० एनएम और ८०० एनएम तांबे के कणों की तुलना में १०० एनएम के लिए थोड़ा कम हो जाता है । 24 कुओं में बयान डालने पर बहुत वर्दी है, तथापि, 6 में बयान अच्छी तरह से डिजाइन में एकरूपता की कमी है के रूप में डालने के केंद्र के पास जमा कणों की सबसे । पोस्ट-एक्सपोजर विश्लेषण ३७ मिमी फिल्टर और सेल संस्कृति डालने के बीच खुराक संबंध का निर्धारण करके त्वरित किया जा सकता है, सेलुलर एक्सपोजर के बाद खुराक निर्धारित करने की आवश्यकता कम हो जाती है । ३७ मिमी फिल्टर कैसेट और pivec के भीतर बयान की तुलना ०.७ ऊपर के एक पियरसन सहसंबंध के साथ सभी आकारों और कुओं के लिए एक मजबूत सहसंबंध से पता चलता है, लेकिन केवल ८०० एनएम के लिए एक पी < 0.05 के साथ महत्वपूर्ण सहसंबंध है, चित्रा 4देखें । साहित्य भर में इसी तरह की प्रणालियों की तुलना में,11,12 कण के आकार की सीमा से अधिक pivec के जमाव क्षमता का परीक्षण तुलनीय है या रिपोर्ट मूल्यों पर वृद्धि हुई है, चित्रा 5में मनाया । pivec के भीतर जमाव क्षमता को कम करने के माध्यम से सुधार किया जा सकता है प्रणाली का उपयोग कर सिस्टम के लिए नुकसान इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षय या प्रवाहकीय प्लास्टिक या इसी तरह की सामग्री pivec डिजाइन करने के लिए.

यदि फिल्टर अच्छी तरह से जोखिम से पहले एक नमी नियंत्रित वातावरण में सूख नहीं कर रहे हैं, अतिरिक्त पानी प्रारंभिक द्रव्यमान बढ़ जाती है और गैर शारीरिक, नकारात्मक जमा खुराक का उत्पादन कर सकते हैं । परिवर्तनीय प्रवाह दर भी प्रणाली के भीतर असंगत जमा खुराक को बढ़ावा कर सकते हैं । इन समस्याओं से बचने के लिए, एक नमी नियंत्रित वातावरण में शुष्क करने के लिए और फिल्टर के लिए जोखिम के बाद एक दिन पहले की अनुमति दें ।

सेलुलर प्रतिक्रियाओं जमा खुराक से प्रभावित हो जाएगा और जोखिम की अवधि से प्रभावित हो सकता है अगर कोशिकाओं को ठीक से बनाए रखा नहीं कर रहे हैं. A549 कोशिकाओं, एक वायुकोशीय उपकला कार्सिनोमा सेल लाइन, ०.५ lpm की एक प्रवाह दर पर तांबे नैनोकणों के आकार बदलती करने के लिए 10 मिनट के लिए उजागर किया गया । वैकल्पिक सीधा प्रवाह जोखिम सिस्टम एक निरंतर प्रदर्शन अवधि के लिए ०.००५ lpm और १.५ lpm के बीच का उपयोग करें, जबकि इस विधि एक तेजी से जोखिम के दौरान एक उदारवादी प्रवाह दर का उपयोग करता है । द्रव्यमान आधारित साठा दक्षता मापा और प्रशासित खुराक का उपयोग करना, १.५८ ± ०.०४ mg/cm 2 of ४० nm तांबा, ०.३० ± ०.०० mg/cm2 of १०० nm कॉपर कणों, और ०.३२ ± ०.०१ mg/cm2 of ८०० nm तांबे के कणों को कोशिकाओं पर जमा किया गया । cytotoxicity और ऑक्सीडेटिव तनाव पहले चौबीस घंटे के बाद प्रदर्शन के भीतर देखा गया । cytotoxicity क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (ldh) की रिहाई का उपयोग कर मापा गया था तुरंत, 4 घंटे, और 24 घंटे के बाद जोखिम । वहां तांबे नैनोकणों से कोई महत्वपूर्ण विषाक्तता से नीचे १.६२ mg/cm2 जोखिम के 4 घंटे के भीतर, चित्रा 6b। चौबीस घंटे बाद एक्सपोजर वहां तांबे के नैनोकणों के संपर्क में कोशिकाओं के लिए 20% से कम व्यवहार्यता के सेल व्यवहार्यता में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी थी । इंट्रासेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव dcfh के ऑक्सीकरण के माध्यम से डीसीएफएच-डीए परख पहले दो घंटे के बाद जोखिम, चित्रा 6aके भीतर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के माध्यम से जांच की गई थी । ऑक्सीडेटिव तनाव के महत्वपूर्ण स्तर तीस मिनट के बाद सभी आकारों के तांबे नैनोकणों को उजागर कोशिकाओं के लिए जोखिम में मापा गया । ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर को दो घंटे के भीतर परीक्षण किए गए सभी आकारों के लिए समान दरों पर बढ़ाना जारी रखा गया ।

एक्सपोजर की सफलता सेलुलर प्रतिक्रिया की पुनरावृति के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है । साइटोटॉक्सिसिटी assays के लिए प्रस्तावित दो स्वीकृति मापदंड में शामिल हैं: 1)% कुल ldh रिसाव सकारात्मक नियंत्रण के लिए ५०% से अधिक होना चाहिए, और 2) सकारात्मक और नमूना प्रतिकृति विविधताओं का गुणांक ५०% के भीतर होना चाहिए. ३९ यदि ये मापदंड पूरी नहीं हैं, तो यह प्रयोगों, जैसे परिवर्तित साठा मात्रा, या खराब आर्द्रता या तापमान नियंत्रण के बीच अंतर सुझाएँ । इसके अलावा, अवलोकन cytotoxicity माप प्रयोगात्मक नियंत्रण और त्रुटि का निर्धारण करने में सहायता की समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । जब प्रवाह की दर बहुत अधिक है, कोशिकाओं कतरें तनाव की उच्च मात्रा से मर सकता है । प्रवाह की दर को कम करके, प्रवाह से कोशिकाओं पर तनाव कम किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1. शुष्क परिक्षेपण प्रणाली और प्रायोगिक समुच्चय का योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2. pivec डिजाइन । क) पूर्ण डिजाइन तुलना के लिए 30 सेमी लंबा बॉक्स के साथ चित्र । ख) तापमान और आर्द्रता नियंत्रण के साथ pivec तुलना के लिए 30 सेमी लंबा बॉक्स के साथ चित्र । ग) पहना pivec । D) पीवीओसी शीर्ष टुकड़ा । ई) सेल संस्कृति एडाप्टर के लिए 24 अच्छी तरह से (बाएं) और 6 अच्छी तरह से (सही) । च) निचला टुकड़ा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

संख्या आधारित निक्षेपण दक्षता (%) द्रव्यमान आधारित निक्षेपण दक्षता (%)
6 अच्छी तरह से ४० एनएम १७.८३ ± ३२.१३ ५.८५ ± ०.८५
१०० एनएम ०.४७ ± ४.०६ ५.११ ± ०.९४
८०० एनएम ३.७० ± ३५.०० ६.३९ ± १.०१
24 अच्छी तरह से ४० एनएम १.४३ ± २.४३ १२.६१ ± १.३४
१०० एनएम १.३७ ± १९.४५ २.९५ ± ०.७५
८०० एनएम ६.९८ ± ३.९३ १५.९५ ± ०.५३

तालिका 1. pivec साठा दक्षता.

Figure 3
चित्रा 3. कॉपर नैनोआर्टिकल एयरोसोलों के कण संख्या एकाग्रता । A) एसएमपीएस मापन । ख) ऑप्स माप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4. सेल डालने और skc ३७ मिमी फिल्टर पर बयान के बीच संबंध. त्रुटि ± ०.००२ मिलीग्राम । एक) ४० एनएम तांबे कणों । B) १०० एनएम कॉपर कण । C) ८०० एनएम कॉपर कण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. पीवीओसी की निक्षेपण दक्षता, साहित्य में लंबवत् प्रवाह जोखिम प्रणालियों की तुलना में । सीधा प्रवाह एक्सपोज़र सिस्टम से साहित्य मानों को ठोस मार्कर में प्लॉट कर रहे हैं और pivec मान खाली मार्कर में हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. कॉपर नैनोकणों पोस्ट-एक्सपोजर (पीई) के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया । सभी मापन के लिए, n = 3 और p < 0.05. ए) ऑक्सीडेटिव तनाव dcfh-डीए परख का उपयोग कर निर्धारित किया । ख) cytotoxicity ldh परख का उपयोग कर निर्धारित किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

फिल्टर कैसेट श्वास क्षेत्र में एयरोसोलों को इकट्ठा करने का एक सरल, सस्ता तरीका प्रदान करते हैं; हालांकि, फिल्टर से निकाले गए एयरोसोल के नमूने पूरे एयरोसोल (यानी गैसों, वोलाटिलेस, और पार्टिकुलस) का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं और फलस्वरूप संबंधित जैविक प्रभावों के आकलन को सीमित करते हैं । ३७ मिमी फिल्टर कैसेट के प्रारंभिक डिजाइन का उपयोग करना, pivec सुवाह्यता बनाए रखने और साँस लेना से कणों के vivo जमाव में नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. pivec वर्तमान अली एक्सपोजर सिस्टम से काफी छोटा है, लगभग तापमान और आर्द्रता नियंत्रण के साथ एक ऊतक बॉक्स के आकार शामिल हैं । इसके अलावा में एयरोसोल को सेलुलर प्रतिक्रिया पर डेटा की पेशकश करते हुए आकार व्यक्तिगत झरना प्रभावदाताओं के समान है । जबकि pivec अन्य वर्तमान जोखिम प्रणालियों की तुलना में एक नमूना के लिए अंतरिक्ष में शामिल, छोटे आकार कई प्रणालियों परमिट एक बार में इस्तेमाल किया जा करने के लिए, इसलिए, नमूना आकार में वृद्धि और स्थानिक वितरण के लिए अनुमति देने पर नजर रखी जा.

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । साठा दक्षता निर्धारित करने के लिए, यह ठीक से फ़िल्टर, चरण 1 में वर्णित के रूप में स्थिति के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, यह ठीक तांबे नैनोकणों जोखिम से पहले वजन और फिल्टर पोस्ट करने के लिए जन आधारित जमाव दक्षता निर्धारित करने के लिए जोखिम महत्वपूर्ण है । संख्या जमाव दक्षता प्रारंभिक एयरोसोल एकाग्रता और अंतिम कण काउंटर का उपयोग कर निर्धारित एकाग्रता के बीच बयान में अंतर का उपयोग निर्धारित किया जाना चाहिए । यदि जमाव दक्षता ठीक से निर्धारित नहीं है, यह एयरोसोल प्रकार के बीच जैविक प्रतिक्रिया मतभेदों को निर्धारित करने के लिए मुश्किल है । जमाव में संशोधनों में जमाव को बदलना शामिल है । प्रवाह दर और एक्सपोजर अवधि को बदलकर जमाव बढ़ाया जा सकता है । यह कोशिकाओं को सुखाने की क्षमता के साथ सेल व्यवहार्यता को भी प्रभावित कर सकता है । एयरोसोलों की कंडीशनिंग अक्सर शरीर के तापमान और वायुमार्ग में ह्यूमीलीकरण जैसे शारीरिक विशेषताओं की क्षतिपूर्ति करने के लिए की जाती है । बढ़ी हुई नमी, ५०% से अधिक, mimics हवा साँस और सेल वाहन जोखिम के कारण मौत कम हो जाती है. ४३ जब तापमान और आर्द्रता अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं कर रहे हैं, सेलुलर प्रतिक्रिया प्रभावित किया जा सकता है. प्रवाह की दर को कम करके, सभी आकारों के अतिरिक्त कणों जमा होगा, जमाव में वृद्धि. एक्सपोज़र अवधि, जमाव के समानुपाती होती है, और अधिक कणों को विस्तारित प्रयोगात्मक अवधि में जमा करने की अनुमति देती है । एयरोसोल के कंडीशनिंग महत्वपूर्ण है जब जोखिम की अवधि में वृद्धि इतनी है कि कोशिकाओं को बाहर सूखी जो जैविक प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते है नहीं है ।

पीवीओसी impaction, अवसादन के माध्यम से कणों को जमा करने के लिए सीधा प्रवाह का उपयोग करता है, और कोशिकाओं है जो प्रवाह के माध्यम से कोशिकाओं को सुखाने और कोशिकाओं पर तनाव जोड़ा क्षमता है पर प्रसार । जमाव दक्षता, जमाव की शक्तियों के कारण कण के आकार पर निर्भर होती है । सीधा प्रवाह के साथ मौजूदा जोखिम प्रणालियों के कई 10% से नीचे और बहुत करीब 1% की एक जमाव क्षमता है । pivec एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति डालने के लिए एक साठा दक्षता 3% से 16% की gravimetric विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया है । एक ही डालने के लिए कण संख्या आधारित साठा दक्षता लगभग 1% से 7% है । जब एक अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग करते हुए, इन संख्याओं को कम, छोटे कण आकार के अपवाद के साथ, एयरोसोल के को व्यवस्थित बनाने के कारण अधिक कणों के रूप में सेल संस्कृति में सीमित प्रवाह के लिए अंतरिक्ष के बिना डालने के लिए विकसित कर रहे हैं । 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण बाईपास जमाव को एयरोसोल धाराओं की अनुमति । अंय सीधा प्रवाह प्रणालियों एक बड़े पैमाने पर ६० एनएम fluorescein कणों४०, ८० एनएम और १८० एनएम तांबा कणों16, और ६० एनएम ऐडिपिक एसिड कणों४१का उपयोग कर के आधार पर विशेषता है । परिणामी जमाव क्षमता सामांयत: ०.०५% और 11% के बीच होती है । एक संख्या के आधार पर, इन प्रणालियों polystyrene कणों12,15, कार्बन नैनोकणों12, और सिलिका कणों४२, ०.२% और 11% के बीच उपज क्षमता का उपयोग कर विशेषता किया गया है । pivec उपलब्ध सेलुलर एक्सपोजर उपकरणों की तुलना में समान या वृद्धि, जमाव प्रदान करता है ।

सेल जोखिम ४० एनएम, १०० एनएम, और ८०० एनएम के तांबे नैनोकणों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । सेल व्यवहार्यता चार घंटे के बाद जोखिम के भीतर व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण कमी के साथ ldh परख का उपयोग कर परिभाषित किया गया था । ldh परख के लिए एक वाणिज्यिक जोखिम प्रणाली के साथ इस्तेमाल किया गया था ७४ एनजी/2 घंटे और १४८ एनजी/सेमी 2 के बाद 4 घंटे के बाद ९.२ एनएम कॉपर ऑक्साइड कणों४४ और 1 μg/सेमी2 एक अनुक्रमिक जोखिम के बाद जमा 4 घंटे, 2 के लिए ऊष्मायन घंटे, तो 25 एनएम कॉपर ऑक्साइड कणों४०के 4 घंटे के लिए एक और जोखिम, दोनों सेल व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कमी को मापने । cytotoxicity 1.6-7.6 μg/cm2 के १८० एनएम कणों तांबा नैनोकणों16 trypan नीला डाई बहिष्करण द्वारा मापा के लिए एक और प्रणाली में मनाया गया । 40-80 एनएम कॉपर ऑक्साइड नैनोकणों के लिए 15 मिनट के एक्सपोजर व्यवहार्यता की कमी हुई, 24 घंटे के बाद जोखिम मापा । कम विषाक्तता pivec का उपयोग करने की संभावना 10 मिनट और कम पोस्ट जोखिम माप बार के छोटे जोखिम समय की वजह से मनाया गया । चार घंटे के बाद जोखिम के बाद, pivec में उजागर कोशिकाओं की व्यवहार्यता में कमी आई है । आर्द्र वायु नियंत्रण के संपर्क में कोशिकाओं को कोई महत्वपूर्ण cytotoxicity मनाया, अंय अध्ययन के साथ समझौते में 9,४०,४४,४५,४६। ऑक्सीडेटिव तनाव dcfh दा परख का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । इस तरह के हाइड्रोजन पेरोक्साइड या ऑक्सीजन कण के रूप में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, तनाव है कि विकास की गिरफ्तारी या सेल मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की एक राशि उत्पन्न. कोशिका जोखिम के बाद, इनॉबेटर में रखे कोशिकाओं के लिए ऑक्सीडेटिव तनाव में न्यूनतम वृद्धि हुई, नियंत्रण के रूप में और आर्द्र वायु के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं के लिए । ऊंचा ऑक्सीडेटिव तनाव सभी कण आकार के लिए हुई, 30 मिनट के बाद जोखिम के भीतर बढ़ रही है । एक अध्ययन के भीतर, ९.२ एनएम कॉपर ऑक्साइड कणों४४ और 25 एनएम कॉपर ऑक्साइड कणों४० भी carboxy-dcfh-डीए परख के माध्यम से मापा ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित । 2 घंटे से 4 घंटे के लिए वृद्धि हुई एक्सपोज़र समय ९.२ एनएम कॉपर ऑक्साइड कणों४४के लिए ऊंचा ऑक्सीडेटिव तनाव । प्रदर्शन के चार घंटे के बाद, ९.२ एनएम कॉपर ऑक्साइड कणों का उत्पादन एक समान ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रिया के रूप में 25 एनएम कॉपर ऑक्साइड४०कणों के अनुक्रमिक जोखिम, सुझाव है कि जोखिम अवधि ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया पर एक उच्च प्रभाव है कण आकार से । कोशिकाओं pivec के भीतर उजागर उस अध्ययन की तुलना में ऊंचा ऑक्सीडेटिव तनाव का उत्पादन किया है, तथापि, वैकल्पिक प्रणाली में उजागर कणों तांबे ऑक्साइड रहे है और कम जल्दी भंग pivec के भीतर तांबे से उजागर होगा । संरचना और कणों के आकार पर आधारित तांबे के विघटन पर किए गए अध्ययनों से सहमत है कि बड़े कणों और धातु आक्साइज़ धातु कणों या उनके नैनोपैर्टिकल समकक्षों की तुलना में धीमी आयनों जारी16,४७ , ४८ , ४९ आर्द्र वायु नियंत्रण के रूप में इनकोबेटर नियंत्रण की तुलना में ऑक्सीडेटिव तनाव के महत्वपूर्ण मात्रा में उत्पादन नहीं किया था, तांबे के कणों के प्रभाव ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करने के लिए pivec के भीतर समान है विट्रो जोखिम में इसी तरह सिस्टम. pivec का उपयोग करके मनाया जाने वाला जैविक प्रतिक्रियाएं यह सुझाता है कि pivec सेलुलर एक्सपोजर के लिए एक उपयुक्त प्रणाली है ।

जबकि pivec के लक्षण वर्णन और सेलुलर अध्ययन साहित्य के साथ अच्छी तरह से सहमत हैं,9,16,४०,४४,४६ डिवाइस की सीमाएं हैं । छोटे डिजाइन अन्य जोखिम प्रणालियों की तुलना में एक ही डिवाइस के भीतर एक साथ उजागर किया जा सकता है कि नमूनों की संख्या कम हो जाती है. अंय प्रणालियों के लिए एक ही एयरोसोल9,12 सुविधा सूचना को दोहराने मापन के लिए कम से तीन सेलुलर जोखिम के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि pivec केवल प्रणाली प्रति एक डालने के लिए अनुमति देता है, छोटे आकार कई प्रणालियों के लिए आसानी से इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है, इस मुद्दे को कम करने में मदद. जबकि अंय व्यक्तिगत निगरानी प्रणालियों कोशिकाओं का उपयोग नहीं करते हैं, pivec ऊर्ध्वाधर के पास रखा जाना चाहिए सेल संस्कृति मीडिया को सेलुलर व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए आवश्यक spilling कम । हालांकि pivec अभी तक विशिष्ट कण पर्वतमाला के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है (जैसे pm10, pm२.५, pm०.१), pivec कण आकार की एक सीमा के लिए विशेषता है । अन्य सीधा प्रवाह प्रणालियों के समान, pivec व्यास में १०० एनएम के पास कणों को जमा करने की क्षमता में कमी दिखाता है, जबकि ४० एनएम और ८०० एनएम कण समान दक्षता के साथ जमा होते हैं ।

कोशिकाओं के पोस्ट-एक्सपोजर का विश्लेषण pivec और एक skc ३७ मिमी फिल्टर कैसेट के भीतर एयरोसोल्स के समानांतर संग्रह करने से शीघ्र किया जा सकता है । gravimetric आधारित जमाव का एक उच्च सहसंबंध ३७ मिमी फिल्टर का उपयोग कर एकत्र डेटा से कोशिकाओं पर एकत्र कण द्रव्यमान के आकलन के लिए अनुमति देता है । फिल्टर कैसेट में डालने की तुलना करने के लिए अतिरिक्त नमूनों और अतिरिक्त माप इकट्ठा करने की आवश्यकता को कम कर देता है खुराक निर्धारित करते हैं । प्रगति में काम cytotoxicity, ऑक्सीडेटिव तनाव, या अन्य जैविक अंतिमबिंदु के लिए एक वास्तविक समय निगरानी प्रणाली के एकीकरण भी शामिल है । pivec के छोटे आकार यह एक रासायनिक संयंत्र के ऊपर एक ड्रोन पर, या स्थानिक संकल्प के लिए वातावरण में बाहर, जैसे एक व्यक्तिगत मॉनिटर के रूप में शरीर पर, सेटिंग्स की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है. इस विधि सेल संस्कृतियों पर एयरोसोल कणों के संग्रह के लिए pivec का उपयोग अली में हो दिखाया गया है । ३७ ± 1 डिग्री सेल्सियस और > ८०% सापेक्ष आर्द्रता के लिए एयरोसोल कंडीशनिंग द्वारा, सेलुलर व्यवहार्यता तीव्र जोखिम के दौरान बनाए रखा जा सकता है । इस विधि दोनों तरल छोटी बूंद और ठोस कण आधारित एयरोसौल्ज़ के लिए उपयुक्त है और सेल संस्कृति आवेषण में ४० एनएम और ८०० एनएम के बीच कणों जमा करने के लिए दिखाया गया है । pivec की बहुमुखी प्रतिभा इस विधि जैविक अंतिमबिंदु की एक किस्म के साथ कई सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों की संबद्धता के रूप में आवरण पृष्ठ पर दिखाया गया है । लेखकों को आर्थिक रूप से वर्जीनिया राष्ट्रमंडल विश्वविद्यालय, जहां काम रिचमंड, VA में पूरा किया गया द्वारा समर्थित हैं । लेखकों के लेखन और इस पत्र की सामग्री के लिए एकमात्र जिंमेदारी है । लेखकों की घोषणा है कि कोई प्रतिस्पर्धा हितों रहे हैं ।

Acknowledgments

लेखक बोइस solomonov और वर्जीनिया राष्ट्रमंडल नवाचार मशीन की दुकान के लिए तेजी से प्रोटोटाइप उपकरण के साथ मदद के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । लेखकों को भी क्रिस्टियन romero-lewinski समूह के fuentes शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, डॉ vitaliy avrutin, डॉ दिमित्री pestov, और वर्जीनिया राष्ट्रमंडल नैनोमेट्रिक मुख्य लक्षण वर्णन सुविधा के कण लक्षण वर्णन के साथ उनकी मदद के लिए । यह कार्य वर्जीनिया राष्ट्रमंडल विश्वविद्यालय में कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग द्वारा डॉ लेविंस्की को प्रदान किए गए स्टार्टअप फंडों द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

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Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

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