Summary
المدعومة من الصلبة، خالية من البروتين، وضعف فسفوليبيد بلير الأغشية (دلبم) يمكن أن تتحول إلى شبكات أنابيب نانوية معقدة ودينامية في الدهون ويمكن أن تكون بمثابة 2D نماذج ينطلق من هيولى.
Abstract
نحن نقدم طريقة ملائمة لتشكيل نموذج عضية هيكلية التصاعدي هيولى (ER). النموذج يتكون من الأنابيب النانوية ليبيديك العالية الكثافة التي، من حيث التشكل وديناميات، تذكرنا ER. الشبكات مستمدة من بلير مزدوجة فسفوليبيد غشاء بقع التمسك شفافة Al2O3 الركازة. هو وساطة الالتصاق من Ca2 + في المخزن المؤقت المحيطة. يتسبب نضوب اللاحقة من Ca2 + عن طريق باتا/يدتا انكماش الغشاء، أسفر عن تشكيل شبكة أنابيب نانوية الدهن عفوية. الأسلوب فقط تضم فوسفوليبيدات والأسطح ميكروفابريكاتيد لتشكيل نموذج ER بسيطة ولا تتطلب إضافة البروتينات أو الطاقة الكيميائية (مثلاً، أنشئ أو ATP). على النقيض من مورفولوجية 3D هيولى الخلوية، هذا النموذج ثنائي الأبعاد (وأن كان يتم الاحتفاظ بإبعاد أنبوب نانوي، والهندسة، وهيكل، وديناميات). هذا نموذج فريد من نوعه في المختبر ER تتكون من عدد قليل من العناصر، من السهل بناء، ويمكن أن يلاحظ تحت مجهر خفيفة. يمكن أن يكون هيكل الناتج زينت المزيد للحصول على وظائف إضافية, مثل إضافة البروتينات المرتبطة ER أو الجسيمات دراسة الظواهر النقل بين الأنابيب. الشبكات الاصطناعية الموصوفة هنا هي النماذج الهيكلية المناسبة للخلوي ER، مورفولوجيا المميزة الفريدة التي أثبتت أن تكون متصلة بوظيفتها البيولوجية، بينما التفاصيل المتعلقة بتشكيل المجال أنبوبي و ترتيبات جديدة داخل ما زالت لا تماما مفهومة. ونلاحظ أن هذا الأسلوب يستخدم ال2س3 مجهرية رقيقة الفيلم المغلفة كوفيرسليبس، التي هي متوفرة تجارياً وإنما تتطلب الأوامر الخاصة. ولذلك، فمن المستحسن أن يكون الوصول إلى مرفق ميكروفابريكيشن لإعداد.
Introduction
لائحة يضطلع بمهام حاسمة في الخلية البيولوجية بما في ذلك طي البروتين والدهون التوليف والكالسيوم اللائحة1،2. مورفولوجيا ER متأصل للمهام التي يؤديها. فهو يجمع بين رصات مستو والمجالات أنبوبي كثيفة الدينامية، التي تتفاعل مع سيتوسكيليتون باستمرار والخضوع لحركة مستمرة وإعادة ترتيب. وتشمل بعض يعيد البناء أن الخضوع لهياكل ER التحول المستمر بين أوراق مستو وأنابيب، وتكوين حويصلة من أو الانصهار التجويف ER، واستطالة الأنابيب الموجودة من قبل وسحب الأنبوب، والانصهار، والكسر3. هيكل غريب من شبكات أنبوبي نشاط غير المواتية. المسارات والآليات التي لائحة ينشئ ويحافظ على هذه المنظمة، وكذلك كيفية هذا يتعلق بوظيفتها ليست يفهم تماما4،5.
ومن المعروف أن لائحة الأعطال عند فإنه يفقد حالته التماثل الساكن، أسفر عن الإجهاد ER، شرط الناجمة عن زيادة في البروتين، وتراكم البروتينات تجمعات، أو التغيرات في توازن الأكسدة و Ca2 + . ER الإجهاد بدوره يسبب تشوه مورفولوجيا الطبيعية من عضية، على وجه التحديد مزعجة على شبكة المنظمة6،7. واستجابة، ينشط الخلية إليه إصلاح العودة إلى حالة التماثل الساكن. يمكن أن يؤدي الفشل في إصلاح إلى الخلية التي يسببها ER المبرمج، مما يسهم في العديد من الأمراض الأيضية والتنكسية مثل مرض الزهايمر ومرض السكري من النوع 2 ومرض باركنسون، والتصلب العضلي الجانبي وآخرون7، 8. البحث الحالي يستهدف تنظيم شبكات ER أنبوبي، وتركز العديد من الدراسات على تشكيل لائحة في المختبر2. القائمة بضعة نماذج2،،من910 تتطلب البروتينات الشروع والحفاظ على غشاء انحناء3،11 ومساعدة عضية التوصل إلى شكله. ومن الواضح أن النظم النموذجية التي تعكس بعض السمات الهيكلية والتنظيمية الرئيسية للائحة، وتوفير الوصول إلى الدراسات التجريبية المتقدمة كبيرة في الطلب.
نحن الحاضرين هنا الإجراءات لإعداد سهلة، خالية من الطاقة والحيوية في المختبر البروتين/الكيميائية نموذجا للائحة، توفير منصة أساسية لدراسة مورفولوجيا ER والمهام المرتبطة بها4. في هذا الأسلوب، يتم ملفقة نموذج ER مع اتباع نهج تصاعدي باستخدام عدد قليل من العناصر، التي يمكن أن تكون متكاملة الجزيئات ذات الاهتمام لإضافة تعقيد. وتمثل الشبكة ER بنية وديناميات. وعلاوة على ذلك، عكسها التحويل بين الغشاء مستو والأنابيب، تكوين حويصلة من أنابيب والانصهار الأنبوبة، انزلاق وتراجع يمكن كل ملاحظة. بالإضافة إلى العمل كنموذج التصاعدي للائحة الخلوية مفهومة، يمكن أن يكون الطريق دهني إلى شبكات أنابيب نانوية الموصوفة في هذا البروتوكول المنطبقة للباحثين دراسة التجميع الذاتي، نانوفلويديكس، وجزيء واحد والغروانيه الظواهر النقل وتدفق Marangoni، وسائر الميادين ذات الصلة. اللبنات فقط الجزيئية المستخدمة في أسلوبنا فوسفوليبيدات. البروتوكول يتطلب العمل المخبري القليل والمعدات الأساسية والوصول لإدراج العناصر الإضافية.
Protocol
1-إعداد تعليق حويصلة فسفوليبيد
ملاحظة: لجميع المواد المشار إليها ك "النظيفة" في هذا البروتوكول، دقة غسلها بالكحول تليها المياه. وتسريحه لهم مع النيتروجين. لاحظ أنه لا يمكن إجراء أج ركائز الزجاج مع المؤكسدة بشدة وكلاء الحمضية (حل البيرانا)، التي تطبق عادة في إعداد بروتوكولات للأفلام الدهن معتمدة على ركائز متينة، على ال2س3-المغلفة الناقلين.
- مكان في قارورة زجاجية مستديرة القاع أو مقلوب على شكل كمثرى نظيفة 10 مل: الكولين الفوسفاتيديل (PC، 69% w/w) و 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (المخدر، 30% w/w) fluorophore مترافق الدهن الاختيار [مثل "تكساس الأحمر" 1، 2-الصويا L-α تريثيلامونيوم ديهيكساديكانويل-sn-جليسيرو-3-فوسفوثانولاميني الملح (TR-دبي، 1% w/w)] في كلوروفورم؛ مبلغ إجمالي من 3000 ميكروغرام الدهون في 300 ميليلتر من كلوروفورم، أدى إلى تركيز نهائي 10 ملغ/مل.
ملاحظة: استخدم نظيفة، الزجاج، والمحاقن الغاز مع بلونجيرس تترافلوروايثيلين عند التعامل مع المركبات التي تحتوي على كلوروفورم.
تنبيه: كلوروفورم السامة ومتقلبة للغاية وينبغي دائماً التعامل معها تحت غطاء دخان مع المعدات الواقية الشخصية المرتبطة بها. - الاتصال قارورة مبخر دوراني، الموقف مع ميل 45 °، وتدوير 24 لفة في الدقيقة داخل حمام مائي في 23 درجة مئوية ح 6 مع ضغط الهواء انخفاض ببطء وإزالتها تماما في كلوروفورم. البدء في تخفيض الضغط حق بعد الشروع التناوب بالخطوات من 20 كيلوباسكال كل 2 دقيقة حتى تصل إلى 20 كيلو باسكال (150 ميلليمتر زئبق، فراغ 80%).
ملاحظة: تشكيل فيلم الدهن متجانسة من سمك موحد في إعداد السفينة هو أهم شرط لإجراء روتافاب. التحضيرات الدهنية تكون حساسة لقيمة الضغط النهائي؛ وتغيرات الضغط السريع وسرعة دوران ولذلك، دقة اتبع خطوات التخفيض البطيء، فضلا عن سرعة الضغط وتناوب نهاية. ضع قارورة مع ميل 45 ° لضمان أن الكعكة المجففة الدهون تتشكل بالتساوي كفيلم على جدار قارورة. سريع جداً لدوران يؤدي يؤدي إلى تثربولنسس وبطيئة للغاية التناوب (بسبب الجاذبية) إلى تراكم طبقة سميكة من السائل في الجزء السفلي قارورة. خلال الليلة الماضية اللاحقة تورم العملية، دهن غيرمتجانس جداً ينتج الكتلة التي لا تستجيب جيدا للخطوة النهائية سونيكيشن، والكسور الناتجة من تركيبات مختلفة. الضغط والوقت ضمن النطاق المحدد في الأسلوب يضمن ديسولفيشن بطيئة. مع كلوروفورم المذيب، أيضا يبرد السريعة لانخفاض في ضغط المخلوط، مما أدى إلى زيادة اللزوجة وتشكيل الأفلام التجميعية وغير متكافئ. ينصح بفترة زمنية طويلة من ح 6 بغية إزالة المذيبات إلى أقصى حد ممكن، كأقسام المذيبات العضوية في المواد الدهنية عند الإماهة. - بعد ح 6، تتوقف عن الدوران وزيادة ضغط الهواء مرة أخرى، تدريجيا، باتخاذ خطوات للجيش الشعبي الكوري 20 كل 2 دقيقة حتى وصلت إلى 100 كيلو باسكال. إزالة قارورة من مبخر دوراني وأضف 3 مل من برنامج تلفزيوني و 30 ميليلتر من الجلسرين. بلطف دوامة قارورة حل الجلسرين. استخدام سداده زجاجية الغلق لختم قارورة تحتوي على الدهون.
ملاحظة: والغليسيرول يستخدم لمنع الجفاف الكامل للفيلم الدهن وتمكن بلير الفصل12. ينبغي أن تكون ساخنة قبل استخدامها لتقليل اللزوجة لها، مما يسهل التعامل مع هذا المركب. لا تزال لا فورا مزيج والغليسيرول دافئة مع المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني. دوامات لطيف مطلوب حتى يذوب تماما الجلسرين. - تخزين في قارورة في الثلاجة على 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها الإماهة وتورم من الأفلام الدهن.
- اليوم التالي، sonicate الدهون مع حمام الماء بالموجات فوق الصوتية في درجة حرارة الغرفة (RT، ~ 21 درجة مئوية) وعند تردد 35 كيلو هرتز حتى تحقيق وقف دهن موحدة، وعكر قليلاً.
ملاحظة: يمكن أن يستغرق سونيكيشن حوالي 10-30 س. سونيكيشن المطول (~ 1 دقيقة) وتنتج الحرارة وتضر بتكوين حويصلة. - خطوات الغلة 1.1-1.5 تعليق يتضمن نوعين من الهياكل حويصلية: الحويصلات مولتيلاميلار (ملف) وحويصلات أونيلاميلار العملاقة (جيوف) (الشكل 1أ-1F).
- للتخزين، وتقسيم تعليق المادة الدهنية إلى 100 ميليلتر مختبرين، استخدام ما مجموعة 30 ميكروسينتريفوجي الأنابيب، وتخزينها في ثلاجة في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: الفلاش التجميد بالنيتروجين السائل غير الضرورية وعدم استخدامها من قبل التخزين. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ترك تعليق المادة الدهنية في الثلاجة 4 درجة مئوية للأوقات تحلل الدهن الأسباب لفترات طويلة، مما يؤثر على تكوين غشاء.
2-إعداد ركائز
ملاحظة: يتم تنفيذ البروتوكول التالية في تنظيم تصنف 8 إيزو في المواصفة القياسية ISO 14644-1. ترسيب طبقة الذرية (المدة) يستخدم لاختلاق Al2O3 ركائز. معلمات العملية المحددة تعتمد على الصك وقد تختلف بين نماذج مختلفة من المعدات. يمكن استخدامها كمعلمات الأولية لتطوير هذه العملية.
- ضبط درجة حرارة المفاعل التعيينات المحددة المدة إلى 200 درجة مئوية.
- تحميل الواجهات الزجاجية (مثلاً، كوفيرسليبس الزجاج) في قاعة عينة جنبا إلى جنب مع رقاقة سيليكون، التي ستستخدم في وقت لاحق كسطح مرجعي لتحديد سمك الترسب ellipsometry.
ملاحظة: ركائز الزجاج المستخدمة----المضمنة وليست تنظيف المذيبات قبل الترسيب. إلا أنها كانت مسح مع غاز النيتروجين لإزالة الجسيمات. - إخلاء قاعة التحميل إلى 400 السلطة الفلسطينية (3 ميلليمتر زئبق) ونقل العينات إلى دائرة رد الفعل الرئيسي، وإجلاء 200 من السلطة الفلسطينية.
ملاحظة: يجب الحفاظ على درجة حرارة المفاعل في 200 درجة مئوية لترسب السليم. تقلبات درجة الحرارة بعد تحميل عينة ولذلك يجب أن تكون اكويليبراتيد قبل البدء الترسب. تم تعيين ضغط دائرة أعلى من ضغط المفاعل لتجنب أي السلائف في الانتشار خارج الدائرة. - بدء إيداع أفلام الذري. تتألف دورة واحدة من التعرض الألومنيوم trimethyl النبض 150 مرض التصلب العصبي المتعدد، متبوعاً تطهير s 1، وفي وقت لاحق، على تعرض2س ح لمدة 200 مرض التصلب العصبي المتعدد متبوعة تصريف ق 1.
ملاحظة: كافة الإعدادات بما في ذلك ضغط الدائرة والمفاعل، طول دورات، وعمليات التطهير الآلي إلى تحقيق معرفة معدل الترسيب. قد تختلف هذه المعلمات بين نماذج مختلفة من المعدات. وصفات قبل تكوينها غالباً ما أعدته المورد أو أداة المسؤول في غرفة نظيفة وإبلاغ المستخدم كسمك الفيلم المودعة لكل وحدة وقت. - للوصول إلى 10 نانومتر Al2O3 على الركازة، كرر العملية لدورات 100. يعتمد عدد دورات على معدل الترسيب، التي قد تختلف بين وصفات مختلفة أو المعدات.
- لإزالة العينات من المفاعل، المنافس الأول الدائرة حتى يصل الضغط إلى الضغط الجوي، ثم إزالة العينات.
- تخزين العينات في حاويات جوية مشددة على RT حتى الاستخدام.
ملاحظة: لا مزيد التنظيف ينصح قبل الاستخدام. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
ملاحظة: من الناحية المثالية ينبغي أن تستخدم العينات فورا بعد الترسيب. ويتطلب التخزين الأمثل المواقع السطوح داخل شركات البولي بروبلين ويفر، تليها تخيم الناقلين في أكياس بلاستيكية المتوافقة مع غرفة نظيفة، التي تكون النيتروجين مسح قبل فراغ الختم. والغرض تجنب تعريض السطح للملوثات المحمولة جوا. إذا لزم الأمر، يمكن الاحتفاظ الأسطح في حاويات جوية مشددة في الرايت كحد أقصى لمدة 5 أيام. لا ينصح بتخزين أطول. للمستخدمين الذين لا يستطيعون الوصول بسهولة إلى غرفة نظيفة القريبة، وشراء أو الحصول على السطوح من الخارج، قد تكون إعادة المؤكسدة ركائز عن طريق العلاج الأوكسجين في البلازما أو الأوزون حل بديل13.
3-تحويل الأفلام فسفوليبيد الجزيئية لشبكات أنبوبي
- ذوبان الجليد بتعليق المادة الدهنية ونقل 4 معالجة تجميعية ميليلتر من تعليق على شريحة مجهر زجاج نظيفة/ساترة.
- ديسيككاتي الحبرية لمدة 20 دقيقة. سوف تنهار الحبرية في فيلم مسطحة دائرية من الدهون بعد جفاف، والذي يكون مرئياً للعين.
- ترطيب الفيلم الدهن مع 1 مل من حبيس المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: حجم المخزن المؤقت الإماهة يؤثر على كثافة تعليق حويصلة (عدد حويصلات كل وحدة التخزين)، التي يتم بعد ذلك نقل إلى دائرة المراقبة. اعتماداً على حجم دائرة المراقبة وكثافة حويصلة المرجوة، حجم الإماهة يمكن ضبطها إلى 0.5-1 مل. شرائح البورسليكات النظيفة تميل إلى دعم قطرات من عدة مئات من ميكروليتيرس يصل إلى 1.5 مل دون مشاكل. منذ ساترة لا تحتاج إلى نقلها، وهذا لا يؤدي إلى مشكلة فنية. على الأسطح مسعور أكثر، مثل الشرائح المغلفة البوليمر سو-8، يمكن حتى 1.5 مل المودعة12.
ملاحظة: الدهون ينبغي أن يكون طازج، كما تعرض الفيلم امهاء الدهني لأكثر من 20 دقيقة في الرايت يؤدي إلى التبخر من المخزن المؤقت والجفاف الجزئي للحويصلات ريهيدراتيد سابقا، الأمر الذي يؤدي إلى سوء تحديد تكوين. - إعداد غرفة المراقبة: السماح ل exchange المخزن المؤقت عن طريق ماصة تلقائية، التي تلزم لبدء تحويل ER، استخدمت تشكيل غرفة مراقبة مع كبار مفتوحة. هذه الدائرة تتألف من إطار بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) مع أبعاد 1.5 × 1.5 × 0.5 سم، انضمت إلى ساترة3 أودعت2س ال. ويمثل مخطط دائرة المراقبة المحملة في الشكل 1ز. تم تنفيذ الخطوات التالية افتعال الإطار PDMS والتجمع في دائرة المراقبة:
- تعد حلاً كوه بمزج 100 غرام كوه مع 100 مل الكحول في كوب في حمام الثلج. ضجة ح 10 أو أكثر حتى يذوب في كوه تماما استخدام محرض المغناطيسية ولوحة إثارة المغناطيسية.
تنبيه: كوه الحل هو التآكل ويمكن أن يؤدي إلى حروق الجلد، وذلك دائماً في التعامل مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
ملاحظة: أن القابلية لذوبان كوه في الايزوبروبانول ليس مرتفعا كما هو الحال في المياه. الحل طارد. من المستحسن سحق الكريات كوه قبل تذويب والتحريك المستمر. - غمر كوب طبق بتري (د = 6 سم) إلى الحل كوه في الرايت وإبقاء الليلة الماضية.
- في اليوم التالي، إزالة الطبق الزجاج من الحل وتزج أنه في حاوية مع المياه لمدة 5 دقائق وشطفه عدة مرات بالماء ووضعه داخل فرن تجفيف عند 80 درجة مئوية حاء 1 ضربة السطح بإيجاز مع تيار نيتروجين لضمان ذلك الجزء تتم إزالة إيكلس.
- تخميل السطح والحيلولة دون ارتباط إلى PDMS، ونقل 200 ميليلتر من ديميثيلديتشلوروسيلاني مع المحاقن بلاستيكية في وعاء بلاستيك نظيفة مثل قارب ترجيح.
- تخزين الزجاج طبق بيتري جنبا إلى جنب مع سيلاني ح 1 في مجففة تم إخلاؤها (فراغ منخفضة، ~ 20 كيلو باسكال).
تنبيه: ديميثيلديتشلوروسيلاني السامة وينبغي دائماً التعامل معها تحت غطاء دخان مع المعدات الواقية الشخصية المرتبطة بها. - الانتظار 15 دقيقة قبل جمع طبق بيتري في الترتيب للبخار ديميثيلديتشلوروسيلاني المتبقية تبديد. طبق بيتري الآن سيلانيزيد، وعلى سطح الماء.
ملاحظة: طريقة سريعة لاختبار نجاح هذه الخطوة وضع معالجة مياه تجميعية على سيلانيزيد طبق بيتري. يجب زيادة زاوية الاتصال الحبرية مع السطح واضح مقارنة بالزجاج غير المعالجة. - في حاوية بلاستيك 250 مل (كأس جديدة من الحزمة بلاستيكية شفافة)، يخلط 10 غم من سيليكون الاستومر قاعدة ز 1 سيليكون الاستومر علاج عامل (10:1). يحرك باستخدام ملعقة بلاستيكية محرض/بلاستيك لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يتم تشكيل فقاعات الهواء عند التحريك، وسوف ننظر PDMS بالي-أبيض. - ديسيككاتي الخليط ديغا في الجيش الشعبي الكوري < 20 حتى انهارت جميع فقاعات الهواء الآخذة في التوسع (فراغ أعلى يسرع العملية). صب الخليط ديجاسيد في سيلانيزيد طبق بيتري.
- علاج عند 65 درجة مئوية ح 2 في فرن.
ملاحظة: من الممكن مضاعفة سرعة المعالجة عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى > 95 درجة مئوية. درجة حرارة التجفيف المتزايد يؤدي إلى زيادة في صلابة المواد. - يبرد الطبق بيتري مليئة PDMS شُفي إلى RT وإزالة لوح PDMS مع ملعقة.
- مع مشرط، قص الإطار في الهندسة والأبعاد المناسبة لفتح المتاحة في مرحلة مجهر. أبعاد 1.5 (طول) × 1.5 (العرض) × 0.5 سم (ارتفاع) مناسبة لمعظم الأجهزة.
- جلب الجانب السلس (الجانب السفلي التي كانت على اتصال بطبق بيتري) PDMS الإطار اتصال مع الجانب النشط السطح حيث يتواجد Al2O3 الفيلم، والضغط بلطف دفع الإطار والسطحي ضد بعضها البعض لجعلها تنضم.
ملاحظة: الالتصاق بين الإطار PDMS وال2س3 الركيزة ضعيف. قد يتسبب وجود فقاعات الهواء في واجهة الاتصال مرفق دي، ومن ثم تسرب المخزن المؤقت والمحتويات ذات الصلة. يمكن استخدام الإطار PDMS عدة مرات إذا فورا بعد وقبل كل استخدام فإنه يتم شطفها بالكحول، تليها الشطف بماء دي وبلوودريينج مع النيتروجين. يمكن أيضا إعادة استخدام سيلانيزيد طبق بيتري.
- تعد حلاً كوه بمزج 100 غرام كوه مع 100 مل الكحول في كوب في حمام الثلج. ضجة ح 10 أو أكثر حتى يذوب في كوه تماما استخدام محرض المغناطيسية ولوحة إثارة المغناطيسية.
- ملء قاعة المراقبة مع Ca2 +-حبيس المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: يجب استخدام السطح مباشرة بعد إعلان الصفقة. الاتصال مع الهواء يؤدي إلى امتزاز الملوثات، مما يقلل من نشاط على السطح تدريجيا. ينبغي أن تملأ قاعة بالمخزن المؤقت مباشرة بعد الجمعية العامة. عدم ملء حجم دائرة كاملة للسماح بإضافة الدهون ريهيدراتيد في الخطوة التالية. - ضع الدائرة على خشبة المسرح مجهر [كنفوكل]. نقل المواد الدهنية امهاء، الآن تعليق يحتوي على حويصلات العملاقة، في الدائرة مع بلاستيك ماصة باستور (الشكل 1أ-1 ز).
- انتظر 10-20 دقيقة للسماح للحويصلات التقيد على الركازة، وتنتشر عبر السطح (الشكل 1ح-1J).
ملاحظة: نشر يبدأ فورا بعد ترسب الدهون على السطح. معدل الانتشار قد تختلف قليلاً تبعاً لتكوين الدهون، Al2O3 ترسب تقنية (ADL، ترسب بخار اﻷخرق الترددات اللاسلكية، والمواد الكيميائية، إلخ)، نضارة من الركازة، وتركيز الأيونات الموجبة ديفالينت في المخزن المؤقت. ضمان أن يتم تنفيذ تبادل المخزن المؤقت قبل أن يمزق انتشار بقع14. - بعد مراقبة إزالة عدة حيزات الدهن، ببطء العازلة المحيطة عن طريق ماصة تلقائي، مثل أن يبقى فقط فيلما عازلة رقيقة في الجزء السفلي.
ملاحظة: الإزالة السريعة للمخزن المؤقت إزعاجا هياكل الدهن على السطح. - الشروع في تبادل العازلة المحيطة بملء في دائرة المراقبة ببطء مع تشيلاتور-حبيس المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) باستخدام ماصة تلقائي (الشكل 1ك).
ملاحظة: إضافة المفاجئ من المخزن المؤقت إزعاجا هياكل الدهن على السطح. - تؤدي هذه الخطوة النهائية شبكات نانوتوبولار الحيوية، وتشكلت نتيجة لفعل تشيلاتور ديبينينج وسحب دلبم إلى ملف4 (الشكل 1لتر-1Y).
4-الملاحظة الفحص المجهري
- الحصول على الصور بليزر مقلوب المسح مجهر [كنفوكل] استخدام 40 × الهدف الغمر النفط (1.3 غ) مع تردد المسح ضوئي لتوظيف 400 هرتز. مصدر ليزر ضوء أبيض لإثارة "دبي الأحمر تكساس" في 595 نانومتر. جمع الانبعاثات من 605 إلى 700 نانومتر باستخدام جهاز كشف فوتون هجين.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، مجهر برنامج التحصين الموسع-الأسفار يمكن استخدامها للتصوير. اعتماداً على مصادر الضوء المتوفرة، حدد المتقارن صبغ دهن مناسب.
Representative Results
تعليق المادة الدهنية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1 من البروتوكول والمستخدمة في التجارب التي تحتوي على نوعين رئيسيين من حويصلات: ملفس وجوفس. الشكل 1 أ-1F يظهر ليزر المسح ميكروجرافس [كنفوكل] من الحويصلات في العينة الأولى التي شيدت في 3D. الشكل 1 ويبين A-1_C ملف (إيداع الدهنية) في xyz و xz yz الطائرات، على التوالي. الشكل 1 د-1F يوضح آراء مماثلة حويصلة أونيلاميلار العملاقة (جيوف). الجزء الداخلي من جوفس، التي تفتقر إلى مولتيلاميلاريتي، أجوف؛ ومن ثم فالمواد الدهنية لنشر محدودة إلى حد كبير. ولذلك، الخزانات الدهون مفيدة فقط لهذا الأسلوب هي ملفس.
عندما يتم نقل تعليق المادة الدهنية إلى دائرة المراقبة تتضمن Ca2 +-هيبيس المخزن المؤقت (الشكل 1ز)، بدء ملفس (الشكل 1A-1_C) ليستقر على السطح3 2س ال. عند الاتصال، الحويصلات تنضم إلى السطح، ويبدأ غشاء بلير دهن شقة مزدوجة دائرية (دلبم) لنشر من كل ملف على دعم الصلبة (الشكل 1ح-1J). ملف يعمل كخزان ينص الدهون دلبم الآخذة في الاتساع باستمرار. الغشاء القاصي بلير (العلوي)، وفيما يتعلق بدعم متين، متصل بالغشاء بلير الدانية (السفلي) على طول محيط الحافة الدائرية، تنفيذ اقتراح متداول (الشكل 1أنا). يتم وضع بليرس اثنين رفضا قاطعا فوق بعضها البعض، وجود سوى طبقة رقيقة سائلة مغلفة بينهما. أثناء نشر، تتمسك الغشاء الدانية باستمرار إلى السطح التأييد تحتها، بينما يتم سحبها الغشاء القاصي أفقياً عند الحواف على حافة الغشاء الدانية الآخذة في التوسع. نشر دلبم هو وساطة من Ca2 +، الذي يعمل بمثابة عامل فوسوجينيك بين المجموعات دهن الرأس من الغشاء الدانية والركيزة الصلبة4.
وإذا استمر انتشار لفترات طويلة، التوتر الغشاء الزيادات، مما أدى إلى تمزق (الشكل 2ألف و 2 باء). بعد هذه النقطة، يمكن لم يعد الناجمة عن انكماش الغشاء، هو أمر ضروري لخلق مورفولوجية أنبوبي ER. ولذلك، من المهم أن نعترف تمزق الأغشية. حيث يتم فلوريسسينتلي المسمى الدهون في تجاربنا، يمزق يمكن مباشرة ملاحظة. مؤشر رئيسي لتمزيق هو الانخفاض الكبير في كثافة fluorescence في تمزق المنطقة (الشكل 2ألف و 2 باء)14. يمزق نتيجة لزيادة التوتر وتشكيل المسام اللاحقة في غشاء البعيدة. المناطق التي تمزق تحت مجهر فلوري، ولذلك يحمل نصف كثافة الانبعاثات (بلير الدانية واحد) من مناطق المستقرات (بلير مزدوجة)14 (الشكل 2ب). أثناء تشكيل المسام، ترحيل مواد الغشاء، الذي كان في البداية المتمركزة في المناطق التي تمزق، إلى حواف نشر التصحيح. يؤدي هذا بدوره نمو منطقة التصحيح الشامل. ولذلك، يمكن أيضا ملاحظة توسع سريع في كفاف التصحيح دائرية أثناء يمزق.
لتجنب نمو واسع النطاق مما أدى إلى تمزق البقع، فورا بعد منطقة التصحيح دائرية تصل إلى 100-200 ميكرون، تتم إزالة Ca2 +-حبيس المخزن المؤقت بلطف مع ماصة تلقائي حتى طبقة رقيقة من بقايا السائل على السطح. ثم يتم إضافة المخزن المؤقت تشيلاتور-حبيس بلطف إلى الدائرة الشروع في سحب (الشكل 1ك). جفاف كامل للعينة (الشكل 2ج) أو التبادل السريع للمخازن المؤقتة (الشكل 2د و 2E) يسبب اضطرابات أو تمزيق أو تشوه بقع. إضافة chelators تدريجيا يزيل Ca2 + من المسافة بين المياه السطحية والغشاء. المخزن المؤقت تشيلاتور-هيبيس يصل تدريجيا إلى الفضاء فيما بعد الركيزة bilayer، بدءاً من محيط التصحيح الغشاء الدهني. ولذلك، يبدأ من حواف دائرية التصحيح إزالة مواقع التثبيت وتنتشر إلى الداخل (الشكل 1ك-1Q). نتيجة ديبينينج، يبدأ الغشاء الدهني في فصل وسحب من الداخل الحواف، تتقدم نحو ملف في المركز. تؤدي عملية سحب إلى واجهة جديدة لتطوير شبكات أنبوبي lipidic4 (الشكل 1لتر-1Y) بشكل حيوي. المناطق المستمرة للتثبيت، التي لا تسمح للغشاء لفصل تماما، تبقى على جدولة السطحية ونوكليتي، مما يؤدي إلى شبكة متفرعة طويلة من الأنابيب النانوية. (الشكل 1لتر-1Y). ولوحظت تعلق الرفع المستمر، وكذلك سحب الأنابيب النانوية الدهن مع مرور الزمن نتيجة عملية تدريجية الخلبية. هذا كوارسينينج وإعادة ترتيب فروع الشبكة دوراً رئيسيا في السلوك الديناميكي للشبكات أنبوبي، التي تشبه لائحة السلس.
الشكل 1 لام-1Y يظهر ميكروجرافس من أنبوب نانوي الشبكات التي تم الحصول عليها في البروتوكول. الشكل 1 L ملحوظ عن قرب المنطقة في الشكل 1م في إطار أبيض. المناطق مشرق الأحمر مستمرة في الشكل 1لتر و 1 م هي الكسر التراجع من دلبم (ملحوظ مع خط متقطع أزرق في الشكل 1م). صورة مجهرية لشبكة أنبوبية الشكل 1ن و 1O هو مقلوب لزيادة التباين. الشكل 1 P و 1Q يصور الحد كثافة أنبوبي في منطقة غشاء على مدى 3 ساعات و 20 دقيقة. انخفاض كثافة أنبوبي يحدث بسبب ديبينينج تدريجي يتبعه تراجع دلبم من على سطح الأرض خلال الفترة التجريبية. مع مرور الوقت، العدد من النقاط التي تحررت من تعلق الزيادات، مما يؤدي إلى ترتيبات جديدة وتخفيض المساحة المشمولة بأنابيب (الشكل 1ف و 1Q). يرجع سببها ترتيبات جديدة أنبوبي تدنية الطاقة الحرة السطحية أنبوب نانوي الدهن علقت بين اثنين من النقاط الثابتة. أنها راسخة أن الطريقة الأكثر فعالية لتقليل الطاقة السطحية من أنبوب نانوي الحد طول15. ولذلك، عند إزالة المثبتة منطقتي فوسوجينيك، الذي عقد في البداية الأنابيب النانوية على السطح،، الأنابيب النانوية الشريحة وترتيب نفسها عفويا، اعتماد على طول الحد أدنى. تتسبب هذه ترتيبات جديدة على تغطية انخفاض تدريجيا من السطح من الأنابيب النانوية (الشكل 1ف و 1Q).
ونحن لا يمكن تصور Ca2 +-بوساطة نقاط التثبيت، ولكن علينا إنشاء مواقعها كالنقاط التي يكون فيها أنابيب يتحول المحطة الطرفية أو حادة. المنعطفات الحادة يشار إلى الخامس-تقاطعات15 أو نقاط التحول بسبب التحول المفاجئ في اتجاه المحاذاة أنبوب (الأسهم الخضراء في الشكل 1R و 1 X). ويمثل نقطة النهاية محطة الأنبوب، مما يحول دون التراجع (الأسهم البرتقالي في الشكل 1X) الأنبوب. وخلال عملية إعادة تنظيم، التصرف نشاط مواتي من الأنابيب التي اعتبرت "Y-تقاطعات" أو "3-طريقة تقاطعات"، تظهر. Y-التقاطع يربط ثلاثة أنابيب مع حوالي 120° الزوايا بين كل أنبوبة، حيث يمكن تأمين طول أنبوب مجموع أقصر. ذ-الوصلات، التي لا تملك نقطة نهاية، وبدلاً من ذلك يتم وضعه بين الأنابيب النانوية متعددة، هي غير مثبت. هذا هو نوع Y-مفرق الوحيدة التي يمكن أن تؤدي إلى انزلاق (الأسهم الزرقاء، الشكل 1R). كما هو مبين في الشكل 1R و 1S، ينحدر من Y-تقاطع على طول نتائج تقاطع غير مستقرة جداً في تشكيل الفردية اثنان تقاطعات Y (الأسهم الزرقاء في الشكل 1S). يمثل خط أبيض متقطع فرضه على الشكل 1S كفاف الجزء شبكة أنبوبية في الشكل 1R. جزء صغير من Y-الوصلات تمتلك محطات نهاية (السهم الأصفر في الشكل 1تي) الذي، على مر الزمن، في نهاية المطاف سحب (الشكل 1يو). تحويل الخامس-تقاطع إلى واحد، يمكن ملاحظة أنبوب مستقيم ديبينينج من نقطة التقاطع لأجزاء الخط اثنين، وسحب أحد أنابيب تشكيل الشكل الخامس في الشكل 1V و 1 وات و الشكل 1X و 1Y، على التوالي.
الشكل 1 : تحويل الدهون الودائع للشبكات مثل ER أنبوبي. (واو) ليزر المسح ميكروجرافس [كنفوكل] من الحويصلات في العينة الأولى، التي شيدت في 3D. (أ-ج) دهن مولتيلاميلار حويصلة (ملف، إيداع الدهنية) في xyz و xz yz طائرات، على التوالي. (د-و) آراء مماثلة لحويصلة أونيلاميلار العملاقة (جيوف). الجزء الداخلي من جوفس جوفاء، مما يجعل المواد الدهنية لنشر محدودة إلى حد كبير. خزانات الدهون مفيدة لهذا الأسلوب هي بالتالي ملفس-(ز) شكل توضيحي لدائرة المراقبة التي شنت على مجهر مقلوب التي تودع في المخزن المؤقت والدهون. تتألف الدائرة من PDMS الإطار انضمت إلى ساترة3 المغلفة2س ال، توفير أعلى المجلد مفتوح. (ح-ي) رسم توضيحي لظاهرة انتشار ملف حضور Ca2 +. (ح) عند الاتصال مع Al2O3، ينتشر ملف تلقائياً في شكل تعميما، الدهن بلير غشاء مزدوج (دلبم). (ط) عرض الجانب التخطيطي دلبم في الطائرة xz، حيث تؤدي أطراف الاقتراح المتداول. ملف (د = 5-15 ميكرون) ودلبم (سمك = 10 نيوتن متر) لا يتم رسمها بمقياس. (ي) صورة مجهرية [كنفوكل] من دلبم نشر من عرض أعلى. (ك) يصف الخطوة الرئيسية لهذا البروتوكول، حيث يتم تبادل المخزن المؤقت إلى واحدة تحتوي على Ca2 + خالب وكلاء ويحول دون انتشار، مما تسبب في تراجع دلبم لملف ويؤدي إلى تشكيل الأنابيب النانوية الدهن. (ل-Y) ميكروجرافس من أنبوب نانوي الشبكات التي تم الحصول عليها باستخدام الأسلوب هو موضح. (ل) عن قرب المنطقة في (م) علامة في إطار. وتمثل المناطق مشرق الأحمر مستمرة في (لام وميم) دلبم (ملحوظ مع خط متقطع أزرق أيضا في م). هو عكس صورة مجهرية من شبكة أنبوبية في (N و O) زيادة التباين. (P و Q) تصوير للحد كثافة أنبوبي في منطقة غشاء على مدى 3 ح و 20 دقيقة (ص ص) الممثل ترتيبات إعادة أنبوبي. (R و S) انزلاق (T و U) الانتقال من Y-تقاطع إلى الخامس-تقاطع طريق سحب واحد نقطة النهاية، و (V و W) إزالة التثبيت من نقطة تحول، وأسفر عن القضاء على مفترق الخامس. (س وص) سحب نقطة النهاية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : نتائج سلبية محتملة. (أ وب) يمزق الغشاء البعيدة نظراً لفترة طويلة وقت الانتظار قبل الصرف من المخازن المؤقتة. مجالات تمزق، حيث يصبح الغشاء الدانية مرئية، تظهر كمناطق مظلمة بالمقارنة مع مناطق الغشاء المتمزق البعيدة. الداخلي للفريق ب يبين شدة الضوء على طول السهم الأزرق على صورة مجهرية. كثافة المناطق تمزق الغشاء (بلير الدانية مفرد يصبح مرئياً) تناظر نصف كثافة الغشاء المتمزق (بلير القاصي مزدوجة). (ج) مظهر تصحيحًا الدهن جافة تشكلت نتيجة لإزالة جميع السائل من دائرة المراقبة. (دال وهاء) اضطراب الغشاء بالتبادل السريع للمخازن المؤقتة عبر ماصة التلقائي. في (د)، قد انقسم ملف ملفس 2، مما يؤدي إلى تصحيح دهن غير دائرية، ومشوه. (ﻫ)، ينعكس نمط التدفق (الأسهم)، تم إنشاؤها بواسطة حقن قوية من المخزن المؤقت تشيلاتور-هيبيس، على هيكل غشاء توبولاتيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
في المناقشة التالية، يتم وصف الخطوات الحاسمة والتعديلات المحتملة، والقيود المفروضة على البروتوكول. الخطوة الحاسمة الأولى هو الجمعية العامة المناسبة لدائرة المراقبة، نظراً إلى أن التصاق الإطار PDMS إلى السطح3 2س بن ضعيف أصلاً. في الحالة حيث الإطار لا يتقيد بالركيزة بشكل صحيح، سوف تسرب المحتوى من دائرة المراقبة والتجربة سوف يأتي إلى توقف. العوامل الرئيسية التي تعيق مناسبة ختم سطح والإطار 1) الافتقار إلى تنظيف شامل للإطار PDMS (إعادة استخدامها) و 2) الهواء فقاعات أحياناً الحصول على شرك بين الإطار والركيزة. وينبغي استخدام إطار PDMS أعدت حديثا أو تنظيفها جيدا. يجب أن تشطف الإطار قبل وبعد كل استعمال مع الكحول، تليها الشطف بماء دي وبلوودريينج مع النيتروجين. لا تتطلب أسطح3 2س ال أي التنظيف السابقة، نظراً لأنها ملفقة في بيئة تنظيم وتحفظ في حاويات مختومة حتى الاستخدام. نظراً لطبيعة مذبذب Al2O3، فإنه ينبغي أن لا تكون عرضه للحلول بقوة الحمضية أو الأساسية. ويمكن استخدام تصاميم أخرى لدائرة المراقبة، اعتماداً على إمكانية الحصول على الإعداد الفردية. الميزات الهامة لهذه الدائرة هي حرية الوصول إلى عينة السائل من أعلى مفتوحة ويفرط المواد الإطار فيما يتعلق بالحلول المستخدمة والعينات. أبعاد الدائرة أيضا عامل هام، كما أنها ينبغي أن تستوعب كمية من 0.5 إلى 1 مل. منذ السطوح المستخدمة عادة الحجم العادي كوفيرسليبس (24 × 60 مم)، معظمها يتحدد حجم الدائرة بسمك الإطار. على حد علمنا، الفواصل مع حجم وعمق يمكن أن تستوعب أحجام العينة عادة التعامل معها في هذا البروتوكول غير متوفرة تجارياً. ولذلك خصصنا فرعا في البروتوكول للتفاصيل من تلفيق والجمعية في إطار الدائرة عينة.
أن الخطوة الحاسمة الأخرى في هذا البروتوكول هو تبادل المخزن المؤقت. تحديا في هذه الخطوة هو التوقيت اللازم لإجراء هذا التبادل. نشر ملف عند الاتصال مع Al2O3 الركيزة الفورية، والتوسع المستمر دلبم يؤدي إلى تمزيق، تنتهي التجربة (الشكل 2أ، ب). ولذلك، انتشار ينبغي أن ترصد باستمرار، وتبادل المخزن المؤقت يجب أن يتم في الوقت مناسب. لا يمكن إجراء التبادل بعد التهيئة لنشر، بغية السماح للبقع غشاء الوصول حجم أمثل (100-200 ميكرومتر في القطر) بسرعة كبيرة جداً. من ناحية أخرى، تسبب التصاق مستمر على السطح الغشاء عالية التوتر، الأمر الذي يؤدي إلى تمزيق. وهكذا، غشاء جميع بقع في نهاية المطاف تمزق إذا نشر لا تنقطع. توقيت يمزق يختلف بالنسبة لكل تصحيح، نظراً لأنها تعتمد على الحجم والهيكل الداخلي لملف وإمكانية الحصول عليها الدهون فيه. ومن ثم، ينبغي أن يرتب لحظة التبادل إلى تيميبوينت فيه بقع تمزق الأمم المتحدة مع أحجام الأمثل تمثل أغلبية السكان. تحد آخر في الخطوة exchange المخزن المؤقت هو معدل الإزالة والإضافة للمخازن المؤقتة. وقد يؤدون هذا الاستبدال السريع جداً لها تأثير ضار على هياكل غشاء النهائية (الشكل 2ج-ه). نتائج الاستخراج المفرط من Ca2 +-حبيس المخزن المؤقت دون ترك طبقة رقيقة سائلة على الركازة، في غشاء المجففة ومشوهة لا رجعة فيه بقع (الشكل 2-ج). حتى إذا كان يتم الاحتفاظ كمية مناسبة من السائل على السطح، إضافة المفاجئ من المخزن المؤقت تشيلاتور-حبيس أيضا يسبب اضطراب الهياكل الغشاء. الشكل 2 د،ه يظهر مظهر نموذجي لغشاء هيدروديناميكالي تعطل بقع. تعطيل الخصائص المورفولوجية العامة لا تؤثر بالضرورة خصائص ديناميكية الهياكل النهائية (أي ترتيبات جديدة أنبوبي في المناطق المتبقية لا تزال تحدث). بيد أنه سوف يصبح من الصعب على مراقبة التحول المادي على هياكل مشوهة. على سبيل المثال، أنه في الشكل 2د، سيكون من الصعب على تحديد الاتجاه نحو الذي يسحب ملف دلبم.
واحد إمكانية إدخال تعديل على البروتوكول هو تكوين المادة الدهنية المستخدمة. انصب التركيز الرئيسي على فوسفوليبيدات التي تهيمن على التشكيل لائحة في الثدييات والخميرة16 (ﻫ. ز.، فوسفاتيديلتشوليني (PC)، فوسفاتيديليثانولاميني (PE)، وفوسفاتيديلينوسيتول (PI). أجريت التجارب الأصلي باستخدام الكمبيوتر و PI الخلائط4. في النتائج المقدمة، تم استخدام خليط من أجهزة الكمبيوتر ومخدر وهو مشتق من PE. ومع ذلك، وجدت ليست كل الدهون التعسفي التراكيب لإنشاء هياكل أنبوبية التي تم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول. عدد قليل من الدهن التحقيق تجريبيا الخلائط الأخرى تشمل استخراج قلب مجموع وفول الصويا استخراج القطبية واستخراج كولاي القطبية، وخلائط من جهاز كمبيوتر مع stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) بنسب متفاوتة والخلائط من سيرين PC-بي-بي-بوسفاتيديل (PS) بنسب متفاوتة. منذ هياكل أنبوبية غشاء تمتلك الانحناءات عالية وتحتاج إلى ترتيب خاص لجزيئات الدهن الفردية، فمن المتوقع أن ظاهرة لوحظت هي المادة الدهنية الخاصة بالتكوين.
آخر تعديل تطبيق هذا البروتوكول هو الأسلوب لتلفيق السطحية. هنا، استخدمت المدة اختﻻق كوفيرسليبس3 المغلفة2س ال. وهذا يختلف عن الأسلوب ترسب عنها أصلاً، رد الفعل اﻷخرق4. في حين يشير هذا إلى أن أسلوب تصنيع سطحي بديل لا يزال يمكن أن يؤدي إلى توبوليشن مثل ER، يبدو قيد هام واحد خصوصية المواد السطحية. طريقة نشر وقوة الالتصاق يعتمد اعتماداً كبيرا على خصائص المواد السطحية، التي تؤثر على عوامل مثل التفاعل الالكتروستاتيكي، ويتابيليتي، هيدروفوبيسيتي، وخشونة السطح. Al2O3 الأسطح توفر قوة الالتصاق الأمثل، والأفلام الدهن سواء إرفاق بشدة بما فيه الكفاية تنتشر كغشاء بلير دهن مزدوجة وفصل لشبكات أنبوبي الشكل عند إزالة أيونات Ca2 + . اختبرنا سابقا نفس التجربة مع SiO2، التي الحويصلات مولتيلاميلار انتشرت كغشاء bilayer دهن مزدوجة، ولكن لوحظ لا تشكيل شبكة أنبوبية عند إضافة تشيلاتورس17. إزالة المرفقات وتشكيل الأنبوبة يلاحظ فقط في ال2س3 أو محفوراً البلازما ال18. كشفت تحقيقاتنا أن المعلمة المساهمة مما يؤدي إلى هذه ظاهرة زيتا المحتملة من السطوح، لل وال التي كانت2س3 قريبة من الصفر (mV) و SiO2 سلبية إلى حد كبير. إمكانات زيتا البورسليكات يشبه SiO219؛ ولذلك، التصاق الدهن أفلام عن البورسليكات نفس القدر قوية ولا رجعة فيها. في الواقع، دهن مولتيلاميلار الخزان الاتصال مع الأسطح البورسليكات عادة ما يؤدي إلى تمزق الفوري وتشكيل واحد دهن بليرس20. Al2O3 السطوح المطلوبة لهذا البروتوكول لا تتوفر سهولة أو تجارياً. ومع ذلك، يمكن أمر مخصص من مصنعي الزجاج والركيزة التخصص. ينصح بشدة إمكانية الوصول إلى مرافق تنظيم مع معدات تصنيع الأغشية الرقيقة.
الأساليب القائمة الأخرى المنطلقة اختﻻق ER-مثل شبكات أنبوبي2،10 إشراك البروتينات، فضلا عن مدخلات الطاقة الكيميائية (على سبيل المثال-، أنشئ و ATP). ذكرت رابوبورت والزملاء2 تشكيل شبكات ER على الزجاج كوفيرسليبس في المختبر بخلط البروتينات الغشاء الانحناء موجودة في أوروبا، مع فوسفوليبيدات وأنشئ. العمل الذي يقوم به باتشاند et al. 10 يبين كيف يمكن إنشاء مثل هذه الشبكات أنبوبي ديناميكية باستخدام المحركات الجزيئية و ATP كمصدر للطاقة. لا يتطلب هذا البروتوكول قدم بروتينات الغشاء أو التحلل المائي للمركبات العضوية للطاقة. المكونات الأساسية فقط هي الركيزة الصلبة وشكلها. تنقية واستخلاص البروتينات غير مطلوبة. يوفر هذا البروتوكول، فيما يتعلق ببساطة جزيئات التأسيسي، أن أبسط نموذج ER.
مع هذا الأساسية، على أساس المادة الدهنية ER نموذج المنشأة، بناء التعقيد بإضافة المكونات المرتبطة بلائحة من الاهتمام، نظراً لأنها تمكن تحقيق آثار الفردية في النظام. مشابهة لشبكات ER الفعلية، أنابيب في النموذج دينامية. التصريف إلى والهجرة من البروتينات الغشاء المسمى، أو الجسيمات الفلورية في جميع أنحاء الشبكة أنبوبي، قد تعطي معلومات عن اتجاه حركة غشاء. تغليف ورصد السوائل داخل دلبم وأنابيب الفلورسنت أثناء التحول ووضع خرائط ممكنة لنقل المحتوى إينتراتوبولار قد تخدم كنقطة تركيز أخرى. أخيرا، قد اعتمد انتقال من نموذج ER 2D الناتجة من هذا البروتوكول نحو نموذج ER سلس ثلاثي الأبعاد من خلال تغليف الشبكات في أبنية المائية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الأستاذ الدكتور الدو جيسوركا من "جامعة تشالمرز للتكنولوجيا" في السويد لتعليقاته لا تقدر بثمن في المخطوطة. وقد أمكن هذا العمل من خلال الدعم المالي التي تم الحصول عليها من منحة مشروع "مجلس البحوث في النرويج" (Forskningsrådet) 274433، الارجان: علوم الحياة تقارب البيئة، 2015 منحة مشروع المجلس السويدي للبحوث (Vetenskapsrådet)-04561، فضلا عن بدء التمويل المقدمة من مركز "الطب الجزيئي" النرويج وكلية الرياضيات والعلوم الطبيعية في جامعة أوسلو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
| Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
| Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
| Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
| Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
| Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
| Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
| Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
| Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
| L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
| Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
| PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
| TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
| Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
| Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
| Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
| Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
| Pressure meter - Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
| HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
| HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
| Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
| Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
| Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
| Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
| 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
| Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
| Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
| Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
| Heating and drying oven - venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
| Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
| Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
| Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
| Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24x60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
| Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
| Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
| Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
| White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |
References
- Chen, S., Novick, P., Ferro-Novick, S. ER structure and function. Current Opinion in Cell Biology. 25 (4), 428-433 (2013).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Pendin, D., McNew, J. A., Daga, A. Balancing ER dynamics: Shaping, bending, severing, and mending membranes. Current Opinion in Cell Biology. 23 (4), 435-442 (2011).
- Bilal, T., Gözen, I. Formation and dynamics of endoplasmic reticulum-like lipid nanotube networks. Biomaterials Science. 5 (7), 1256-1264 (2017).
- Shibata, Y., et al. Mechanisms determining the morphology of the peripheral ER. Cell. 143 (5), 774-788 (2010).
- Ozcan, L., Tabas, I. Role of endoplasmic reticulum stress in metabolic disease and other disorders. Annual Review of Medicine. 63, 317-328 (2012).
- Yamanaka, T., Nukina, N. ER dynamics and derangement in neurological diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Taalab, Y. M., et al. Mechanisms of disordered neurodegenerative function: Concepts and facts about the different roles of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). Reviews in the Neurosciences. , (2018).
- Shemesh, T., et al. A model for the generation and interconversion of ER morphologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 5243-5251 (2014).
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Sackmann, E. Endoplasmatic reticulum shaping by generic mechanisms and protein-induced spontaneous curvature. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 153-160 (2014).
- Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6, 791 (2011).
- Hook, D. A., Olhausen, J. A., Krim, J., Dugger, M. T. Evaluation of Oxygen Plasma and UV Ozone Methods for Cleaning of Occluded Areas in MEMS Devices. Journal of Microelectromechanical Systems. 19 (6), 1292-1298 (2010).
- Gözen, I., et al. Fractal avalanche ruptures in biological membranes. Nature Materials. 9 (11), 908-912 (2010).
- Lobovkina, T., Dommersnes, P., Joanny, J. -F., Hurtig, J., Orwar, O. Zipper Dynamics of Surfactant Nanotube Y Junctions. Phys Rev Lett. 97, (2006).
- van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
- Gözen, I., et al. Repair of large area pores in supported double bilayers. Soft Matter. 9 (10), 2787-2792 (2013).
- Gözen, I., et al. Thermal migration of molecular lipid films as a contactless fabrication strategy for lipid nanotube networks. Lab on a Chip. 13 (19), 3822-3826 (2013).
- Sides, P. J., Hoggard, J. D. Measurement of the Zeta Potential of Planar Solid Surfaces by Means of a Rotating Disk. Langmuir. 20 (26), 11493-11498 (2004).
- Nissen, J., Jacobs, K., Rädler, J. O. Interface Dynamics of Lipid Membrane Spreading on Solid Surfaces. Physical Review Letters. 86 (9), 1904-1907 (2001).
