Spontane dannelse og omlægning af kunstige Lipid nanorør netværk som en Bottom-Up-Model for endoplasmatiske Reticulum

Summary

Fast-understøttet, protein-fri, dobbelt phospholipid tolagede membraner (DLBM) kan omdannes til komplekse og dynamiske lipid nanorør netværk og kan tjene som 2D bottom-up modeller af det endoplasmatiske reticulum.

Abstract

Vi præsenterer en praktisk metode til at danne en bottom-up strukturelle organelle model til det endoplasmatiske reticulum (ER). Modellen består af meget tætte lipidic nanorør, der er, i form af morfologi og dynamik, der minder om ER. Nettene er afledt af fosfolipid dobbelt tolagede membran patches fastholdelsen af en gennemsigtig Al₂O₃ substrat. Vedhæftning er medieret af Ca^{2 +} i den omgivende buffer. Efterfølgende nedfiskning af Ca^{2 +} gennem BAPTA/EDTA forårsager retraktion af membranen, hvilket resulterede i spontan lipid nanorør netværk dannelse. Metoden kun består af fosfolipider og microfabricated overflader for simple dannelsen af en ER model og kræver ikke tilsætning af proteiner eller kemisk energi (fx GTP eller ATP). I modsætning til 3D morfologi af det cellulære endoplasmatiske reticulum er modellen to-dimensionelle (omend nanorør dimensioner, geometri, struktur og dynamik bevares). Denne unikke i vitro ER model består af kun et par komponenter, er let at konstruere, og kan ses under et lysmikroskop. Den deraf følgende struktur kan være yderligere dekoreret for ekstra funktionalitet, såsom tilføjelsen af ER-associeret proteiner eller partikler at studere transport fænomener blandt rør. De kunstige net beskrevet her er passende strukturelle modeller for cellulær ER, hvis unikke karakteristiske morfologi har vist sig at være relateret til dens biologiske funktion, mens detaljer om dannelsen af domænet rørformede og rearrangementer inden for er stadig ikke helt forstået. Vi bemærke, at denne metode bruger Al₂O₃ tynd-film-belagt mikroskopi coverslips, som fås i handelen, men kræver særlige ordrer. Derfor er det tilrådeligt at have adgang til en microfabrication facilitet til forberedelse.

Introduction

Skadestuen udfører afgørende opgaver i cellen biologiske herunder proteinfoldning, lipid syntese og calcium forordning^1,2. ER morfologi er iboende de funktion, den udfører. Det kombinerer planar stakke og tætte-dynamisk rørformede domæner, som løbende interagere med cytoskelettet og undergår konstant bevægelse og omlægning. Nogle af de ombygninger, ER strukturer gennemgår omfatter den løbende transformation mellem Plane plader og rør, vesikel dannelsen fra eller fusion ER lumen, forlængelse af allerede eksisterende rør, rør retraktion, fusion og brud³. De rørformede net ejendommelig struktur er energisk ugunstig. Veje og mekanismer, som på Skadestuen genererer og vedligeholder denne organisation såvel som, hvor det drejer sig om dens funktion ikke er endnu forstået fuldt ud^4,5.

Det er kendt, at Skadestuen funktionsfejl når det mister sin homeostatiske tilstand, hvilket resulterer i ER stress, en tilstand forårsaget af en stigning i proteinsyntesen, ophobning af fejlfoldede proteiner eller ændringer i Ca^{2 +} og oxidative balance. ØH forårsager stress igen deformering af den naturlige morfologi af organelle, specielt ved at forstyrre netværk organisation^6,7. Som en reaktion aktiveres cellen en reparation mekanisme til at vende tilbage til En homeostatiske tilstand. Svigt i reparation kan føre til ER-induceret celle apoptose, som bidrager til flere metaboliske og degenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom, type 2 diabetes, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose og flere andre^{7, 8}. Aktuel forskning rettet mod tilrettelæggelse af de rørformede ER net, og flere undersøgelser fokuserer på erstatningsgodtgørelse ER in vitro-². Et par eksisterende modeller^2,9,10 kræver proteiner til at igangsætte og opretholde membran krumning^3,11 og hjælpe organelle nå sin form. Klart, modelsystemer, der afspejler nogle af de vigtigste strukturelle og organisatoriske funktioner i Skadestuen og giver adgang til avancerede eksperimentelle undersøgelser er i stor efterspørgsel.

Vi præsenterer her procedurer for udarbejdelse af en letkøbt, protein/kemisk energi-fri, dynamisk i vitro model til Skadestuen, giver en grundlæggende platform for at studere ER morfologi og tilknyttede funktioner⁴. I denne metode, er en ER model fremstillet med en bottom-up tilgang ved hjælp af kun et par elementer, hvori molekyler af interesse kan integreres for at tilføje kompleksitet. Netværket repræsenterer ER struktur og dynamik. Derudover reversible transformation mellem planar membranen og rør, vesikel dannelsen fra rør, tube fusion, glidende og sammentrækning kan alle overholdes. Foruden tjener som en bottom-up-model til utilstrækkeligt forstået cellulære Skadestuen, kan ruten lipid nanorør net i denne protokol beskrevne være relevant for forskere studerer samlesæt, nanofluidics, enkelt-molekyle og kolloid transport fænomener, Marangoni flow, og andre relaterede felter. Kun molekylære byggesten bruges i vores metode er fosfolipider. Protokollen kræver lidt laboratoriearbejde og grundlæggende udstyr og er tilgængelig til indbygning af supplerende elementer.

Protocol

1. forberedelse af fosfolipid vesikel Suspension

Bemærk: For alle materialer nævnt som "rene" i denne protokol, grundigt vaske dem med isopropanol efterfulgt af deioniseret vand og føntørre dem med kvælstof. Bemærk, at en behandling af glas substrater med stærkt oxiderende sure agenter (Piranha løsning), som typisk anvendes i forberedelse protokoller for understøttede lipid film på fast underlag, ikke bør udføres på Al₂O₃-belagt luftfartsselskaber.

1. Sted i en ren 10 mL runde-bunden eller omvendt pæreformet glas kolbe: soja L-α fosfatidylcholin (PC, 69% w/w), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 30% w/w) og et lipid-konjugeret fluorophore valg [fx Texas rød 1,2 - dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium salt (TR-DHPE, 1% w/w)] i chloroform; for et samlet beløb på 3000 µg af lipider i 300 µL chloroform, hvilket resulterer i en endelig koncentration på 10 mg/mL.
   Bemærk: Brug ren, glas, lufttæt sprøjter med polytetrafluorethylen udstikkere ved håndtering af forbindelser, der indeholder chloroform.
   Forsigtig: Chloroform er giftigt og stærkt svingende og bør altid håndteres i et stinkskab med tilhørende personlige værnemidler.
2. Kolben en rotationsfordamper, position med en hældning på 45°, og rotere på 24 rpm inde i et vandbad ved 23 ° C 6 h med reduceret lufttryk til langsomt og helt fjerne chloroform. Begynde at reducere trykket ret efter indledningen rotation af trin på 20 kPa hver 2 min, indtil den når 20 kPa (150 Torr, 80% vakuum).
   Bemærk: Dannelsen af en homogen lipid film af ensartet tykkelse i forberedelse fartøj er det vigtigste krav til rotavap proceduren. Lipid præparater er følsomme over for rotation hastighed, hurtig trykændringer og endelige trykværdi; derfor nøje følge trinene langsom reduktion samt ende pres og rotation hastighed. Placer kolben med en hældning på 45° at sikre, at dehydrerede lipid kage er dannet jævnt som en film på væggen i kolben. For hurtigt for en rotation fører fører til turbulens og for langsom en rotationsvinkel (på grund af tyngdekraften) til akkumulering af et tykt lag af væske i bunden af kolben. Under den efterfølgende overnatning hævelse proces, en meget inhomogent lipid masse produceres der ikke reagerer godt på det endelige sonikering skridt, og de deraf følgende fraktioner har forskellige kompositioner. Tryk og tid specificeret i metode sikrer langsom desolvation. Med chloroform som opløsningsmidlet, for køler hurtig af et fald i trykket ned blanding, hvilket resulterer i øgede viskositet og samlede og ujævn film dannelse. Den lange periode af 6 h anbefales for at fjerne opløsningsmiddel så vidt muligt, som de organiske opløsningsmidler partitioner i lipid materiale efter rehydrering.
3. Efter 6 h, stoppe rotationen og øge lufttrykket igen, gradvist, med trin på 20 kPa hver 2 min indtil nå 100 kPa. Fjern kolben fra de roterende fordamper og tilsættes 3 mL PBS og 30 µL af glycerol. Forsigtigt swirl kolben til at opløse glycerol. Bruge en lufttæt glas prop til at forsegle kolbe indeholdende lipider.
   Bemærk: Glycerol bruges til at forhindre den komplette dehydrering af lipid film og muliggør tolagede adskillelse¹². Det bør være opvarmet før brugen for at reducere sine viskositet, hvilket letter håndteringen af dette stof. Den varmede glycerol stadig ikke straks blandes med PBS buffer. Blid hvirvlende er påkrævet, indtil glycerol er helt opløst.
4. Gemme kolben i køleskab ved 4 ° C natten til rehydrering og hævelse af lipid film.
5. Den følgende dag, der sonikeres lipider med en ultralyds vandbad ved stuetemperatur (RT, ~ 21 ° C) og på 35 kHz frekvens indtil opnåelse af en ensartet, lidt grumset lipid suspension.
   Bemærk: Ultralydbehandling kan tage omkring 10-30 s. langvarig ultralydbehandling (~ 1 min) producerer varme og er til skade for vesikel dannelsen.
6. Trin 1.1-1.5 udbytte en suspension, der indeholder to typer af vesikulær strukturer: multilamellar vesikler (MLV) og giant unilamellar vesikler (GUV) (figur 1A-1F).
7. Til opbevaring, opdele lipid suspension i 100 µL delprøver, ved hjælp af ialt 30 microcentrifuge rør, og gemme dem i en fryser ved-20 ° C.
   Bemærk: Flash frysning med flydende nitrogen er ikke nødvendig og ikke brugt før opbevaring. Protokollen kan være midlertidigt her. Forlader lipid suspensioner i 4 ° C køleskab for længere tids gange forårsager lipid lysis, som påvirker membran sammensætning.

2. fremstilling af substrater

Bemærk: Følgende protokol er udført på et renrum klassificeret som ISO 8 i ISO standard specifikationen for 14644-1. Atomare lag deposition (ALD) bruges til at fabrikere Al₂O₃ substrater. De angivne procesparametre instrument-afhængige og kan variere mellem forskellige modeller af udstyr. De kan bruges som indledende parametre til at udvikle processen.

1. Indstil temperaturen af ALD reaktoren til 200 ° C.
2. Indlæse glasoverflader (f.eks. glas coverslips) ind i prøve salen sammen med en silicium plade, der skal bruges senere som en reference overflade til at bestemme tykkelsen af deposition af ellipsometry.
   Bemærk: Glas substrater var brugt out-of-the-box og ikke opløsningsmiddel-rengjort før deposition. De var kun skylles med nitrogen gas at fjerne partikler.
3. Evakuere lastning kammer til 400 Pa (3 torr) og overføre prøverne i de vigtigste reaktionskammeret og evakuere det til 200 Pa.
   Bemærk: Temperaturen i reaktoren skal opretholdes ved 200 ° C i ordentlig deposition. Temperatursvingninger, når prøven lastning skal derfor være ekvilibreres før indlede deposition. Kammeret pres er indstillet til at være højere end reaktor pres for at undgå eventuelle forstadier til spredt uden for mødesalen.
4. Begynde at deponere den atomare film. En cyklus består af en 150 ms puls trimethyl aluminium eksponering, efterfulgt af en 1 s udrensning, og efterfølgende en H₂O eksponering af 200 ms varighed efterfulgt af en 1 s udrensning.
   Bemærk: Alle indstillinger, herunder kammer og reaktor pres, cyklusser og udrensninger længde er automatiseret for at opnå en defineret deposition. Disse parametre kan variere blandt de forskellige modeller af udstyr. De forudkonfigurerede opskrifter er ofte udarbejdet af kreditoren eller værktøj ansvarlig i rene rum og meddeles til brugeren som deponerede filmtykkelse pr. tidsenhed.
5. At nå 10 nm af Al₂O₃ på bærematerialet, Gentag processen for 100 cyklusser. Antallet af cyklusser afhænger deposition sats, som kan variere mellem forskellige opskrifter eller udstyr.
6. For at fjerne prøverne fra reaktoren, første aftræk afdeling indtil dens pres når atmosfæretryk, derefter fjerne prøverne.
7. Opbevare prøverne i air tight beholdere på RT indtil brug.
   Bemærk: Ingen yderligere rengøring anbefales før brugen. Protokollen kan være midlertidigt her.
   Bemærk: Prøverne bør ideelt set anvendes umiddelbart efter deposition. Optimal opbevaring kræver positionering overflader inde polypropylen wafer luftfartsselskaber, efterfulgt af omsluttende luftfartsselskaber i rene rum-kompatible plastposer, som skal være nitrogen-skylles før vacuum forsegling. Formålet er at undgå at udsætte overflade til luft-bårne forurenende stoffer. Hvis det er nødvendigt, kan overflader holdes i air tight containere på RT maximalt i 5 dage. Længere opbevaring anbefales ikke. For brugere, der ikke har let adgang til en rent værelse i nærheden, og købe eller få overflader fra udlandet, kan re oxiderende substraterne ved hjælp af ilt plasma eller ozon behandling være en alternativ løsning¹³.

3. omdannelse af Molekylær fosfolipid film til rørformede netværk

1. Tø lipid suspension og overføre en 4 µL dråbe af suspension på et rent glas mikroskop dias/coverslip.
2. Udtørre denne droplet i 20 min. Denne droplet vil kollapse til en flad cirkulære film af lipider efter udtørring, som er synlig for øjet.
3. Rehydrere lipid film med 1 mL af HEPES buffer (Se Tabel af materialer) i 3 min.
   Bemærk: Lydstyrken på rehydrering buffer påvirker tætheden af vesikel suspension (antallet af vesikler pr. rumfang), som overføres efterfølgende til observation kammer. Afhængigt af mængden af observation salen og ønskede vesikel tæthed rehydrering lydstyrke kan indstilles til 0,5-1 mL. Ren borosilicate dias har tendens til at støtte dråber af flere hundrede microliters op til 1,5 mL uden problemer. Da coverslip ikke behøver at blive flyttet, fører dette ikke til et teknisk problem. På flere hydrofobe overflader, såsom SU-8 polymer-belagte dias, kan selv 1,5 mL være deponerede¹².
   Bemærk: Lipider skal være frisk fremstillede, som eksponering af rehydreret lipid filmen for mere end 20 min på RT fører til fordampning af bufferen og delvis dehydrering af de tidligere rehydreret vesikler, hvilket fører til en dårligt defineret sammensætning.
4. Forberede observation kammer: for at muliggøre buffer udveksling ved hjælp af en automatisk pipette, som kræves for at indlede ER transformation, en observation kammer med en åben top blev brugt. Parlamentet består af en Polydimethylsiloxan (PDMS) ramme med dimensioner 1,5 x 1,5 x 0,5 cm, overholdes på Al₂O₃ deponeret coverslip. En ordning af monteret observation kammer er repræsenteret i figur 1G. Denne fremgangsmåde blev udført for at fabrikere PDMS ramme og samle observation kammer:
   1. Forberede en KOH-opløsning ved blanding af 100 g af KOH med 100 mL isopropanol i et bægerglas i isbad. Rør i 10 timer eller længere, indtil KOH er helt opløst ved hjælp af en magnetisk omrører og magnetiske rør plade.
      Forsigtig: KOH løsning er ætsende og kan føre til hud brandsår, så du altid håndtere med passende personlige værnemidler.
      Bemærk: Opløselighed af KOH i isopropanol er ikke så høj som i vand. Opløsningen er exoterm. Knusning KOH pellets før opløse og kontinuerlig omrøring er tilrådeligt.
   2. Dykke et glas petriskål (d = 6 cm) i KOH løsning på RT og holde det natten over.
   3. Den følgende dag, fjerne glasfad fra opløsningen, nedsænke det i en container med deioniseret vand i 5 min., skyl det flere gange med vand, og placere den inde i et varmeskab ved 80 ° C i 1 h. slag overfladen kort med en strøm af kvælstof til at sikre, at en del icles er fjernet.
   4. Passivering overfladen og forhindre limning til PDMS ved at overføre 200 µL af dimethyldichlorsilan med en plastik sprøjte ind i en ren plastbeholder som en vægtning båd.
   5. Gemme glas petriskål med silan for 1 h i en evakueret ekssikkator (lav vakuum, ~ 20 kPa).
      Forsigtig: Dimethyldichlorsilan er giftigt og bør altid håndteres i et stinkskab med tilhørende personlige værnemidler.
   6. Vente 15 min før indsamling petriskål i orden for de resterende dimethyldichlorsilan damp til at sprede. Petriskålen er nu TOT silaniseret, og overfladen er hydrofobe.
      Bemærk: En hurtig måde at teste succesen med dette trin er at placere en vanddråbe på TOT silaniseret petriskål. Kontakt vinklen af droplet med overfladen skal synligt øges i forhold til ubehandlede glas.
   7. I en 250 mL blandes plastikbeholder (gennemsigtig plastik kop frisk fra pakken), 10 g af silikoneelastomer base med 1 g af silikoneelastomer hærder (10:1). Rør med en plast omrører/plast spatel i 5 min.
      Bemærk: Luftbobler er dannet efter omrøring, og PDMS vil se bleg-hvide.
   8. Udtørre blandingen til degas på < 20 kPa, indtil alle ekspanderende luftbobler har kollapsede (højere vakuum fremskynder processen). Hæld den afgassede blandingen i TOT silaniseret petriskål.
   9. Helbrede ved 65 ° C i 2 timer i ovn.
      Bemærk: Det er muligt at fordoble hærdning hastigheden ved at øge temperaturen til > 95 ° C. Den stigende hærdning temperatur resulterer i en stigning i stivhed af materialet.
   10. Køle ned petriskålen fyldt med den hærdede PDMS til RT og fjerne PDMS plade med en spatel.
   11. Med en skalpel skæres rammen i dimensioner og geometri passende til rådighed åbningen i mikroskop fase. Dimensioner af 1.5 (længde) x 1.5 (bredde) x 0.5 (højden) cm er egnet til de fleste opsætninger.
   12. Bringe den glatte side (den nederste side, der var i kontakt med petriskålen) af PDMS ramme i kontakt med den aktive side af overfladen hvor Al₂O₃ film er bosat, og forsigtigt lægge pres at skubbe rammen og overflade mod hinanden at gøre dem overholde.
       Bemærk: Vedhæftning mellem PDMS ramme og Al₂O₃ substrat er svag. Tilstedeværelsen af luftbobler på grænsefladen kontakt kan medføre nedtrapning vedhæftet fil og derfor lækage af buffer og relateret indhold. PDMS rammen kan bruges flere gange, hvis umiddelbart efter og før hver brug det skylles med isopropanol, efterfulgt af skylning med Deioniseret vand og føntørring med kvælstof. TOT silaniseret petriskål kan også genbruges.
5. Fyld bemærkning afdeling med Ca^{2 +}- HEPES buffer (Se Tabel af materialer).
   Bemærk: Overfladen bør anvendes umiddelbart efter unsealing pakken. Kontakt med luft fører til adsorption af forurenende stoffer, som nedsætter aktiviteten af overfladen gradvist. Kammeret skal være fyldt med buffer umiddelbart efter samling. Fyld ikke hele salen volumen at tillade tilsætning af de rehydreret lipider i den efterfølgende trin.
6. Sted i salen på Konfokal mikroskop scenen. Overføre rehydreret lipid materiale, nu en suspension, der indeholder gigantiske vesikler, ind i salen med en plastik Pasteur pipette (figur 1A-1 G).
7. Vent 10-20 min at lade vesikler overholde på underlaget og spredt over overfladen (figur 1H-1J).
   Bemærk: Spredning starter straks efter aflejring af lipider på overfladen. Sats for at sprede lidt kan variere afhængigt af lipid sammensætning, Al₂O₃ deposition teknik (ADL, RF-sputtering, kemisk dampudfældning, osv.), friskhed af substrat og divalent kation koncentration i de buffer. Sikre at buffer exchange er udført før brud af spredning patches¹⁴.
8. Efter at have observeret fjerne flere lipid spreads, langsomt den omgivende buffer via en automatisk pipette, sådan at kun en tynd buffer film forbliver på bunden.
   Bemærk: Hurtig fjernelse af buffer perturbs lipid strukturer på overfladen.
9. Gå videre til den omgivende buffer udveksling af langsomt fylde observation kammer med chelator-HEPES buffer (Se Tabel af materialer) ved hjælp af en automatisk pipette (figur 1K).
   Bemærk: Pludselige tilsætning af buffer perturbs lipid strukturer på overfladen.
10. Dette sidste trin giver dynamisk nanotubular net, dannet som følge af den chelator-induceret depinning og sammentrækning af DLBM til MLV⁴ (figur 1L-1Y).

4. mikroskopi Observation

1. Erhverve billederne med en inverteret laser scanning Konfokal mikroskop ved hjælp af en 40 X oliebestandighedsobjektet (1,3 NA) med en scanning hyppigheden af 400 Hz. ansætte en hvid lys Laserkilde for at ophidse Texas røde DHPE på 595 nm. Indsamle emission fra 605 til 700 nm ved hjælp af en hybrid photon detektor.
   Bemærk: Alternativt en epi-fluorescens mikroskop kan bruges til billeddannelse. Afhængig af lyskilder tilgængelige, skal du vælge en passende lipid-dye konjugat.

Representative Results

Lipid suspension i trin 1 i protokollen, og anvendes i hele eksperimenterne indeholder to hovedtyper af vesikler: MLVs og GUVs. Figur 1 A-1F viser laser scanning Konfokal micrographs af vesikler i den oprindelige stikprøve konstrueret i 3D. Figur 1 A-1_C viser en MLV (lipid depositum) i xyz, xz og yz fly, henholdsvis. Figur 1 D-1F viser lignende udsigt over et kæmpe unilamellar vesikel (GUV). Den inderste del af GUVs, som mangler multilamellarity, er hule; lipid materiale for at sprede er derfor væsentligt begrænset. Derfor er kun nyttig lipid reservoirer for denne metode MLVs.

Når lipid suspension overføres til observation salen indeholdende Ca^{2 +}- HEPES buffer (figur 1G), begynder MLVs (figur 1A-1_C) at slå sig ned på Al₂O₃ overflade. Ved kontakt, vesikler overholder overfladen og en cirkulær flade dobbelt lipid tolagede membran (DLBM) begynder at sprede sig fra hver MLV på det solide støtte (figur 1H-1J). MLV fungerer som et reservoir, der giver lipider til den konstant voksende DLBM. Den distale (øverste) tolagede membran, med hensyn til solid støtte, er forbundet til den proksimale (lavere) tolagede membran langs omkredsen af den cirkulære kant, udføre en rullende bevægelse, (figur 1jeg). De to dobbeltlag placeres blankt oven på hinanden, kun have en tyndt flydende film indkapslet mellem dem. Under spredning overholder den proksimale membran løbende støtte overfladen nedenunder, mens den distale membran er sideværts trak i kanterne af den ekspanderende proksimale membran kant. Spredning af DLBM er medieret af Ca^{2 +}, som fungerer som en fusogenic agent mellem lipid hoved grupper fra den proksimale membran og fast substrat⁴.

Hvis spredning fortsætter i længere perioder, membranen spænding stigninger, fører til brud (fig. 2A og 2B). Efter dette punkt, kan membran retraktion, der er nødvendige for at oprette ER rørformede morfologi, ikke længere være fremkaldt. Det er derfor vigtigt at anerkende de bristede membraner. Da lipider i vores eksperimenter mærkes fluorescently, kan de brud være direkte observeret. En nøgleindikator for brud er det betydelige fald i fluorescens intensitet i bristet region (fig. 2A og 2B)¹⁴. Den brud er et resultat af den øgede spændinger og efterfølgende pore dannelse i den distale membran. Under et mikroskop for fluorescerende, vil de bristede regioner derfor udstille halv emission intensitet (enkelt proksimale tolagede) blærevæske regioner (dobbelt tolagede)¹⁴ (figur 2B). Under dannelse af pore vandrer membran materiale, som var oprindeligt placeret på regionerne bristet, til kanterne af sprede patch. Dette medfører igen en vækst på området samlet programrettelse. En hurtig udvidelse af konturen af den cirkulære patch kan derfor også ses under sprænges.

For at undgå den omfattende vækst fører til brud af patches, umiddelbart efter at området cirkulære patch når 100-200 µm, fjernes Ca^{2 +}- HEPES buffer forsigtigt med en automatisk pipette indtil en tynd film af flydende rester på overfladen. Chelator-HEPES buffer føjes derefter forsigtigt herhen for at indlede retraktion (figur 1K). En komplet dehydrering af prøven (figur 2C) eller hurtig udveksling af buffere (figur 2D og 2E) forårsager forstyrrelser, brud eller deformation af patches. Tilsætning af chelatorer fjerner gradvist Ca^{2 +} fra rummet mellem overfladen og membran. Chelator-HEPES buffer åbner gradvist Inter-Diesel-bilayer-substrat plads, starter fra periferien af lipid membranen patch. Derfor, fjernelse af de fastgørelse websteder starter fra kanterne af den cirkulære patch og overfører indad (figur 1K-1Q). Som følge af depinning begynder lipid membranen at løsne og trække sig tilbage fra de kanter indad, fremskridt i retning af MLV på center. Retraktion proces fører til en ny grænseflade i dynamisk udvikling lipidic rørformede netværk⁴ (figur 1L-1Y). De vedvarende regioner fastgørelse, som ikke tillader membran til at frigøre helt, forblive på overfladen og nucleate opgørelsen, fører til lange forgrenet netværk af nanorør. (Figur 1L-1Y). Løbende de-fastgørelse og yderligere sammentrækning af lipid nanorør er observeret over tid som følge af den gradvise kelation proces. Denne coarsening og omlægning af netværk grene spiller en nøglerolle i den dynamiske opførsel af de rørformede net, som ligner glat Skadestuen.

Figur 1 L-1Y viser micrographs af nanorør netværk fremstillet i protokollen. Figur 1 L er et nærbillede af regionen i figur 1M markeret med den hvide ramme. De løbende lyse-røde regioner i figur 1L og 1 M er den tilbagetrækningskraften brøkdel af DLBM (markeret med en blå stiplet linje i figur 1M). Mikrograf af en rørformet netværk i figur 1N og 1O er omvendt for at øge kontrasten. Figur 1 P og 1Q skildrer reduktion af rørformede massefylde på en membran-regionen i løbet af 3 timer og 20 min. Faldet i rørformede tæthed opstår på grund af den gradvise depinning efterfulgt af sammentrækning af DLBM fra overfladen i den eksperimenterende periode. Over tid, antallet point befriet fra pinning stigninger, fører til rearrangementer og en reduktion af området er omfattet af rør (figur 1P og 1Q). De rørformede rearrangementer er motiveret af overflade fri energi minimering af en lipid nanorør suspenderet mellem to faste punkter. Det er almindelig anerkendt, at den mest effektive måde at minimere overfladeenergi af et nanorør er at reducere dens længde¹⁵. Derfor, når de fusogenic regioner, som i første omgang holde nanorør på overfladen, er de fastgjort, nanorør slide og arrangere sig selv spontant, vedtage en minimal længde. Disse rearrangementer forårsage en gradvist reduceret dækning af overfladen af nanorør (figur 1P og 1Q).

Vi kan ikke visualisere Ca^{2 +}-medieret fastgørelse point, men vi etablere deres placeringer som de punkter, hvor rør har terminal eller skarpe sving. Skarpe sving omtales som V-kryds¹⁵ eller vendepunkter på grund af det pludselige skift i retning af tube's justering (grønne pile i figur 1R og 1 X). Farveprøve repræsenterer endestation på tube, som forhindrer røret fra tilbagetrækningskraften (orange pile i figur 1X). Under re-organisering, energisk gunstig disposition af rør identificeret som "Y-knudepunkter" eller "3-vejs kryds", vises. Y-krydset forbinder tre reagensglas med cirka 120° vinkler mellem hver tube, hvor den korteste samlede længde kan sikres. Y-knudepunkter, som ikke besidder en farveprøve, og i stedet er placeret mellem flere nanorør er ikke fastgjort. Dette er den eneste Y-kryds type, der kan udføre glidende (blå pile, figur 1R). Som vist i figur 1R og 1S, glidende af en Y-krydset langs et yderst ustabilt skæringspunktet resulterer i dannelsen af to individuelle Y-knudepunkter (blå pile i figur 1S). Den stiplede hvid linje overlejret på figur 1S repræsenterer konturen af rørformede netværk fragment i figur 1R. En brøkdel af Y-knudepunkter besidder ende terminaler (gul pil i figur 1T) som over tid, i sidste ende trækker (figur 1U). Transformation af en V-krydset til en enkelt, lige rør ved depinning af skæringspunktet for to linjesegmenter og sammentrækning af en af de rør, der udgør figuren V kan ses i figur 1V og 1W og Figur 1X og 1Y, henholdsvis.

Figur 1 : Omdannelse af lipid indskud til ER-lignende rørformede netværk. (A-F) Laser scanning Konfokal micrographs af vesikler i den oprindelige stikprøve, konstrueret i 3D. (A-C) Multilamellar lipid vesikel (MLV, lipid depositum) i xyz-, xz- og yz planes, henholdsvis. (D-F) Lignende udsigt over et kæmpe unilamellar vesikel (GUV). Den indre del af GUVs er hule, hvilket gør lipid materiale for at sprede væsentligt begrænset. Nyttige lipid reservoirer for denne metode er derfor MLVs. (G) Illustration af observation salen monteret på en inverteret mikroskop som buffer og lipider er deponeret. Salen er sammensat af en PDMS ramme overholdt på et Al₂O₃ overtrukket coverslip, giver en åben mængde top. (H-J) Illustration af de sprede fænomener af MLV i overværelse af Ca^{2 +}. (H) ved kontakt med Al₂O₃spreder MLV spontant i form af et cirkulære, dobbelt lipid tolagede membran (DLBM). (I) skematisk sideudsigt over DLBM i xz flyet, hvor periferier udføre rullende bevægelse. MLV (d = 5-15 µm) og DLBM (tykkelse = 10 nm) er ikke trukket til skala. J en Konfokal Mikrograf af en spredning DLBM fra toppen-view. (K) beskriver de vigtigste trin i denne protokol, hvor bufferen er udskiftet til en indeholdende Ca^{2 +} chelatdannere, hæmme spredning, forårsager retraktion i DLBM til MLV og fører til dannelsen af lipid nanorør. (L-Y) Micrographs af nanorør net opnås med den beskrevne metode. (L) Næroptagelse af regionen i (M) markeret i en ramme. De løbende lyse-røde regioner (L og M) repræsenterer DLBM (også markeret med en blå stiplet linje i M). Mikrograf af en rørformet netværk (N og O) er omvendt for at øge kontrasten. (P og Q) Skildring af reduktion af rørformede massefylde på en membran-regionen i løbet af 3 h og 20 min. (R-Y) repræsentative rørformede re arrangementer. (R og S) Glidende, (T og U) skiftes af en Y-krydset til V-krydset af sammentrækning af en effektparameter, og (V og W) de-til fastgørelse af et vendepunkt, hvilket resulterede i udryddelse af en V-krydset. (X og Y) Sammentrækning af en farveprøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Potentielle negative resultater. (A og B) Brud i distale membranen på grund af en lang ventetid før udveksling af buffere. De bristede områder, hvor den proksimale membran bliver synlige, vises som mørke områder i forhold til regionerne blærevæske distale membran. Indsatser til panelet B viser lysintensitet langs den blå pil på Mikrograf. Intensiteten af de bristede regioner af membranen (proksimalt/enkelt tolagede bliver synlig) svarer til halvdelen af blærevæske membran (distale/dobbelt tolagede) intensitet. (C) udseende af en tør lipid patch dannet som følge af fjernelsen af alle flydende fra observation kammer. (D og E) Afbrydelse af membran af hurtig udveksling af buffere via automatisk pipette. I (D), har MLV opdelt i 2 MLVs, fører til en ikke-cirkulære, deforme lipid patch. I (E) afspejles det mønster af flow (pile), lavet af stærk indsprøjtning af chelator-HEPES-buffer på tubulated membran struktur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I den følgende diskussion, er kritiske trin, eventuelle ændringer og begrænsninger af protokollen beskrevet. Det første vigtige skridt er ordentlig samling af salen observation, da vedhæftning af PDMS rammen til Al₂O₃ overflade er uløseligt svag. I tilfælde hvor rammen ikke overholder underlaget korrekt, indholdet vil lække fra observation kammer og eksperimentet vil komme til at stå. De vigtigste faktorer, der hindrer korrekt forsegling af overflade og ramme 1) en mangel på grundig rengøring af rammen (genbruges) PDMS og 2) luft bobler, der lejlighedsvis få fanget mellem ramme og underlag. En nypræparerede eller grundigt rengjort PDMS ramme bør anvendes. Rammen bør skylles før og efter hver brug med isopropanol, efterfulgt af skylning med Deioniseret vand og føntørring med kvælstof. Al₂O₃ flader kræver ikke nogen forudgående rengøring, da de er fremstillet i et renrum miljø og opbevares i lukkede beholdere indtil brug. På grund af Al₂O₃amfotere karakter, bør det ikke blive udsat for stærkt sure opløsninger. Andre mønstre for observation kammer kan være ansat, afhængigt af tilgængeligheden af den individuelle opsætning. Vigtige funktioner i salen er gratis adgang til den flydende prøve fra den åbne top og inaktive ramme materiale med hensyn til de anvendte løsninger og prøver. Dimensionerne kammer er også en væsentlig faktor, som de skal rumme en diskenhed fra 0,5 til 1 mL. Da overflader anvendes typisk standard-størrelse coverslips (24 x 60 mm), bestemmes mængden af salen hovedsagelig af tykkelsen af rammen. Til vores viden er afstandsstykker med størrelse og dybde, som kan rumme de prøve mængder typisk håndteres i denne protokol ikke kommercielt tilgængelige. Vi har derfor dedikeret en sektion i protokollen detaljer af fremstilling og montage af en prøve salen ramme.

Den anden afgørende skridt i denne protokol er buffer udvekslingen. En udfordring i dette trin er timingen kræves for at udføre denne udveksling. Spredning af MLV ved kontakt med Al₂O₃ substrat er instant, og den fortsatte udvidelse af DLBM fører til sin brud, afslutter eksperimentet (figur 2A, B). Derfor spredning bør overvåges konstant, og buffer udveksling skal udføres i tide. Udveksling bør ikke udføres for hurtigt efter initialisering af spredning, således at membran patches til at nå en optimal størrelse (100-200 µm i diameter). På den anden side forårsager løbende vedhæftning på overfladen høj membran spændinger, der fører til brud. Således patches alle membran til sidst brud hvis spredning ikke er afbrudt. Timingen af den brud er forskellig for hver patch, da det afhænger af størrelse og interne struktur af MLV og tilgængelighed af lipider deri. Tidspunktet for udveksling bør derfor arrangeres til et tidspunkt, hvor de un-bristet pletter med optimal størrelser repræsenterer et flertal af hele befolkningen. En anden udfordring i buffer exchange trin er satsen af fjernelse og tilføjelse af buffere. Udfører denne substitution for hurtigt har en skadelig indflydelse på de endelige membran strukturer (figur 2C-E). Overdreven udvinding af Ca^{2 +}- HEPES buffer uden at forlade en tyndt flydende film på bærematerialet, resulterer i tørrede og uigenkaldeligt deforme membran patches (figur 2C). Selv om en ordentlig mængde væske er opretholdt på overfladen, forårsager pludselige tilsætning af Chelator-HEPES buffer også undertrykkelse af netbårne membran strukturer. Figur 2 D,E viser den typiske udseende af hydrodynamically forstyrret membran patches. Den samlede morfologiske forstyrrelser påvirker ikke nødvendigvis de dynamiske egenskaber af de endelige strukturer (dvs. de rørformede rearrangementer i resterende områder vil stadig forekomme). Dog vil det blive vanskeligt at observere den materielle transformation på de deforme strukturer. For eksempel, i figur 2D, ville det være vanskeligt at bestemme den retning, som MLV DLBM trækker sig tilbage.

En mulig ændring af protokollen er lipid sammensætning bruges. Hovedfokus har været på fosfolipider, der dominerer ER sammensætningen i pattedyr og gær¹⁶ (e. g., phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), og phosphatidylinositol (PI). De oprindelige eksperimenter blev udført ved brug af PC og PI blandinger⁴. I resultaterne præsenteres, blev en blanding af PC og DOPE og et derivat af PE brugt. Dog er ikke alle vilkårlige lipid kompositioner blevet fundet for at skabe de rørformede strukturer fremkommer gennem denne protokol. Et par af de andre eksperimentelt undersøgte lipid blandinger indebærer samlede hjerte ekstrakt, soy bean uddrag polar, E. coli ekstrakt polar, blandinger af PC med stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) i varierende forhold og blandinger af PC-PE-PI-Posphatidyl Serin (PS) i varierende forhold. Eftersom rørformede membran strukturer besidder høje krumninger og kræver særlig ordning af individuelle lipid molekyler, forventes det, at det observerede fænomen er lipid sammensætning-specifikke.

En anden ændring anvendes i denne protokol er metoden til overflade fabrikation. Her, blev ALD brugt til at fabrikere Al₂O₃ belagt coverslips. Dette adskiller sig fra den oprindeligt rapporterede deposition metode, reaktiv sputtering⁴. Mens dette indikerer, at en alternativ overflade fabrikationsanlæg metode stadig kan føre til ER-lignende tubulation, synes en vigtig begrænsning at være specificiteten af den overflademateriale. Mode af spredning og styrke af vedhæftning er meget afhængig af overflademateriale, egenskaber, der påvirker faktorer såsom elektrostatiske interaktion, Fugtningsmuligheden, hydrophobicity og ruhed af overfladen. Al₂O₃ overflader give optimal vedhæftning styrke, og lipid film kan både vedhæfte kraftigt nok til at sprede som en dobbelt lipid tolagede membran og frigøre at danne rørformede netværk efter udtagning af Ca^{2 +} ioner. Vi har tidligere testet det samme eksperiment med SiO₂, hvori de multilamellar vesikler spredes som en dobbelt lipid tolagede membran, men ingen rørformede netværk dannelse blev observeret ved tilsætning af chelatorer¹⁷. Nedtrapning udlæg og tube dannelse er observeret kun på Al₂O₃ eller plasma ætset Al¹⁸. Vores undersøgelser afslørede, at parameteren medvirkende fører til sådant fænomen var zeta potentielle af overflader, som Al og Al₂O₃ var tæt på nul (mV) og SiO₂ betydeligt negativt. Zeta potentiale af borosilicate er magen til SiO₂¹⁹; vedhæftning af lipid film på borosilicate er derfor lige så stærk og irreversibel. Faktisk fører multilamellar lipid reservoir kontakt til borosilicate overflader typisk til øjeblikkelig brud og dannelsen af enkelt lipid dobbeltlag²⁰. Al₂O₃ overflader kræves for denne protokol er ikke let eller kommercielt tilgængelige. De kan dog custom-bestilt fra specialty glas og substrat producenter. Adgang til renrum faciliteter med tynd-hinde fabrikation udstyr er stærkt anbefales.

De andre eksisterende bottom-up metoder til at fabrikere ER-lignende rørformede netværk^2,10 involverer proteiner samt input af kemisk energi (fx., GTP og ATP). Rapoport og kolleger² rapporteret dannelsen af ER-netværk på glas coverslips i vitro ved at blande de membran-bøjning proteiner øjeblikket i ER, med fosfolipider og GTP. Arbejde af Bachand et al. ¹⁰ viser, hvordan sådanne dynamiske rørformede netværk kan oprettes ved hjælp af molekylære motorer og ATP som energikilde. Denne protokol fremlagde kræver ikke Membranproteiner eller hydrolyse af organiske forbindelser til energi. De kun væsentlige komponenter er fast substrat og Fosfolipiderne. Rensning og udvinding af proteiner er ikke påkrævet. Denne protokol giver i form af enkelheden i de konstituerende molekyler, de mest grundlæggende ER model.

Med denne grundlæggende, lipid-baserede ER model etableret, er opbygningen af kompleksiteten ved at tilføje ER tilknyttet komponenter af interesse, da det giver mulighed for undersøgelse af enkelte påvirkninger på systemet. Svarende til de faktiske ER net, rør i modellen er dynamisk. Konjugation til og migration af mærket Membranproteiner eller fluorescerende partikler i hele den rørformede netværk, kan give oplysninger om retningen af membran bevægelse. Indkapsling og overvågning af fluorescerende væske inde i DLBM og rør under transformation og en eventuel kortlægning af intratubular indhold transport kan tjene som et andet fokus. Endelig, en overgang fra den 2D ER model som følge af denne protokol mod en 3D glat ER model kan vedtages gennem indkapsling af netværk i hydrogel arkitekturer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pear-shape flask 10 mL	Lenz Laborglasinstrumente	3.0314.13	In which the lipid mixture is prepared
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N)	Hamilton	P/N81520	For transfer of the chloroform to beaker
Custom large hub needle Gauge 22 S	Hamilton	7748-18	Removable needle for syringe specified in row 3
Hamilton 250 µL glass syringe	Hamilton	7639-01	Used for transfer of lipids in chloroform to the flask
Large hub Gauge 22 S	Hamilton	7780-03	Removable needle for syringe specified  in row 5
Hamilton 50 µL glass syringe	Hamilton	7637-01	Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask
Small hub Gauge 22 S	Hamilton	7770-01	Removable needle for syringe specified in row 7
Chloroform anhydrous (≥99%)	Sigma-Aldrich	288306	Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC)	Avanti Polar Lipids Inc	441601	phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids Inc	850725	phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI)	Avanti Polar Lipids Inc	840044	alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017)
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE)	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	T1395MP	Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture
Digital Dry Baths/Block Heaters	Thermo Fischer	88870006	To warm glycerol in order to decrease its viscosity
Glycerol for molecular biology (≥99%)	Sigma Life Science	G5516	For lipid preparation
PBS buffer  (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21			Used to prepare the lipid suspension
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%)	Sigma Life Science	T1503	Used to prepare PBS buffer
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4)	Sigma-Aldrich	P5629	PBS buffer ingredient
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O)	Sigma Life Science	63138	PBS buffer ingredient
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	795488	PBS buffer ingredient
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA)	Sigma-Aldrich	E4884	PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient
Ultrasonic cleaner USC-TH	VWR	142-0084	Ultrasonication of rehydrated lipids
Rotary evaporator  -  Büchi rotary evaporator Model R-200	Sigma	Z626797	For evaporation of chloroform
Pressure meter - Vacuum regulator IRV-100	SMC	IRV10/20	For controlling the pressure value during lipid dehydration
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27			Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water
HEPES ≥99.5% (titration)	Sigma Life Science	H3375	HEPES-buffer ingredient
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl)	Sigma Life Science	S3014	HEPES-buffer ingredient
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29			Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2)	Sigma Life Science	C5670	To prepare Calcium-HEPES buffer
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31			Used to promote the formation of tubular networks.  Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4)	Sigma Life Science	14513	Chelator-HEPES buffer ingredient
Sodium Hydroxide	Sigma	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
pH meter accumet™ AE150 pH	Fisher Scientific	1544693	Used to measure the pH of all buffers
Glass petri dish	VWR	HECH41042012	6 cm, used for making the PDMS sheet
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH)	Sigma-Aldrich	221473	To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet
Isopropanol prima ren 99.5%	Antibac AS	600079	KOH solution ingredient
Heating and drying oven - venticell	MMM Medcenter Einrichtungen GmbH	MC000714	For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS
Dichlorodimethylsilane ≥99.5%	Sigma-Aldrich	440272	Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-79202-05	Connected to desiccator
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent	Dow corning	24236-10	Kit to make PDMS solution
Sylgard 184 Silicone elastomer base
Disposable scalpel	Swann-Morton	11798343	Used to cut the PDMS
Cover slips	Menzel -Gläser	MEZ102460	24x60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3
Atomic layer deposition system	Beneq	TFS200 (model number)	Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass
Ellipsometer	J.A. Woollan Co.	Alpha-SE (model name)	System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface
Laser scanning confocal  microscope	Leica Microsystems	Leica TCS SP8 X	Microscope used for visualization of the experiment
Objective 40x, 1.3 NA	Leica Microsystems	1550635	Used for visualization of the experiment
White light laser source	Leica Microsystems	Leica TCS SP8 X	For excitation of the membrane fluorophore