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Bioengineering

सहज गठन और Endoplasmic जालिका के लिए एक नीचे-अप मॉडल के रूप में कृत्रिम लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क की पुनर्व्यवस्था

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Centre for Molecular Medicine Norway, Faculty of Medicine, University of Oslo, 2Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Oslo, 3Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology

Summary

ठोस समर्थित, प्रोटीन से मुक्त, डबल फॉस्फोलिपिड bilayer झिल्ली (DLBM) जटिल और गतिशील लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क में तब्दील किया जा सकता है और 2 डी नीचे से ऊपर मॉडल endoplasmic जालिका के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

Abstract

हम endoplasmic जालिका (ईआर) के लिए एक बॉटम-अप स्ट्रक्चरल organelle मॉडल बनाने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रस्तुत करते हैं । मॉडल उच्च सघन लिपिड नैनोट्यूब कि कर रहे हैं, आकृति विज्ञान और गतिशीलता, एर की याद ताजा के मामले में होते हैं । नेटवर्क फॉस्फोलिपिड डबल bilayer झिल्ली एक पारदर्शी अल2ओ3 सब्सट्रेट का पालन पैच से प्राप्त कर रहे हैं । आसंजन से मध्यस्थता है Ca2 + परिवेश बफर में. BAPTA/EDTA के माध्यम से Ca2 + के बाद की कमी झिल्ली के कर्षण का कारण बनता है, सहज लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क गठन में जिसके परिणामस्वरूप । विधि केवल एक ईआर मॉडल के सरल गठन के लिए फॉस्फोलिपिड और microfabricated सतहों शामिल है और प्रोटीन या रासायनिक ऊर्जा (जैसे, GTP या एटीपी) के अलावा की आवश्यकता नहीं है । सेलुलर endoplasmic जालिका के 3d आकृति विज्ञान के विपरीत, मॉडल दो आयामी है (हालांकि नैनोट्यूब आयामों, ज्यामिति, संरचना, और गतिशीलता बनाए रखे हैं). इन विट्रो ईआर मॉडल में यह अनूठा केवल कुछ घटकों के होते हैं, का निर्माण करने के लिए आसान है, और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जा सकता है । परिणामस्वरूप संरचना और अतिरिक्त कार्यशीलता के लिए सजाया जा सकता है, जैसे एर के अलावा जुड़े प्रोटीन या कणों ट्यूबों के बीच परिवहन घटना का अध्ययन करने के लिए । कृत्रिम नेटवर्क यहां वर्णित सेलुलर एर, जिसका अद्वितीय विशेषता आकृति विज्ञान के लिए अपने जैविक समारोह से संबंधित होना दिखाया गया है के लिए उपयुक्त संरचनात्मक मॉडल हैं, ट्यूबलर डोमेन के गठन के बारे में विवरण जबकि और भीतर व्यवस्थाएं अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रही हैं । हम ध्यान दें कि इस विधि अल2हे3 पतली फिल्म लेपित माइक्रोस्कोपी coverslips, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन विशेष आदेश की आवश्यकता का उपयोग करता है । इसलिए, यह उचित है कि तैयारी के लिए एक microfabrication सुविधा के लिए उपयोग किया है ।

Introduction

एर प्रोटीन तह, लिपिड संश्लेषण, और कैल्शियम विनियमन1,2सहित जैविक कोशिका में महत्वपूर्ण कार्यों बाहर किया जाता है । एर आकृति विज्ञान यह कार्य करता है के लिए आंतरिक है । यह planar स्टैक और घने-गतिशील ट्यूबलर डोमेन को जोड़ती है, जो लगातार cytoskeleton के साथ बातचीत करती है और निरंतर गति और पुनर्व्यवस्था से गुजरती है । रिमॉडलिंग के कुछ है कि एर संरचनाओं से गुजरना planar चादरें और ट्यूबों के बीच निरंतर परिवर्तन, पुटिका गठन से या एर लुमेन को फ्यूजन, पूर्व मौजूदा ट्यूबों के बढ़ाव, ट्यूब रिकर्षण, फ्यूजन, और टूटना3शामिल हैं । ट्यूबलर नेटवर्क के विशिष्ट संरचना ऊर्जावान प्रतिकूल है । रास्ते और तंत्र जिसके द्वारा ईआर उत्पंन करता है और इस संगठन का कहना है और साथ ही कैसे इस समारोह से संबंधित है अभी तक पूरी तरह से4,5समझ में नहीं है ।

यह ज्ञात है कि एर खराबी जब यह अपनी समस्थिति राज्य खो देता है, एर तनाव में जिसके परिणामस्वरूप, एक हालत प्रोटीन संश्लेषण में वृद्धि के कारण होता है, reed प्रोटीन का संचय, या Ca2 में परिवर्तन + और ऑक्सीडेटिव संतुलन । ईआर तनाव बारी में organelle के प्राकृतिक आकृति विज्ञान की विकृति का कारण बनता है, विशेष रूप से नेटवर्क संगठन6,7परेशान करके । प्रतिसाद के रूप में, कक्ष एक समस्थिति स्थिति पर वापस जाने के लिए सुधार प्रणाली सक्रिय करता है । मरंमत में विफलता ईआर-प्रेरित सेल apoptosis, जो कई चयापचय और अपक्षयी रोगों जैसे अल्जाइमर रोग, प्रकार 2 मधुमेह, पार्किंसंस रोग, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, और कई अन्य लोगों के लिए योगदान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं7, 8. वर्तमान अनुसंधान ट्यूबलर ईआर नेटवर्क के संगठन लक्ष्य, और कई अध्ययनों से इन विट्रो2में एर पुनर्गठन पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । कुछ मौजूदा मॉडल2,9,10 प्रोटीन की आवश्यकता को आरंभ करने और बनाए रखने के लिए झिल्ली वक्रता3,11 और मदद organelle अपने आकार तक पहुंचने । जाहिर है, मॉडल सिस्टम है कि एर के प्रमुख संरचनात्मक और संगठनात्मक सुविधाओं के कुछ दर्पण और उंनत प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए उपयोग प्रदान महान मांग में हैं ।

हम एक सतही की तैयारी के लिए यहां मौजूद प्रक्रियाओं, प्रोटीन/रासायनिक ऊर्जा मुक्त, इन इन विट्रो मॉडल एर के लिए, ईआर आकृति विज्ञान और संबद्ध कार्यों4का अध्ययन करने के लिए एक बुनियादी मंच प्रदान. इस विधि में, एक एर मॉडल केवल कुछ तत्वों, जिसमें ब्याज के अणुओं जटिलता जोड़ने के लिए एकीकृत किया जा सकता है का उपयोग कर एक नीचे-ऊपर दृष्टिकोण के साथ गढ़े है । नेटवर्क ईआर संरचना और गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा, planar झिल्ली और ट्यूबों, ट्यूबों, ट्यूब फ्यूजन, फिसलने और कर्षण से पुटिका गठन के बीच प्रतिवर्ती परिवर्तन सभी मनाया जा सकता है । पूरी तरह से समझ सेलुलर ईआर के लिए एक नीचे से ऊपर मॉडल के रूप में सेवारत के अलावा, लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित मार्ग आत्म विधानसभा, nanofluidics, एकल अणु और colloid अध्ययन के शोधकर्ताओं के लिए लागू किया जा सकता है परिवहन घटनाएं, Marangoni प्रवाह, और अंय संबंधित क्षेत्रों । हमारी पद्धति में प्रयुक्त एकमात्र आणविक भवन ब्लॉक्स फॉस्फोलिपिड हैं. प्रोटोकॉल थोड़ा प्रयोगशाला काम और बुनियादी उपकरणों की आवश्यकता है और अतिरिक्त तत्वों के शामिल करने के लिए सुलभ है ।

Protocol

1. फॉस्फोलिपिड पुटिका निलंबन की तैयारी

नोट: के लिए सभी सामग्री "के रूप में साफ" इस प्रोटोकॉल में भेजा, अच्छी तरह से उंहें isopropanol के साथ धो पानी और झटका के बाद उंहें नाइट्रोजन के साथ सूखी धोने । ध्यान दें कि मजबूत ऑक्सीकरण अम्लीय एजेंटों (पिरांहा समाधान), जो आम तौर पर ठोस सब्सट्रेट पर समर्थित लिपिड फिल्मों के लिए तैयारी प्रोटोकॉल में लागू किया जाता है के साथ कांच सब्सट्रेट्स का एक इलाज, अल2ओ3-लेपित पर नहीं किया जाना चाहिए वाहक.

  1. एक साफ 10 मिलीलीटर गोल-नीचे या औंधा नाशपाती के आकार का गिलास कुप्पी में रखें: सोया एल-α phosphatidyl choline (पीसी, ६९% डब्ल्यू/डब्ल्यू), 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (डोप, 30% डब्ल्यू/डब्ल्यू), और एक लिपिड-संयुग्मित fluorophore पसंद के [जैसे, टेक्सास लाल 1, 2- dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium नमक (TR-DHPE, 1% w/w)] क्लोरोफॉर्म में; क्लोरोफॉर्म के ३०० µ l में लिपिड के ३००० µ जी की कुल राशि के लिए, 10 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप ।
    नोट: क्लोरोफॉर्म युक्त यौगिकों से निपटने जब polytetrafluoroethylene plungers के साथ साफ, कांच, गैस तंग सीरिंज का उपयोग करें ।
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म विषाक्त और अत्यधिक अस्थिर है और हमेशा जुड़े व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक धुएं डाकू के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  2. एक रोटरी वाष्पीकरण के लिए कुप्पी कनेक्ट, ४५ ° की एक झुकाव के साथ स्थिति है, और 23 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान के अंदर 24 rpm को कम हवा के दबाव के साथ धीरे और पूरी तरह से क्लोरोफॉर्म को दूर करने के साथ 6 एच के लिए घुमाएगी । 20 केपीए हर 2 मिनट के कदम से रोटेशन की शुरुआत के बाद दबाव सही कम करने शुरू जब तक यह 20 केपीए (१५० Torr, ८०% वैक्यूम) तक पहुंचता है ।
    नोट: तैयारी पोत में वर्दी मोटाई के एक समरूप लिपिड फिल्म के गठन rotavap प्रक्रिया के लिए सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकता है । लिपिड तैयारी रोटेशन वेग, तेजी से दबाव में परिवर्तन, और अंतिम दबाव मूल्य के प्रति संवेदनशील हैं; इसलिए, कड़ाई से धीमी गति से कमी कदम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंत दबाव और रोटेशन वेग का पालन करें । ४५ ° की एक झुकाव के साथ कुप्पी स्थिति की गारंटी है कि निर्जलित लिपिड केक की कुप्पी की दीवार पर एक फिल्म के रूप में समान रूप से गठन किया है । बहुत तेजी से एक रोटेशन के लिए अशांति की ओर जाता है और भी एक रोटेशन की ओर जाता है (गुरुत्वाकर्षण के कारण) की कुप्पी के तल पर तरल पदार्थ की एक मोटी परत के संचय के लिए । बाद रात में सूजन की प्रक्रिया के दौरान, एक बहुत inhomogenous लिपिड द्रव्यमान का उत्पादन किया है कि अच्छी तरह से अंतिम sonication कदम करने के लिए जवाब नहीं है, और जिसके परिणामस्वरूप भिन्न भिन्न रचनाएं हैं । विधि में निर्दिष्ट सीमा के भीतर दबाव और समय धीमी desolvation सुनिश्चित करता है । विलायक के रूप में क्लोरोफॉर्म के साथ, दबाव में एक बूंद की भी तेजी से नीचे मिश्रण ठंडा, वृद्धि हुई चिपचिपापन और कुल और असमान फिल्म गठन में जिसके परिणामस्वरूप । 6 एच की लंबे समय अवधि के क्रम में सबसे बड़ी संभव करने के लिए विलायक हटाने के लिए सिफारिश की है, निर्जलीकरण पर लिपिड सामग्री में कार्बनिक विलायक विभाजन के रूप में ।
  3. 6 घंटे के बाद, रोटेशन को रोकने के लिए और हवा का दबाव फिर से वृद्धि, धीरे से, १०० केपीए तक पहुंचने तक 20 केपीए हर 2 मिनट के कदम से । रोटरी वाष्पक से कुप्पी निकालें और पंजाब के 3 मिलीलीटर और ग्लिसरॉल के 30 µ एल जोड़ें । धीरे से ग्लिसरॉल को भंग करने के लिए कुप्पी घूमता है. लिपिड युक्त कुप्पी को सील करने के लिए एक एयर-टाइट ग्लास डाट का प्रयोग करें ।
    नोट: ग्लिसरॉल लिपिड फिल्म का पूरा निर्जलीकरण को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है और bilayer जुदाई12सक्षम बनाता है । यह इस यौगिक की हैंडलिंग की सुविधा है, जो अपनी चिपचिपापन, कम करने के लिए उपयोग करने से पहले गर्म किया जाना चाहिए । गर्म ग्लिसरॉल अभी भी तुरंत नहीं है पंजाबियों बफर के साथ मिश्रण । कोमल घूमता है जब तक ग्लिसरॉल पूरी तरह से भंग की आवश्यकता है ।
  4. निर्जलीकरण और लिपिड फिल्मों की सूजन के लिए रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में कुप्पी की दुकान ।
  5. अगले दिन पर, कमरे के तापमान पर एक अल्ट्रासोनिक जल स्नान के साथ लिपिड sonicate (आरटी, ~ 21 डिग्री सेल्सियस) और एक समान प्राप्त करने तक ३५ kHz आवृत्ति पर, थोड़ा पंकिल लिपिड निलंबन.
    नोट: Sonication के आसपास ले जा सकते हैं 10-30 s. लंबे समय तक sonication (~ 1 min) गर्मी पैदा करता है और पुटिका गठन के लिए हानिकारक है ।
  6. कदम 1.1-1.5 एक निलंबन vesicular संरचनाओं के दो प्रकार से युक्त उपज: multilamellar बुलबुले (MLV) और विशाल unilamellar बुलबुले (गुव) (चित्रा 1a-1F) ।
  7. भंडारण के लिए, १०० µ एल aliquots में लिपिड निलंबन विभाजित, कुल 30 microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग कर, और उन्हें में एक फ्रीजर में स्टोर-20 ° c.
    नोट: तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश ठंड आवश्यक नहीं है और भंडारण से पहले इस्तेमाल नहीं किया । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है । लंबे समय तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में लिपिड सस्पेंशन छोड़ने लिपिड lysis का कारण बनता है, जो झिल्ली संरचना को प्रभावित करता है ।

2. सब्सट्रेट्स की तैयारी

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल iso 14644-1 मानक विनिर्देश में iso 8 के रूप में वर्गीकृत एक cleanroom पर किया जाता है. परमाणु परत जमाव (एलड) के लिए अल2हे3 सब्सट्रेट बनाना प्रयोग किया जाता है । निर्दिष्ट प्रक्रिया पैरामीटर साधन-निर्भर हैं और उपकरणों के विभिन्न मॉडलों के बीच भिन्न हो सकते हैं. वे प्रक्रिया को विकसित करने के लिए प्रारंभिक मापदंडों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. २०० डिग्री सेल्सियस के लिए एलड रिएक्टर के तापमान सेट करें ।
  2. ग्लास सतहों लोड (जैसे, ग्लास coverslips) नमूना कक्ष में एक साथ एक सिलिकॉन वेफर, जो बाद में ellipsometry द्वारा बयान की मोटाई निर्धारित करने के लिए एक संदर्भ सतह के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा के साथ ।
    नोट: ग्लास सब्सट्रेट बाहर का उपयोग किया गया-बॉक्स और विलायक-जमाव से पहले साफ नहीं थे । वे केवल नाइट्रोजन गैस के साथ फ्लश कणों को हटा रहे थे ।
  3. ४०० फिलीस्तीनी अथॉरिटी (3 torr) के लिए लोडिंग चैंबर खाली और मुख्य प्रतिक्रिया कक्ष में नमूनों हस्तांतरण, और यह २०० फिलीस्तीनी अथॉरिटी को खाली ।
    नोट: रिएक्टर के तापमान उचित जमाव के लिए २०० डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए । नमूना लदान के बाद तापमान उतार चढ़ाव इसलिए जमाव की शुरुआत करने से पहले equilibrated किया जाना चाहिए । चैंबर दबाव को चैंबर के बाहर प्रसार करने के लिए किसी भी पूर्ववर्ती से बचने के लिए रिएक्टर दबाव से अधिक होना करने के लिए सेट है ।
  4. परमाणु फिल्म जमा करना शुरू कर दें । एक चक्र एक १५० एमएस पल्स trimethyl एल्यूमीनियम जोखिम के होते हैं, एक 1 s पर्ज द्वारा पीछा किया, और बाद में, एक एच2ओ एक्सपोजर २०० ms अवधि के बाद एक 1 s पर्ज करें.
    नोट: चैंबर और रिएक्टर दबाव, चक्र की लंबाई सहित सभी सेटिंग्स, और शुद्धीकरण के एक परिभाषित दर को प्राप्त करने के लिए स्वचालित कर रहे हैं. इन मापदंडों उपकरणों के विभिंन मॉडलों के बीच भिंन हो सकते हैं । पूर्व विन्यस्त व्यंजनों अक्सर विक्रेता या उपकरण साफ कमरे में जिंमेदार द्वारा तैयार कर रहे है और समय की इकाई प्रति जमा फिल्म मोटाई के रूप में उपयोगकर्ता के लिए भेजी ।
  5. सब्सट्रेट पर अल2ओ3 के 10 एनएम तक पहुंचने के लिए, १०० चक्र के लिए प्रक्रिया को दोहराने । चक्र की संख्या जमाव दर पर निर्भर करता है, जो विभिन्न व्यंजनों या उपकरणों के बीच भिन्न हो सकते हैं.
  6. रिएक्टर से नमूने निकालने के लिए पहले चैम्बर को तब तक वेंट करें जब तक कि उसका दबाव वायुमंडलीय दबाव में नहीं पहुंचता, फिर नमूनों को हटा दें ।
  7. उपयोग तक आरटी पर एयर तंग कंटेनरों में नमूनों की दुकान ।
    नोट: उपयोग करने से पहले कोई आगे सफाई की सिफारिश की है । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है ।
    नोट: नमूनों आदर्श तुरंत जमाव के बाद इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इष्टतम भंडारण स्थिति की आवश्यकता है, जो साफ कमरे में वाहक-संगत प्लास्टिक की थैलियों, जो नाइट्रोजन-फ्लश करने से पहले वैक्यूम सील किया जा करने के लिए कर रहे है के बाद के रूप में बाहर के रूप में सतहों । उद्देश्य हवा जनित दूषित पदार्थों को सतह को उजागर करने से बचने के लिए है । यदि आवश्यक हो, तो सतहों हवा तंग कंटेनरों में आरटी पर अधिकतम 5 दिनों के लिए रखा जा सकता है । अब संग्रहण अनुशंसित नहीं है । उपयोगकर्ताओं को, जो पास एक साफ कमरे में आसान पहुंच नहीं है के लिए, और खरीद या विदेश से सतहों को प्राप्त करने, ऑक्सीजन प्लाज्मा या ओजोन उपचार के माध्यम से सब्सट्रेट्स पुनः ऑक्सीकरण एक वैकल्पिक समाधान13हो सकता है ।

3. ट्यूबलर नेटवर्क्स को आणविक फॉस्फोलिपिड फिल्मों का रूपांतरण

  1. गल लिपिड निलंबन और निलंबन की एक 4 µ एल छोटी बूंद पर एक साफ गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड/coverslip पर स्थानांतरण ।
  2. 20 मिनट के लिए छोटी बूंद Desiccate । छोटी बूंद सुखाना के बाद लिपिड के एक फ्लैट परिपत्र फिल्म में गिर जाएगी, जो आंख को दिखाई है ।
  3. HEPES बफर के 1 मिलीलीटर के साथ लिपिड फिल्म rehydrat ( सामग्री की तालिकादेखें) 3 मिनट के लिए ।
    नोट: निर्जलीकरण बफर की मात्रा पुटिका निलंबन के घनत्व को प्रभावित करता है (प्रति इकाई मात्रा बुलबुले की संख्या) है, जो बाद में प्रेक्षण कक्ष में स्थानांतरित कर दिया है । अवलोकन कक्ष और वांछित पुटिका घनत्व की मात्रा पर निर्भर करता है, निर्जलीकरण मात्रा 0.5-1 मिलीलीटर को देखते किया जा सकता है । स्वच्छ borosilicate स्लाइड समस्याओं के बिना १.५ मिलीलीटर तक कई सौ microliters की बूंदों का समर्थन करते हैं । चूंकि coverslip को स्थानांतरित किए जाने की आवश्यकता नहीं है, इसलिए यह तकनीकी समस्या का कारण नहीं बनता है । और अधिक hydrophobic सतहों पर, जैसे SU-8 बहुलक-लेपित स्लाइड, भी १.५ मिलीलीटर12जमा किया जा सकता है ।
    नोट: लिपिड हौसले से तैयार किया जाना चाहिए, के रूप में 20 से अधिक मिनट के लिए RT में rehydratेड लिपिड फिल्म के जोखिम बफर और पहले rehydratेड बुलबुले, जो एक खराब परिभाषित संरचना की ओर जाता है की आंशिक निर्जलीकरण के वाष्पीकरण होता है ।
  4. अवलोकन चैंबर तैयार: एक स्वचालित पिपेट, जो ईआर परिवर्तन, एक खुला शीर्ष के साथ एक प्रेक्षण कक्ष शुरू करने की आवश्यकता है के माध्यम से बफर एक्सचेंज के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस चैंबर एक polydimethylsiloxane (PDMS) आयाम १.५ x १.५ x ०.५ सेमी, अल2ओ3 जमा coverslip पर पालन के साथ फ्रेम के होते हैं । घुड़सवार प्रेक्षण कक्ष की एक योजना चित्रा 1जीमें दर्शायी गई है । निंनलिखित कदम PDMS फ्रेम बनाना और प्रेक्षण कक्ष को इकट्ठा करने के लिए प्रदर्शन किया गया:
    1. एक बर्फ स्नान में एक चोंच में isopropanol के १०० मिलीलीटर के साथ १०० जी koh के मिश्रण से एक koh समाधान तैयार करें । 10 ज के लिए हिलाओ या अब तक KOH पूरी तरह से एक चुंबकीय सरगर्मी और चुंबकीय हलचल प्लेट का उपयोग कर भंग कर दी है ।
      चेतावनी: KOH समाधान संक्षारक है और त्वचा जलता करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, तो हमेशा उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ संभाल ।
      नोट: isopropanol में कोह की घुलनशीलता पानी में उतनी ऊंची नहीं है । विघटन अमबर है । को भंग करने से पहले KOH छर्रों को कुचलने और निरंतर सरगर्मी उचित है ।
    2. RT पर KOH समाधान में एक ग्लास पेट्री डिश (डी = 6 सेमी) जलमग्न और यह रात भर रखने के लिए ।
    3. अगले दिन, समाधान से कांच पकवान निकालें, यह 5 मिनट के लिए पानी के साथ एक कंटेनर में विसर्जित कर दिया, यह पानी के साथ कई बार कुल्ला, और यह ८० ° c पर एक सुखाने ओवन के अंदर जगह 1 घंटे के लिए नाइट्रोजन की एक धारा के साथ संक्षेप में सतह झटका उस भाग को सुनिश्चित करने के लिए icles हैं ।
    4. सतह passivate और PDMS के संबंध को रोकने के लिए, एक प्लास्टिक सिरिंज के साथ dimethyldichlorosilane के २०० µ एल हस्तांतरण ऐसे एक भार नाव के रूप में एक साफ प्लास्टिक कंटेनर में ।
    5. एक खाली desiccator (कम निर्वात, ~ 20 केपीए) में 1 ज के लिए silane के साथ एक साथ ग्लास पेट्री डिश स्टोर ।
      चेतावनी: Dimethyldichlorosilane विषाक्त है और हमेशा जुड़े व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक धुएं डाकू के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    6. शेष dimethyldichlorosilane वाष्प के अपव्यय के लिए आदेश में पेट्री पकवान इकट्ठा करने से पहले 15 मिनट रुको । पेट्री पकवान अब silanized है, और सतह hydrophobic है ।
      नोट: इस कदम की सफलता का परीक्षण करने के लिए एक त्वरित तरीका silanized पेट्री डिश पर एक पानी की छोटी बूंद जगह है । सतह के साथ छोटी बूंद के संपर्क कोण दिख अनुपचारित कांच की तुलना में वृद्धि करनी चाहिए ।
    7. एक २५० मिलीलीटर प्लास्टिक कंटेनर में (पैकेज से पारदर्शी प्लास्टिक कप ताजा), सिलिकॉन elastomer इलाज एजेंट के 1 जी के साथ सिलिकॉन elastomer आधार के 10 ग्राम मिश्रण (10:1) । 5 मिनट के लिए एक प्लास्टिक सरगर्मी/प्लास्टिक रंग का उपयोग कर हिलाओ ।
      नोट: हवा के बुलबुले सरगर्मी पर गठन कर रहे हैं, और PDMS पीला-सफेद दिखेगा ।
    8. Desiccate < 20 केपीए पर degas करने के लिए सभी विस्तार हवा बुलबुले ढह गई है जब तक मिश्रण (उच्च वैक्यूम प्रक्रिया में तेजी) । silanized पेट्री डिश में degassed मिश्रण डालो ।
    9. एक ओवन में 2 एच के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर इलाज ।
      नोट: यह ९५ डिग्री सेल्सियस > करने के लिए तापमान में वृद्धि से इलाज की गति को दोगुना करने के लिए संभव है. बढ़ती इलाज तापमान सामग्री की कठोरता में वृद्धि में परिणाम ।
    10. आरटी को ठीक PDMS से भरे पेट्री डिश को ठंडा करें और एक रंग के साथ PDMS स्लैब को हटा दें ।
    11. एक स्केलपेल के साथ, आयाम और माइक्रोस्कोप चरण में उपलब्ध खोलने के लिए उपयुक्त ज्यामिति में फ्रेम में कटौती । आयाम १.५ (लंबाई) x १.५ (चौड़ाई) x ०.५ (ऊँचाई) सेमी अधिकांश setups के लिए उपयुक्त हैं ।
    12. चिकनी पक्ष लाओ (नीचे की ओर है कि पेट्री डिश के साथ संपर्क में था) PDMS फ्रेम की सतह के सक्रिय पक्ष के साथ संपर्क में जहां अल2हे3 फिल्म रहता है, और धीरे से एक दूसरे के खिलाफ फ्रेम और सतह धक्का दबाव लागू करने के लिए उंहें पालन करना ।
      नोट: PDMS फ्रेम और अल2ओ3 सब्सट्रेट के बीच आसंजन कमजोर है । संपर्क अंतरफलक पर हवाई बुलबुले की उपस्थिति de-लगाव और फलस्वरूप, बफर और संबंधित सामग्री के रिसाव के कारण हो सकता है । PDMS फ्रेम कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है अगर तुरंत बाद और प्रत्येक का उपयोग करने से पहले यह isopropanol के साथ कुल्ला किया है, DI पानी और उड़ाने के साथ धोने के बाद नाइट्रोजन के साथ सुखाने के बाद । silanized पेट्री डिश का इस्तेमाल भी किया जा सकता है ।
  5. 2 Ca +-HEPES बफर के साथ अवलोकन चैंबर भरें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: सतह को पैकेज को अनसील करने के तुरंत बाद इस्तेमाल किया जाना चाहिए । वायु के साथ संपर्क करने से संदूषित पदार्थों की सोखना होती है, जिससे सतह की सक्रियता धीरे-धीरे कम हो जाती है । चैंबर तुरंत विधानसभा के बाद बफर के साथ भरा जाना चाहिए । पूरे चैंबर मात्रा बाद के कदम में rehydratेड लिपिड के अलावा के लिए अनुमति देने के लिए मत भरें ।
  6. फोकल माइक्रोस्कोप मंच पर चैंबर प्लेस । rehydratेड लिपिड सामग्री स्थानांतरण, अब एक विशाल बुलबुले युक्त निलंबन, एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ चैंबर में (चित्रा 1ए-1G) ।
  7. 10-20 मिनट रुको बुलबुले सब्सट्रेट पर पालन करने के लिए और सतह भर में फैले (चित्रा 1एच-1J).
    नोट: फैल तुरंत सतह पर लिपिड के जमाव के बाद शुरू होता है । थोड़ा लिपिड संरचना, अल2ओ3 जमाव तकनीक (ADL, आरएफ-sputtering, रासायनिक वाष्प जमाव, आदि), सब्सट्रेट की ताजगी, और divalent कटियन एकाग्रता के आधार पर भिंन हो सकते है प्रसार की दर बफ़र. सुनिश्चित करें कि बफ़र एक्सचेंज rupturinging14फैल पैच के पहले किया जाता है ।
  8. कई लिपिड फैलता देख के बाद, धीरे से एक स्वचालित पिपेट, जैसे कि केवल एक पतली बफर फिल्म नीचे पर रहता है के माध्यम से परिवेश बफर हटा दें ।
    नोट: बफर की तेजी से हटाने की सतह पर लिपिड संरचनाओं perturbs ।
  9. धीरे chelator-HEPES बफर के साथ अवलोकन चैंबर भरने से परिवेश बफर एक्सचेंज के लिए आगे बढ़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) एक स्वचालित पिपेट (चित्रा 1K) का उपयोग कर ।
    नोट: बफर की अचानक इसके अलावा सतह पर लिपिड संरचनाओं perturbs ।
  10. इस अंतिम कदम पैदावार गतिशील nanotubular नेटवर्क, chelator-प्रेरित कर के परिणाम के रूप में गठित और MLV4 (चित्रा 1एल-1Y) को DLBM के कर्षण ।

4. सूक्ष्म अवलोकन

  1. एक औंधा लेजर के साथ छवियों का अधिग्रहण एक 40X तेल का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग (१.३ NA) एक स्कैनिंग आवृत्ति के साथ विसर्जन उद्देश्य ४०० हर्ट्ज. ५९५ एनएम पर टेक्सास रेड DHPE को उत्तेजित करने के लिए एक सफेद प्रकाश लेजर स्रोत को रोजगार । एक संकर फोटॉन डिटेक्टर का उपयोग करके ६०५ से ७०० एनएम के उत्सर्जन को इकट्ठा ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रकाश उपलब्ध स्रोतों पर निर्भर करता है, एक उपयुक्त लिपिड डाई संयुग्मी का चयन करें ।

Representative Results

लिपिड प्रोटोकॉल के चरण 1 में प्राप्त निलंबन और प्रयोग भर में इस्तेमाल किया बुलबुले के दो मुख्य प्रकार हैं: MLVs और GUVs । चित्रा 1 A-1F 3 डी में निर्माण प्रारंभिक नमूने में बुलबुले के लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोग्राफ से पता चलता है । चित्रा 1 A-1C क्रमशः xyz, xz, और yz विमानों में एक MLV (लिपिड जमा) दिखाता है । चित्रा 1 D-1F एक विशाल unilamellar पुटिका (गुव) के समान विचार दिखाता है । GUVs के भीतरी भाग में जो कमी multilamellarity है, वह खोखला है; इसलिए, प्रसार के लिए लिपिड सामग्री काफी सीमित है । इसलिए, इस विधि के लिए केवल उपयोगी लिपिड जलाशयों MLVs हैं ।

जब लिपिड निलंबन Ca2 +-HEPES बफर (चित्रा 1जी), MLVs (चित्रा 1A-1C) से युक्त अवलोकन कक्ष में स्थानांतरित कर दिया है अल2ओ3 सतह पर बसने के लिए शुरू करते हैं । संपर्क पर, बुलबुले सतह का पालन करें, और एक परिपत्र फ्लैट डबल लिपिड bilayer झिल्ली (DLBM) ठोस समर्थन (चित्रा 1एच 1J) पर प्रत्येक MLV से प्रसार करने के लिए शुरू होता है । MLV एक जलाशय है कि लगातार विस्तार DLBM के लिए लिपिड प्रदान करता है के रूप में कार्य । बाहर (ऊपरी) bilayer झिल्ली, ठोस समर्थन के संबंध में, परिपत्र धार की परिधि के साथ समीपस्थ (लोअर) bilayer झिल्ली से जुड़ा हुआ है, एक रोलिंग गति (चित्रा 1मैं) प्रदर्शन. दो bilayers एक दूसरे के ऊपर सपाट रूप से तैनात हैं, केवल एक पतली तरल उनके बीच encapsulated फिल्म होने । प्रसार के दौरान, समीपस्थ झिल्ली लगातार नीचे समर्थन सतह का पालन करता है, जबकि बाहर की झिल्ली बाद में विस्तार समीपस्थ झिल्ली किनारे से किनारों पर खींच लिया है । DLBM के प्रसार 2 सीए द्वारा मध्यस्थता है+, जो समीपस्थ झिल्ली और ठोस सब्सट्रेट4से लिपिड सिर समूहों के बीच एक fusogenic एजेंट के रूप में कार्य करता है.

यदि प्रसार लंबे समय तक जारी रहता है, झिल्ली तनाव बढ़ जाती है, टूटना करने के लिए अग्रणी (चित्रा 2ए और २ बी) । उस बिंदु के बाद, जो एर ट्यूबलर आकृति बनाने के लिए आवश्यक है झिल्ली कर्षण, अब प्रेरित किया जा सकता है । इसलिए, यह टूटना झिल्ली की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है । हमारे प्रयोगों में लिपिड के बाद से फ्लोरोसेंट लेबल कर रहे हैं, rupturing सीधे मनाया जा सकता है । rupturing का एक प्रमुख संकेतक टूटना क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता में महत्वपूर्ण गिरावट (चित्रा 2ए और बी1)14है । rupturing वृद्धि हुई तनाव और बाहर की झिल्ली में बाद में ताकना गठन का एक परिणाम है । एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत, टूटना क्षेत्रों इसलिए unruptureed क्षेत्रों (डबल bilayer)14 (चित्रा 2ख) के उत्सर्जन की तीव्रता (एकल समीपस्थ) के आधे प्रदर्शन करेंगे । ताकना गठन के दौरान, झिल्ली सामग्री, जो शुरू में उठी क्षेत्रों में तैनात किया गया था, फैल पैच के किनारों के लिए स्थानांतरित कर । यह बारी में समग्र पैच क्षेत्र की वृद्धि का कारण बनता है । इसलिए, परिपत्र पैच के समोच्च का तेजी से विस्तार भी rupturing के दौरान मनाया जा सकता है ।

पैच का टूटना करने के लिए अग्रणी व्यापक विकास से बचने के लिए, तुरंत बाद परिपत्र पैच क्षेत्र 100-200 µm तक पहुँच जाता है, Ca2 +-HEPES बफर धीरे तरल की एक पतली फिल्म सतह पर रहता है जब तक एक स्वचालित पिपेट के साथ हटा दिया है. Chelator-HEPES बफर फिर धीरे चैंबर के लिए जोड़ा गया है (चित्रा 1कश्मीर) को पुनः आरंभ करने के लिए । नमूने की एक पूरी निर्जलीकरण (चित्रा 2सी) या बफ़र्स की तेजी से विनिमय (चित्रा 2डी और 2E) गड़बड़ी, rupturing, या पैच के विकृति का कारण बनता है । chelators के अलावा धीरे-2 Ca सतह और झिल्ली के बीच अंतरिक्ष से+ निकालता है । Chelator-HEPES बफर लिपिड झिल्ली पैच की परिधि से शुरू करते हुए, धीरे-bilayer-सब्सट्रेट अंतरिक्ष अंतर तक पहुँचता है । इसलिए, पिन की गई साइट्स को निकालने का प्रचलन पैच के किनारों से प्रारंभ होता है और आवक को प्रोपेगेट करता है (आरेख 1K-1Q) । आधार की एक परिणाम के रूप में, लिपिड झिल्ली को अलग और किनारों की आवक से वापस लेना शुरू होता है, केंद्र में MLV की ओर प्रगति । retraction प्रक्रिया गतिशील विकसित लिपिड ट्यूबलर नेटवर्क4 की एक नई अंतरफलक की ओर जाता है (चित्रा 1एल-1Y) । लगाए, जो झिल्ली पूरी तरह से अलग करने की अनुमति नहीं है की लगातार क्षेत्रों, सतह और nucleate सारणीकरण पर रहते हैं, नैनोट्यूब के लंबे शाखा में नेटवर्क के लिए अग्रणी । (चित्रा 1एल-1Y) । लगातार डी-पिन और लिपिड नैनोट्यूब के आगे कर्षण क्रमिक केलेशनथेरेपी प्रक्रिया के परिणाम के रूप में समय के साथ मनाया जाता है । इस coarsening और नेटवर्क शाखाओं के पुनर्व्यवस्था ट्यूबलर नेटवर्क है, जो चिकनी एर सदृश के गतिशील व्यवहार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।

चित्रा 1 L-1Y प्रोटोकॉल में प्राप्त नैनोट्यूब नेटवर्क्स के माइक्रोग्राफ को दिखाता है. चित्रा 1 L एक करीब है चित्रा 1मीटर में क्षेत्र के सफेद फ्रेम में चिह्नित । चित्रा 1एल और 1m में निरंतर उज्ज्वल लाल क्षेत्रों DLBM के मुकर अंश ( चित्रा 1मीटरमें एक नीले रंग की डैश्ड लाइन के साथ चिह्नित) कर रहे हैं । micrograph में एक ट्यूबलर नेटवर्क का आंकड़ा 1N और 1O विपरीत वृद्धि करने के लिए औंधा है. चित्रा 1 पी और 1Q 3 एच और 20 मिनट के पाठ्यक्रम पर एक झिल्ली क्षेत्र पर ट्यूबलर घनत्व की कमी को दर्शाया गया है । ट्यूबलर घनत्व की कमी प्रयोगात्मक समय अवधि से अधिक सतह से DLBM के पुनर्कर्षण के बाद क्रमिक आधार के कारण होता है । समय के साथ, पिन बढ़ता से मुक्त अंक की संख्या, rearrangement था के लिए अग्रणी और ट्यूबों द्वारा कवर क्षेत्र की कमी (चित्रा 1पी और 1Q). ट्यूबलर पुनर्व्यवस्थाओं एक लिपिड नैनोट्यूब दो तय अंकों के बीच निलंबित की सतह मुक्त ऊर्जा ंयूनतम से प्रेरित हैं । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि एक नैनोट्यूब की सतह ऊर्जा को कम करने का सबसे कारगर तरीका है अपनी लंबाई15कम है । इसलिए, जब fusogenic क्षेत्रों, जो शुरू में सतह पर नैनोट्यूब पकड़, de-टिकी हैं, नैनोट्यूब स्लाइड और खुद को सहज व्यवस्था, एक ंयूनतम लंबाई अपनाने । इन पुनर्व्यवस्थाओं नैनोट्यूब (चित्रा 1पी और 1Q) द्वारा सतह के एक धीरे से कम कवरेज के कारण ।

हम Ca2 +-मध्यस्थता अंक लगाए कल्पना नहीं कर सकते हैं, लेकिन हम अंक जहां ट्यूबों टर्मिनल या तेज बदल जाता है के रूप में अपने स्थानों की स्थापना । तीव्र बदल जाता है वी के रूप में कहा जाता है-जंक्शनों15 या मोड़-क्योंकि ट्यूब संरेखण की दिशा में अचानक बदलाव की ( चित्रा 1R और 1xमें हरे तीर) । एंड-पॉइंट ट्यूब के टर्मिनस का प्रतिनिधित्व करता है, जो ट्यूब को वापस करने से रोकता है ( चित्र 1Xमें नारंगी तीर) । फिर से संगठन के दौरान, "Y-जंक्शनों" या "3 तरह जंक्शनों" के रूप में पहचान की ट्यूबों के ऊर्जावान अनुकूल स्वभाव, दिखाई देते हैं । Y-जंक्शन प्रत्येक ट्यूब के बीच लगभग १२० ° कोण के साथ तीन ट्यूबों को जोड़ता है, जहां सबसे कम कुल ट्यूब लंबाई सुरक्षित किया जा सकता है । वाई-जंक्शनों, जो एक अंत बिंदु के अधिकारी नहीं है और इसके बजाय कई नैनोट्यूब के बीच तैनात हैं, टिकी नहीं हैं । यह केवल Y-जंक्शन प्रकार है कि फिसलने प्रदर्शन कर सकते है (नीले तीर, चित्रा 1आर) । चित्रा 1R और 1sमें दिखाया गया है, दो व्यक्तिगत वाई जंक्शनों ( चित्रा 1एसमें नीले तीर) के गठन में एक उच्च स्थिर चौराहे के परिणाम के साथ एक Y-जंक्शन के फिसलने. चित्र1एस पर डैश्ड व्हाइट लाइन आरोपित चित्र 1आरमें ट्यूबलर नेटवर्क टुकड़ा के समोच्च का प्रतिनिधित्व करता है । Y-जंक्शनों का एक अंश अंत टर्मिनल के पास ( चित्रा 1टीमें पीला तीर), जो समय के साथ, अंततः वापस लेना (चित्रा 1यू) । एक वी के परिवर्तन जंक्शन के एक एकल, सीधे ट्यूब के लिए दो लाइन क्षेत्रों के चौराहे बिंदु के आधार पर और वी आकार बनाने ट्यूबों में से एक के पुनर्कर्षण द्वारा चित्रा 1v और 1W में देखा जा सकता है और चित्रा 1एक्स और 1Y, क्रमशः ।

Figure 1
चित्रा 1 : एर के लिए लिपिड जमा परिवर्तन की तरह ट्यूबलर नेटवर्क । (क-च) लेजर स्कैनिंग प्रारंभिक नमूने में बुलबुले के फोकल माइक्रोग्राफ, 3 डी में निर्माण किया । (A-C) Multilamellar लिपिड पुटिका (MLV, लिपिड जमा) में xyz, xz, और yz विमानों, क्रमशः । (डी एफ) एक विशाल unilamellar पुटिका (गुव) के समान विचार । GUVs का भीतरी भाग खोखला है, जो लिपिड पदार्थ को काफी सीमित फैलने के लिए बनाता है । इस विधि के लिए उपयोगी लिपिड जलाशयों इसलिए कर रहे हैं MLVs. (जी) अवलोकन चैंबर के चित्रण पर घुड़सवार एक औंधा माइक्रोस्कोप जिस पर बफर और लिपिड जमा कर रहे हैं. चैंबर एक PDMS फ्रेम एक अल2हे3 लेपित coverslip पर पालन से बना है, एक खुला खंड शीर्ष प्रदान । (H-J) 2 Ca की उपस्थिति में MLV की फैल घटना का चित्रण+। (ज) अल2ओ3के साथ संपर्क करने पर, MLV अनायास एक परिपत्र, डबल लिपिड bilayer झिल्ली (DLBM) के रूप में फैलता है । (I) xz विमान, जहां परिधि रोलिंग गति प्रदर्शन में DLBM के योजनाबद्ध पक्ष को देखने । MLV (डी = 5-15 µm) और DLBM (मोटाई = 10 एनएम) पैमाने के लिए तैयार नहीं हैं । (ञ) ऊपर से देखने से फैलने वाली DLBM का एक फोकल micrograph । (K) इस प्रोटोकॉल के मुख्य चरण का वर्णन करता है, जहां बफर एक Ca2 + chelating एजेंटों युक्त करने के लिए विमर्श किया है, बाधा फैल, MLV को DLBM के कर्षण के कारण, और लिपिड नैनोट्यूब के गठन के लिए अग्रणी । (एल-वाई) वर्णित विधि से प्राप्त नैनोट्यूब नेटवर्क्स के माइक्रोग्राफ । (ठ) किसी फ़्रेम में चिह्नित (M) में क्षेत्र का क्लोज़-अप । (एल और एम) में सतत उज्ज्वल लाल क्षेत्रों (भी एम में एक नीली डैश्ड लाइन के साथ चिह्नित) DLBM प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके विपरीत वृद्धि करने के लिए (N और O) में एक ट्यूबलर नेटवर्क के micrograph औंधा है । (P और Q) 3 एच और 20 मिनट (आर वाई) प्रतिनिधि ट्यूबलर पुनः व्यवस्था के पाठ्यक्रम पर एक झिल्ली क्षेत्र पर ट्यूबलर घनत्व की कमी का चित्रण । (आर एण्ड एस) फिसलने, (टी और यू) एक वाई के संक्रमण-जंक्शन के वी-जंक्शन एक अंत बिंदु के कर्षण से, और (v और डब्ल्यू) de-एक मोड़ के पिन, एक वी के उंमूलन में जिसके परिणामस्वरूप जंक्शन । (X और Y) एक अंत बिंदु के कर्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : संभावित नकारात्मक परिणाम । (A और B) Rupturing के आदान-प्रदान से पहले एक लंबे समय तक प्रतीक्षा के कारण बाहर की झिल्ली का बफर । टूटना क्षेत्रों, जहां समीपस्थ झिल्ली दिखाई हो जाता है, की तुलना में अंधेरे क्षेत्रों के रूप में दिखाई नहीं बाहर की झिल्ली क्षेत्रों । पैनल बी के लिए इनसेट micrograph पर नीले तीर के साथ प्रकाश की तीव्रता से पता चलता है । झिल्ली के टूटना क्षेत्रों की तीव्रता (समीपस्थ/एकल bilayer दिखाई बन जाता है) की आधी तीव्रता से मेल खाती है (बाहर की और डबल bilayer) । (ग) एक सूखी लिपिड प्रेक्षण कक्ष से सभी तरल को हटाने का एक परिणाम के रूप में गठित पैच की उपस्थिति । (डी और ई) स्वचालित पिपेट के माध्यम से बफर के तेजी से विनिमय द्वारा झिल्ली के विघटन । में (D), MLV 2 MLVs में विभाजित है, एक गैर परिपत्र, विकृत लिपिड पैच करने के लिए अग्रणी. (ङ) में, chelator-HEPES बफर के मजबूत इंजेक्शन के द्वारा बनाई गई प्रवाह (तीरों) का पैटर्न, tubulated झिल्ली संरचना पर प्रतिबिंबित होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

निंन चर्चा में, महत्वपूर्ण चरण, संभावित संशोधन, और प्रोटोकॉल की सीमाएं बताई गई हैं । पहला महत्वपूर्ण कदम अवलोकन कक्ष की उचित विधानसभा है, यह देखते हुए कि PDMS फ्रेम के अल2ओ3 सतह को आसंजन आंतरिक रूप से कमजोर है । मामले में जहां फ्रेम सब्सट्रेट करने के लिए ठीक से पालन नहीं करता है, सामग्री अवलोकन कक्ष से रिसाव होगा और प्रयोग एक पड़ाव पर आ जाएगा । मुख्य कारक है कि सतह और फ्रेम के उचित सील बाधा 1 हैं) की पूरी तरह से सफाई की कमी (फिर से इस्तेमाल किया) PDMS फ्रेम और 2) हवा के बुलबुले कि कभी कभार फ्रेम और सब्सट्रेट के बीच फंस मिलता है । एक नए तैयार या अच्छी तरह से साफ PDMS फ्रेम का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । फ्रेम से पहले और isopropanol के साथ प्रत्येक उपयोग के बाद कुल्ला किया जाना चाहिए, DI पानी के साथ धोने और नाइट्रोजन के साथ उड़ाने सुखाने के बाद । अल2हे3 सतहों किसी भी पूर्व सफाई की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि वे एक cleanroom वातावरण में गढ़े और उपयोग तक सील कंटेनरों में रखा जाता है । अल2ओ3के amphoteric प्रकृति के कारण, यह दृढ़ता से अंलीय या बुनियादी समाधान के लिए उजागर नहीं किया जाना चाहिए । प्रेक्षण कक्ष के लिए अंय डिजाइन, व्यक्तिगत सेटअप की पहुंच के आधार पर नियोजित किया जा सकता है । इस चैंबर की महत्वपूर्ण सुविधाओं के लिए इस्तेमाल किया समाधान और नमूनों के संबंध में खुले शीर्ष और फ्रेम सामग्री की निष्क्रियता से तरल नमूना के लिए स्वतंत्र पहुँच रहे हैं. वे एक मात्रा ०.५ से 1 मिलीलीटर को समायोजित करना चाहिए के रूप में चैंबर आयाम भी एक महत्वपूर्ण कारक हैं । के बाद से इस्तेमाल किया सतहों आमतौर पर मानक आकार coverslips (24 x ६० mm) हैं, चैंबर की मात्रा ज्यादातर फ्रेम की मोटाई द्वारा निर्धारित होता है । हमारे ज्ञान के लिए, आकार और गहराई जो नमूना आम तौर पर इस प्रोटोकॉल में संभाला मात्रा को समायोजित कर सकते है के साथ स्पेसर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं । इसलिए हम एक नमूना चैंबर फ्रेम के निर्माण और विधानसभा के विवरण के लिए प्रोटोकॉल में एक वर्ग को समर्पित किया है ।

इस प्रोटोकॉल में अंय महत्वपूर्ण चरण बफ़र exchange है । इस चरण में एक चुनौती इस exchange को निष्पादित करने के लिए आवश्यक समय है । अल2ओ3 सब्सट्रेट के साथ संपर्क पर MLV के प्रसार पल है, और DLBM के निरंतर विस्तार अपने rupturing की ओर जाता है, प्रयोग समाप्त (चित्रा 2ए, बी) । इसलिए, प्रसार लगातार निगरानी की जानी चाहिए, और बफर एक्सचेंज एक समय पर तरीके से किया जाना चाहिए । विनिमय भी जल्दी से प्रसार का आरंभ करने के बाद नहीं किया जाना चाहिए, आदेश में झिल्ली पैच एक इष्टतम आकार (व्यास में 100-200 µm) तक पहुंचने के लिए अनुमति देने के लिए । दूसरी ओर, सतह पर सतत आसंजन उच्च झिल्ली तनाव का कारण बनता है, जो rupturing की ओर जाता है । इस प्रकार, सभी झिल्ली पैच अंततः टूटना अगर प्रसार बाधित नहीं है । rupturing के समय प्रत्येक पैच के लिए अलग है, क्योंकि यह MLV और उसमें लिपिड की पहुंच के आकार और आंतरिक संरचना पर निर्भर करता है । इसलिए, विनिमय के क्षण एक timepoint है जिस पर संयुक्त राष्ट्र के इष्टतम आकार के साथ टूटना पैच पूरी आबादी के बहुमत का प्रतिनिधित्व करने के लिए व्यवस्था की जानी चाहिए । बफ़र exchange चरण में किसी अंय चुनौती को हटाने और बफ़र्स के अलावा की दर है । इस प्रतिस्थापन प्रदर्शन भी तेजी से अंतिम झिल्ली संरचनाओं (चित्रा 2सी ई) पर एक हानिकारक प्रभाव पड़ता है । 2 Ca के अत्यधिक निष्कर्षण+-HEPES बफर सब्सट्रेट पर एक पतली तरल फिल्म छोड़ने के बिना, परिणाम सूखे और अचल विकृत झिल्ली पैच (चित्रा 2सी) में । यहां तक कि अगर तरल की एक उचित मात्रा में सतह पर बनाए रखा है, अचानक Chelator-HEPES बफर के अलावा भी झिल्ली संरचनाओं के गड़बड़ी का कारण बनता है । चित्रा 2 डी,ई hydrodynamically बाधित झिल्ली पैच के ठेठ उपस्थिति से पता चलता है । समग्र रूपात्मक व्यवधान जरूरी अंतिम संरचनाओं के गतिशील गुणों को प्रभावित नहीं करता है (यानी, शेष क्षेत्रों में ट्यूबलर पुनर्व्यवस्थाएं अभी भी हो जाएगा) । हालांकि, यह विकृत संरचनाओं पर सामग्री परिवर्तन का पालन करने के लिए मुश्किल हो जाएगा । उदाहरण के लिए, चित्रा 2डीमें, यह दिशा निर्धारित करने के लिए मुश्किल होगा, जो MLV DLBM मुकर जाती है ।

एक प्रोटोकॉल का संभव संशोधन लिपिड संरचना का इस्तेमाल किया है । मुख्य ध्यान फॉस्फोलिपिड पर किया गया है कि स्तनधारी और16 खमीर में एर रचना हावी (ई। जी, phosphatidylcholine (पीसी), phosphatidylethanolamine (पीई), और phosphatidylinositol (PI) । मूल प्रयोगों पीसी और PI मिश्रण4का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । प्रस्तुत परिणामों में, पीसी और डोप और पीई के व्युत्पंन का एक मिश्रण का इस्तेमाल किया गया था । हालांकि, नहीं सभी मनमाने लिपिड रचनाएं इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त ट्यूबलर संरचनाओं बनाने के लिए पाया गया है । एक अंय प्रयोग की जांच लिपिड मिश्रण के कुछ कुल दिल निकालने, सोया बीन निकालें ध्रुवीय, ई. कोलाई निकालें ध्रुवीय, stearoyl के साथ पीसी के मिश्रण-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) में बदलती अनुपात, और मिश्रण पीसी-पीई-PI-Posphatidyl serine (पी एस) के अनुपात में बदलती । चूंकि ट्यूबलर झिल्ली संरचनाओं उच्च वक्रता के अधिकारी और व्यक्तिगत लिपिड अणुओं की विशेष व्यवस्था की आवश्यकता होती है, यह उम्मीद की जाती है कि मनाया घटना लिपिड रचना-विशिष्ट है ।

एक और इस प्रोटोकॉल में लागू संशोधन सतह निर्माण के लिए विधि है । यहां, एलड अल2हे3 लेपित coverslips के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह मूल रूप से रिपोर्ट की गई जमाव विधि से भिंन है, प्रतिक्रियाशील sputtering4। हालांकि यह इंगित करता है कि एक वैकल्पिक सतह निर्माण विधि अभी भी एर के लिए नेतृत्व कर सकते है tubulation की तरह, एक महत्वपूर्ण सीमा को सतह सामग्री की विशिष्टता प्रतीत होता है । आसंजन के प्रसार और शक्ति के मोड सतह सामग्री है, जो इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत, गीला, hydrophobicity, और सतह की किसी न किसी तरह के रूप में प्रभाव कारकों के गुणों पर अत्यधिक निर्भर है । अल2हे3 सतहों इष्टतम आसंजन शक्ति प्रदान करते हैं, और लिपिड फिल्मों दोनों दृढ़ता से एक डबल लिपिड bilayer झिल्ली के रूप में फैल और2 + आयनों Ca के हटाने पर ट्यूबलर नेटवर्क फार्म अलग करने के लिए पर्याप्त संलग्न कर सकते हैं । हम पहले सिइओ2, जिसमें multilamellar एक डबल लिपिड bilayer झिल्ली के रूप में फैल बुलबुले के साथ ही प्रयोग परीक्षण किया है, लेकिन कोई ट्यूबलर नेटवर्क गठन chelators17के अलावा पर मनाया गया । De-लगाव और ट्यूब गठन केवल अल2हे3 या प्लाज्मा धंसा अल18पर मनाया जाता है । हमारी जांच से पता चला कि इस तरह के एक घटना के लिए अग्रणी योगदान पैरामीटर सतहों के जीटा क्षमता थी, जिसके लिए अल और अल2ओ3 शूंय के करीब थे (एमवी) और2 सिइओ काफी नकारात्मक । borosilicate के जीटा संभावित सिइओ219के समान है; इसलिए, borosilicate पर लिपिड फिल्मों के आसंजन समान रूप से मजबूत और अपरिवर्तनीय है । वास्तव में, borosilicate सतहों के साथ multilamellar लिपिड जलाशय संपर्क आम तौर पर तत्काल टूटना और एकल लिपिड bilayers20के गठन की ओर जाता है । इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक अल2ओ3 सतहों आसानी से या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं । वे कर सकते हैं, तथापि, कस्टम-विशेषता कांच और सब्सट्रेट निर्माताओं से आदेश दिया । पतली फिल्म निर्माण उपकरणों के साथ cleanroom सुविधाओं के लिए उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है ।

अंय मौजूदा नीचे-तरीकों को एर-ट्यूबलर नेटवर्क की तरह2,10 प्रोटीन शामिल करने के साथ ही रासायनिक ऊर्जा के इनपुट (जैसे, GTP और एटीपी) । Rapoport और सहकर्मियों2 ने एर-फॉस्फोलिपिड और GTP के साथ-साथ ईआर में मौजूद झिल्ली-झुकने वाले प्रोटीन को मिलाकर इन विट्रो में ग् coverslips पर ईआर-नेटवर्क्स के गठन की सूचना दी । Bachand एट अल द्वारा काम करते हैं । 10 से पता चलता है कि कैसे इस तरह के गतिशील ट्यूबलर नेटवर्क ऊर्जा स्रोत के रूप में आणविक मोटर्स और एटीपी का उपयोग करके बनाया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल प्रस्तुत झिल्ली प्रोटीन या कार्बनिक यौगिकों के hydrolysis ऊर्जा के लिए की आवश्यकता नहीं है । केवल आवश्यक घटक ठोस सब्सट्रेट और फॉस्फोलिपिड हैं । शुद्धि और प्रोटीन की निकासी की आवश्यकता नहीं है । इस प्रोटोकॉल के गठन के अणुओं की सादगी के संदर्भ में प्रदान करता है, सबसे बुनियादी एर मॉडल ।

इस बुनियादी के साथ, लिपिड आधारित ईआर मॉडल की स्थापना की, एर जोड़कर जटिलता के निर्माण जुड़े घटकों ब्याज की है, क्योंकि यह प्रणाली पर व्यक्तिगत प्रभावों की जांच में सक्षम बनाता है । वास्तविक एर नेटवर्क के समान, मॉडल में ट्यूबों गतिशील हैं । विकार और लेबल झिल्ली प्रोटीन, या ट्यूबलर नेटवर्क भर में फ्लोरोसेंट कणों के प्रवास, झिल्ली आंदोलन की दिशा के बारे में जानकारी दे सकते हैं । encapsulation और DLBM और ट्यूबों के अंदर फ्लोरोसेंट तरल पदार्थ की निगरानी परिवर्तन और intratubular सामग्री परिवहन के एक संभावित मानचित्रण के दौरान एक और ध्यान के रूप में काम कर सकते हैं । अंत में, 2d एर एक 3 डी चिकनी एर मॉडल की ओर इस प्रोटोकॉल से उत्पंन मॉडल से एक संक्रमण hydrogel आर्किटेक्चर में नेटवर्क के encapsulation के माध्यम से अपनाया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम स्वीडन में Chalmers प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय से पांडुलिपि पर अपनी अमूल्य टिप्पणी के लिए प्रो Aldo Jesorka धंयवाद । यह काम संभव वित्तीय सहायता के माध्यम से बनाया गया था अनुसंधान परिषद से प्राप्त नॉर्वे (Forskningsrådet) परियोजना अनुदान २७४४३३, यूिो: जीवन विज्ञान अभिसरण पर्यावरण, स्वीडिश अनुसंधान परिषद (Vetenskapsrådet) परियोजना अनुदान 2015-04561, साथ ही शुरू हुआ धन आणविक चिकित्सा नॉर्वे & के लिए केंद्र द्वारा प्रदान की गणित और प्राकृतिक विज्ञान के संकाय ओस्लो विश्वविद्यालय में ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pear-shape flask 10 mL Lenz Laborglasinstrumente 3.0314.13  In which the lipid mixture is prepared
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) Hamilton P/N81520 For transfer of the chloroform to beaker
Custom large hub needle Gauge 22 S Hamilton 7748-18 Removable needle for syringe specified in row 3
Hamilton 250 µL glass syringe Hamilton 7639-01 Used for transfer of lipids in chloroform to the flask
Large hub Gauge 22 S Hamilton 7780-03 Removable needle for syringe specified  in row 5
Hamilton 50 µL glass syringe Hamilton 7637-01 Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask
Small hub Gauge 22 S Hamilton 7770-01 Removable needle for syringe specified in row 7
Chloroform anhydrous (≥99%) Sigma-Aldrich 288306 Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) Avanti Polar Lipids Inc 441601 phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) Avanti Polar Lipids Inc 850725 phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) Avanti Polar Lipids Inc 840044 alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017)
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) T1395MP Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Fischer 88870006 To warm glycerol in order to decrease its viscosity
Glycerol for molecular biology (≥99%) Sigma Life Science G5516 For lipid preparation
PBS buffer  (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 Used to prepare the lipid suspension 
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) Sigma Life Science T1503 Used to prepare PBS buffer
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) Sigma-Aldrich P5629 PBS buffer ingredient
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) Sigma Life Science 63138 PBS buffer ingredient
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) Sigma-Aldrich 795488 PBS buffer ingredient
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) Sigma-Aldrich E4884 PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient
Ultrasonic cleaner USC-TH VWR 142-0084 Ultrasonication of rehydrated lipids
Rotary evaporator  -  Büchi rotary evaporator Model R-200  Sigma Z626797  For evaporation of chloroform
Pressure meter - Vacuum regulator IRV-100 SMC IRV10/20 For controlling the pressure value during lipid dehydration
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water
 HEPES ≥99.5% (titration) Sigma Life Science H3375 HEPES-buffer ingredient
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) Sigma Life Science S3014 HEPES-buffer ingredient
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) Sigma Life Science C5670 To prepare Calcium-HEPES buffer
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 Used to promote the formation of tubular networks.  Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water
 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) Sigma Life Science 14513 Chelator-HEPES buffer ingredient
Sodium Hydroxide  Sigma 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
pH meter accumet™ AE150 pH Fisher Scientific 1544693 Used to measure the pH of all buffers
Glass petri dish  VWR HECH41042012 6 cm, used for making the PDMS sheet
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) Sigma-Aldrich 221473 To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet
Isopropanol prima ren 99.5% Antibac AS 600079 KOH solution ingredient
Heating and drying oven - venticell MMM Medcenter Einrichtungen GmbH  MC000714 For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS
Dichlorodimethylsilane ≥99.5% Sigma-Aldrich 440272 Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared
Vacuum pump Cole-Parmer EW-79202-05 Connected to desiccator 
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent Dow corning 24236-10 Kit to make PDMS solution
Sylgard 184 Silicone elastomer base
Disposable scalpel Swann-Morton 11798343 Used to cut the PDMS
Cover slips Menzel -Gläser   MEZ102460 24x60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3
Atomic layer deposition system Beneq TFS200 (model number) Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass
Ellipsometer  J.A. Woollan Co. Alpha-SE (model name) System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface
Laser scanning confocal  microscope  Leica Microsystems Leica TCS SP8 X Microscope used for visualization of the experiment
Objective 40x, 1.3 NA Leica Microsystems 1550635 Used for visualization of the experiment
White light laser source Leica Microsystems Leica TCS SP8 X For excitation of the membrane fluorophore

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References

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अभियांत्रिकी अंक १४३ Endoplasmic जालिका फॉस्फोलिपिड नैनोट्यूब लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क डबल लिपिड bilayer पतली फिल्म साठा एल्यूमिनियम ऑक्साइड
सहज गठन और Endoplasmic जालिका के लिए एक नीचे-अप मॉडल के रूप में कृत्रिम लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क की पुनर्व्यवस्था
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Köksal, E. S., Belletati, P.… More

Köksal, E. S., Belletati, P. F., Reint, G., Olsson, R., Leitl, K. D., Kantarci, I., Gözen, I. Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum. J. Vis. Exp. (143), e58923, doi:10.3791/58923 (2019).

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