Automatically Generated

Summary

Hier beschrijven we het gebruik van een hogere gegevensdoorvoer microfluidic bioreactor in combinatie met een fluorescente microscoop voor de analyse van shear stress effecten op Pseudomonas aeruginosa biofilms uiting van groen fluorescent eiwitten, met inbegrip van instrument instellen, de bepaling van biofilm dekking, groei en morfologische eigenschappen.

Abstract

Een hogere gegevensdoorvoer microfluidic in vitro bioreactor fluorescentie microscopie gekoppeld is gebruikt om te studeren bacteriële biofilm groei en morfologie, met inbegrip van Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Hier beschrijven we hoe het systeem kan worden gebruikt om te studeren de kinetiek van de groei en de morfologische eigenschappen zoals de oppervlakteruwheid en textuur entropie van P. aeruginosa stam PA01 die een verbeterde groen fluorescent proteïne (PA01-EGFP uitdrukt ). Een gedetailleerd protocol zal beschrijven hoe om te groeien en het zaaizaad PA01-EGFP culturen, hoe u omhoog de Microscoop en de autorun, en voeren de beeldanalyse om te bepalen van groei en morfologische eigenschappen met behulp van een verscheidenheid van shear krachten die worden gecontroleerd door de microfluidic apparaat. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van een techniek ter verbetering van de studie van PA01-EGFP biofilms die uiteindelijk kan worden toegepast jegens andere stammen van bacteriën, schimmels of algen biofilms met behulp van de microfluidic platform.

Introduction

Hier zullen we laten zien van een methode voor het meten van het effect van shear stress op de vorming van TL Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 biofilms met behulp van een geautomatiseerde hoger-throughput microfluidic systeem.

Biofilms zijn gemeenschappen van micro-organismen, zoals bacteriën, georganiseerd door een polymere extracellulaire stof die zijn aangesloten op een drager, en worden meestal gevonden op het raakvlak tussen een vloeistof en een vaste oppervlakte¹. Deze biofilm gemeenschappen kunnen gunstig zijn voor het milieu, zoals verbetering waterkwaliteit in watervoorziening lijnen en bioremediatie van weerbarstige verbindingen^2,3. Biofilms kunnen echter ook zeer schadelijk voor de gezondheid van de mens met ongewenste gevolgen worden. Bijvoorbeeld, zijn medische hulpmiddelen, zoals heup en knie implantaten, een soort oppervlak indien accumulatie van biofilm is een uitdaging geweest en veroorzaakt ernstige medische complicaties^4,5. Biofilms kunnen ook natuurlijke watersystemen, zoals rivieren, meren, invoeren en watervoorziening pijpen leidt tot verontreiniging van de bacteriën in drinkwater als gevolg van infecties^6,7,8te infiltreren. Biofilms gevormd in mariene milieus voldoen aan schepen en andere door de mens veroorzaakte substraten en presenteren van een grote economische en ecologische probleem zoals verhoogde wrijving leidt tot het brandstof verbruik^9,10te verhogen. Antimicrobiële coatings, zoals Tributyltin, zijn ontwikkeld om deze problemen te voorkomen, maar zijn giftig voor het zeeleven¹¹.

P. aeruginosa is een gramnegatieve bacterie met hoge bloeiende mogelijkheden in een verscheidenheid van omstandigheden op ecologisch en nutrimental¹². P. aeruginosa is een veelvoorkomende oorzaak van de Gemeenschap – en ziekenhuisinfecties en gevonden worden nauw gekoppeld aan zijn verwondingen, zoals ernstige brandwonden en immuungecompromitteerde hosts, zoals in cystic fibrosis (CF)^{5,12, 13}, AIDS en kanker patiënten^5,13. De vorming van biofilms P. aeruginosa is zwaarst verbonden met CF, waar chronische Long infecties de belangrijkste doodsoorzaak voor deze ziekte^{5 zijn}.

Een referentiestam van P. aeruginosa, PA01, in dit verslag wordt gebruikt en is genetisch gemodificeerd om uit te drukken een verbeterde groen fluorescent proteïne (PA-EGFP). EGFP vertegenwoordigt een gemuteerde vorm van GFP met grotere fluorescentie-eigenschappen waarmee in situ biofilm analyse met behulp van fluorescentie microscopie^14,15,16. Dit type fluorescentie analyse is gunstig voor de studie van biofilms omdat GFP niet aanzienlijk met celgroei en functie^{17 interfereert}. Bijvoorbeeld, groeide Escherichia coli cellen die waren gelabeld met GFP goed en continu zonder eventuele toxische effecten in vergelijking met de controle bacteriën¹⁷hebben geleden. Andere verslagen staving van deze bewering^18,19,20. Bovendien, het gebruik van een fluorescerende verslaggever zoals EGFP is snel en eenvoudig, maar alleen levende cellen zal gemeten worden omdat dode cellen snel ophouden te lichten van²¹.

Biofilms kunnen groeien onder verschillende milieuomstandigheden, met inbegrip van die met een verschillende spuitsnelheid. Bijvoorbeeld kunnen films groeien in hoge shear stress, zoals in rivieren, waar de stroom van hoge waterstanden tot een grotere microbiële diversiteit^{22 leiden}. Tegendraads, stilstaand water in vijvers of mondelinge biofilms ervaring een veel lagere schuintrekken kracht²³. Naast debiet, zijn er andere factoren die van invloed zijn biofilm adhesie, met inbegrip van de oppervlakteruwheid en hydrophobicity, samenstelling van de media, en zelfs de bacteriële cel oppervlakte^{1,4,7, 24}. voorwaarden ook variatie in de ruimtelijke structuur of de morfologie van een biofilm kunnen veroorzaken. Dit omvat omgevingscondities zoals schuifspanning uitgeoefend door een bewegende vloeistof of kleurovergangen in de beschikbaarheid van nutriënten en biologische factoren zoals de soorten presenteren in het systeem, beweeglijkheid van cellen en de specifieke eiwitten in de extracellulaire aanwezig polymere stof^25,26,27. Onder bepaalde omstandigheden zullen de biofilm gazon-achtige (glad en plat), terwijl onder andere omstandigheden de biofilm zal worden ruwe, pluizig of zelfs paddestoel-achtige²⁸. Terwijl de kwalitatieve verschil tussen biofilm gazons en paddestoel structuren duidelijk kan worden gezien in de microscopische beelden, vereist de relatie tussen film structuur en biologische processen binnen de film systematische en kwantitatieve methoden voor het beschrijven van de morfologie. Morfologische eigenschappen voorgesteld voor studie door onderzoekers behoren Fractale dimensie, diffusional lengte, porositeit, microcolony gebied op het substraat, microcolony volume, ruwheid coëfficiënt en textuur entropie^29,30 .

Bioreactoren worden gebruikt in de studie van biofilms na te bootsen van echte leven voorwaarden³¹. Infuus stroom reactoren (DFR) vertegenwoordigen een lage-shear omgeving waar voedingsstoffen in media stromen langzaam over cellen die zijn verbonden aan een oppervlak na verloop van tijd om te vormen van een biofilm met een hoge cel dichtheid³². CDC reactoren zijn bioreactoren waarmee een hoge shear stress vloeistof omgeving door tegengaan van een opzwepende staaf die continu binnen de media draaien is tank³³gevuld. Deze soorten bioreactoren zijn eenvoudig op te zetten, maar ze zijn beperkt in omvang vanwege de relatief lage steekproefgrootte, de hoge consumptie van media, grote hoeveelheden biohazardous afval geproduceerd uit media druppelen stromen variërend van 125 µL/minuut voor infuus stroom reactoren meer dan 1 mL/min voor CDC reactoren, en de noodzaak om de autoclaaf grote hoeveelheden afval-en glaswerk en media³⁴. Biofilms groeien niet gelijkmatig over het oppervlak in een infuus stroom reactor omdat de lage schuintrekken van media veroorzaakt achterstand langs de grotere conglomeraten van P. aeruginosa bacteriën dus, de biofilm groei niet heel glad is en de ongelijke monsters mag gemakkelijk geanalyseerd met fluorescentie microscopie^35,36 .

Enkele gemeenschappelijke bioreactor beperkingen worden overwonnen met behulp van een middellange-throughput microfluidic bioreactor, waar alleen milliliter van media nodig zijn, en de reactie-platen zijn klein en gemakkelijk wegwerp na autoclaaf³⁷. Bovendien, afhankelijk van het aantal putten, vele replicaties kunnen worden uitgevoerd in slechts één reactor uitvoert, die voorziet in voldoende hoeveelheid gegevens zinvolle statistische analyse uit te voeren. In Figuur 1staan de verschillende onderdelen van het systeem van de microfluidic-microscopie voorzien in gecontroleerde omstandigheden, met inbegrip van temperatuur en tarief^38,39,40, stromen. De bioreactor gaat gepaard met fluorescentie microscopie te visualiseren van de fluorescentie van de EGFP tag in PA01 onder laag toegepast door hoge shear voorwaarden die zal meer realistische scenario’s die worden aangetroffen in de omgeving of op het gebied van biomedische na te bootsen.

Figuur 1 : Individuele componenten van het systeem Microfluidic. De afzonderlijke componenten staan van links naar rechts: 1. CCD Camera, 2. hoge resolutie Inverted Microscoop met geautomatiseerde toneel, geautomatiseerde fluorescentie Module en Autofocus Module, 3. plaat fase 4: Imaging system Interface, 5: handleiding Microscoop fase Controle, 6: Damp Trap, 7: Imaging systeem Controller (inclusief temperatuur Controller), 8: Hardware Controllers, 9: fluorescentie Controller, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: externe harde schijf voor de opslag van de beelden, 12: PC-werkstation. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Een uittreksel van de microfluidic plaat is afgebeeld in Figuur 2. De meest gebruikte platen bestaan uit 48 putten. Een experiment vereist een inlaat en een uitlaat wells, een totaal van 2 putten. Dit zorgt voor 24 gelijktijdige experimenten die kunnen worden uitgevoerd met verschillende experimentele omstandigheden, zoals bacteriestammen, antimicrobiële behandelingen en media varieerde van kanaal tot kanaal en schuintrekken stroom voor elke kolom van zes kanalen gecontroleerd. De experimentele temperatuur wordt ook geregeld met één temperatuur instelling in de plaat. De microfluidic kanalen tonen dat elk kanaal heeft een serpentine streek om te zorgen voor voldoende tegendruk en gecontroleerde schuintrekken.

Figuur 2: visualisatie van de microfluidic kanalen en kijkvenster. Twee inlaat en uitlaat putten met de kanalen van de microfluidic verbinden worden gemarkeerd met rode en groene kleurstoffen. De kleurstof maakt een serpentine regio zichtbaar in elk kanaal die voldoende tegendruk en gecontroleerde schuintrekken tijdens vloeistofstromen worden gemaakt. Elke weergavekanaal (binnen de rode cirkel) kan worden beeld met gewenste golflengten. Weergegeven zijn helder veld (boven) en TL (onder) microscopie beelden van één kanaal met een PA01-EGFP biofilm met behulp van een 20 X doelstelling. Schaal bar = 80 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Een stap voor stap handleiding vindt waarmee gebruikers van microfluidic bioreactoren die zijn gekoppeld aan fluorescentie microscopie te voeren roman biofilm experimenten met behulp van verschillende schuintrekken omgevingen. Deze methode zal toestaan voor de uitbreiding van experimenten met andere micro-organismen naast bacteriën, zoals schimmels en algen, die medische en milieu toepassingen^{41,42,43 hebben}. De gedetailleerde aanpak wordt beschreven hoe PA01-EGFP cultuur, enten van een 48-well-plate opzetten van de microfluidic apparaat en de software, de fluorescente microscoop, en zetten demonstreren de software analyse om te verkrijgen van de biofilm dekking, het groeitempo op jaarbasis, en morfologische eigenschappen zoals oppervlakteruwheid.

Protocol

1. Media voorbereiding Bereiden minimale media (MM) met 0,25% glucose. Om 1 L MM met 0,25% glucose, voegt u 200 mL steriele M9 zoutoplossing, 2 mL steriele 1 M MgSO4en 100 µL van steriele 1 M CaCl212,5 mL steriele 20% (m/v) glucose aan water (dH2van O) bij een eindvolume van 1 L. Vereiste media overbrengen in een steriele fles met behulp van steriele technieken. Het bedrag dat vereist afhankelijk van het aantal kanalen wordt gebruikt voor te bereiden. Elk kanaal vereist normaliter, 200 µL voor priming, 300 µL voor seeding en 1300 µL voor de 24 h-experiment. Plaats de fles in een incubator of water bad instellen op de experimentele temperatuur. De media moeten op de temperatuur van het experiment vóór gebruik te vermijden van bubbels vormen in de microchannels. 2. voorbereiding van een overnachting en experimentele cultuur van PA01-EGFP. Breng 15 mL van experimentele media in een steriele pistool kolf en inoculeren met één of twee kolonies van een agarplaat streaked met PA01-EGFP. Vouw de cultuur voor 12-16 h op een incubator/shaker tafel bij 37 ° C en 180-220 rpm. Het meten van de OD600 van de overnachting cultuur. Wanneer de OD600 groter dan 0,80 is, Verdun de overnachting cultuur om de definitieve OD van 0,8 met verse MM. plaats de experimentele cultuur in een incubator of waterbad bij 37 ° C, totdat die nodig zijn voor het zaaien van de microfluidic kanalen. Controleer de OD600 opnieuw onmiddellijk vóór het zaaien om ervoor te zorgen dat het is niet veranderd van het doel OD600, 0.8 in dit geval. 3. uitrusting opstarten Instellen van het systeem station volgens de gebruikershandleiding, vergelijkbaar met de setup in Figuur 1. Inschakelen om te voorkomen dat een fout in de verbinding van het instrument op de software, het instrument in de volgende volgorde:PC-werkstationFluorescentie Module. Controleer of dat de fluorescentie sluiter is ingeschakeld (blauw licht door sluiterknop op)Hardware ControllersImaging systeem Controller (Zie Tabel van materialen)CCD-CameraImaging Station (Microscoop)Opmerking: De temperatuur van de verhitte plaat moet worden aangepast aan de gewenste experimentele temperatuur. De beheertoepassing van start en voer het nummer van de plaat ligt op het etiket aan de zijkant van de plaat.Opmerking: Na het starten van de controle op aanvraag zal er twee aparte toepassingsvensters, één voor de software die de Microscoop/imaging software regelt en één voor de controlemodule waarmee de pomp en de interface van de goed-plaat. Dit is weergegeven in Figuur S1, waar het “Multi dimensionaal verwerving” menu is geopend op de top en de controlemodule een autorun is ingesteld op de bodem. 4. priming en zaaien de Microfluidic plaat Opmerking: De priming, zaaien, bacteriële bijlage en groei worden geïllustreerd in Figuur 3. Verwijder de 48-well microfluidic plaat uit de verpakking om ervoor te zorgen niet aanraken het glasoppervlak aan de onderkant van de plaat. Het glasplaatje aan de onderkant van de plaat goed met een lens weefsel, een lint doek of een lage-lint veeg schoon. Om de kanalen microfluidic prime, Pipetteer 200 µL van 37 ° C MM in de output Nou, voorzichtig om te voorkomen dat de bubbels. Plaats de plaat in de fase van de plaat en veeg de interface met ethanol, waardoor drogen, voordat het afdichten op het podium van de plaat. In de Handmatige modus op de controlemodule, vastgesteldop vloeistof als LB bij 37 ° C en Max Shear 5.00 dyne/cm2. Klik op de putten van de uitvoer om te activeren vloeien voort uit de uitvoer naar de input Nou, priming de kanalen. Na de 5 min priming, onderbreken de stroom voor het zaaien te bereiden. Zorgvuldig de plaat uit het werkgebied verwijderen en Pipetteer residuele media uit de uitvoer, maar niet het verwijderen van een van de media van de binnenste cirkel die tot de kanalen van de microfluidic leidt. Om het zaad van de experimentele kanalen, eerste Pipetteer µL van de 300 mm in de ingang goed gevolgd door pipetting 300 µL van de bacteriecultuur in de uitvoer in de uitvoer goed. Plaats de plaat terug in de fase van de plaat om ervoor te zorgen om de interface te vegen alvorens het op de plaat. Op de controlemodule, zich richten op een enkel kanaal met behulp van de live camera feed na het plaatsen van de fase van de plaat op het podium van de Microscoop. Terwijl het visueel controle door het levende voer, stroming 1,00-2.00 dyne/cm2 voor ongeveer 2-4 s dat cellen de experimenteel kanaal invoeren, maar niet in de serpentine kanalen te hervatten. Laat de plaat op het podium van de temperatuurregeling voor 1 h te voorzien in bijlage van de cel. Tijdens de 1 h incubatie, kan worden ingesteld in de controlemodule en Montage software voor de autorun (stap 5).Opmerking: De hoeveelheid tijd die nodig is voor het zaaien zal variëren met media en organisme, dus het moet nauwlettend worden gevolgd door het levende voer tot geoptimaliseerd en als een algemene tijd frame gebruikt. Zaaien in de plaat variëren die zou vereisen meer tijd van toegepaste stroom aan bepaalde kolommen van kanalen voor volledige zaaien. Na de periode van de bijlage, zachtjes verwijderen de plaat uit het werkgebied en Pipetteer de bacteriën uit de uitvoer eerst voorkomen van verstoring van het kanaal. Verwijder het medium van de input putten met een nieuwe Pipet tip. Figuur 3 : Experimental overzicht priming, zaaien, en de bevestiging van PA01-EGFP in de kanalen microfluidic. De priming zaaien en de bijlage is uiteengezet. De eerste stap van priming vereist verse media ingevoerd om de output. De seeding bestaat uit gelijke hoeveelheden media en bacteriële cultuur in de input en output wells, respectievelijk. De cultuur moet niet doorgeven van het segment van de weergave van het experimentele kanaal (rode lijn) om te voorkomen dat de serpentine kanalen verstopt. Na de incubatieperiode voorbij is, verse media voortdurend vloeit voort uit de inbreng, het bekijken kamer en in het stopcontact. Dit initieert de bijlage en de groei van de bacteriële biofilm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 5. het opzetten van de Software Open in de software, “Meerdere dimensionale overname” om te controleren de Beeldacquisitie Microscoop. Selecteer onder het menu “Main”, “Timelapse”, “Meerdere podium posities” en “Meerdere golflengten” (Figuur S1A). De instellingen Opslaan instelt, maak een eenvoudige Basisnaam, ervoor te zorgen dat de basisnaam van Increment als bestand bestaat is ingeschakeld. Klikt u op Map selecteren selecteert u de map waarin alle bestanden worden opgeslagen. Neem essentiële gegevens van het experiment in de Beschrijving. Onder het tabblad Timelapse wijzigt u de duur van de experimentele tijd tot 24 h. Als u wilt bepalen hoe vaak afbeeldingen zijn verworven, het Tijdsinterval instellen zodat de beelden worden elke 5 minuten gedurende het gehele experiment verworven. Het Nummer van de punten van de tijd automatisch aangepast met het instellen van parameters. Fase positie met behulp van de live camera feed in de heldere veld Microscoop, waardoor voor de juiste plaatsing en focus instelt. Beginnen met de 10 X doelstelling, focus op het midden van het kanaal, gelegen boven of onder de kanaalnummers gegraveerd op de plaat. Schakel over naar het 20 X doel, het vinden van de optimale weergavegebied en brandvlak binnen het kanaal. De positie toevoegen aan de lijst of de vooraf ingestelde kanaalpositie vervangen door de nieuwe instellingen. Stel het aantal golflengtes 3 onder het menu golflengten . Voor golflengte 1 (W1), selecteert u de FITC-100%-CAM met een belichtingstijd van 10 ms. Voor golflengte 2 (W2), selecteert u het helderveld 50% CAM 50% VIS met een minimale blootstellingstijd van 3 ms. voor golflengte 3 (W3), ingesteld als de filter Alle gesloten blijft dus geen licht op het laatste kanaal tussen overname tijden. Bij het instellen van de controlemodule, controleren om ervoor te zorgen dat de handleiding uitvoeren is gestopt. Stel een nieuw protocol voor 24u van tijdsduur, stroomt in de voorwaartse richting tegen het tarief van de gewenste schuintrekken in het menu Bewerken Autorun onder het tabblad Protocol Setup . Shear rate is gevarieerd om te bestuderen van het effect van biofilm groei met shear rate. Klik op toevoegen en Opslaan als het protocol. Maak een nieuwe reeks door het selecteren van LB@37degrees als de standaard vloeistof voor alle kanalen onder het tabblad Reeks Setup . Selecteer onder Stap iteratie 1, voor de kanalen 1-12, het protocol met de gewenste shear rate en in staat stellen alle kanalen. Voor kanalen 13-24, selecteert u het protocol met de tweede gewenste shear rate en in staat stellen alle kanalen. Selecteer toepassen en Opslaan als de sequentie. Selecteer de opgeslagen volgorde worden gebruikt voor de autorun in het menu Autorun . 6. getimede Biofilm groei Experiment Setup Pipetteer een maximaal 1300 µL van steriele MM in de ingang van de microfluidic plaat. Plaats de plaat terug op het podium van het bord en veeg de interface met ethanol, waardoor ethanol volledig drogen voor afdichting van de plaat. Plaatsen van de plaat etappe op het podium van de Microscoop, en zorg ervoor dat de netwerkprotocollen en sequence(s) correct zijn ingesteld. Selecteer starten om te beginnen de autorun snel gevolgd door te klikken op verwerven om te beginnen met de Microscoop foto collectie. De focus en de plaatsing van alle posities van de etappe tussen acquirements van de afbeelding aanpassen. Selecteer onderbreken en, met behulp van de live beeld modus in de heldere veld golflengte, selecteer Ga naar aan elke etappe posities bekijken. Nieuwe instellen door het selectievakje ingesteld op de huidige. Klik op hervatten vóór de volgende geplande Acquisitietijd. 7. Controleer en analyseren van afbeeldingsreeksen na de getimede Biofilm groei Experiment Herziening van elk kanaal na de 24 h open autorun, in de software, Multidimensionale gegevens bekijken, vindt u onder Hulpmiddelen voor analyse. Klik op Selecteer basis bestand | Selecteer map om te navigeren naar de map met de reeksen van afbeeldingen voor het experiment van belang. Selecteer in de lijst van gegevenssets in de map die wordt weergegeven, de naam van de gegevens van belang. Zodra de gegevens van belang is geselecteerd, klik op weergave om te controleren van deze gegevens. Selecteer een golflengte die gegevens onder golflengte venster (Figuur S2) bekijken. Test de Afbeeldingsvolgorde van de voor elk kanaal door te selecteren het kanaalnummer onder Fase positie en de video gebruiken voor het analyseren van de gegevens voor de 289 keer punten (ervan uitgaande dat beelden worden verkregen elke 5 min over een tijdsbestek van 24 uur). Neem nota van bruikbare groeigegevens.Opmerking: In elk kanaal, kijk voor de ontwikkeling van luchtbellen en klompen die de biofilm groei binnen het kanaal verstoren zal, gevolgen voor de gegevens. Echter, als deze zich verderop in de uitvoeren, gegevens vóór deze omstandigheden voordoen kunnen worden gevonden nuttig. Maak stapels van de beelden voor elk kanaal na herziening en selecteren van de gewenste gegevens voor de analyse. Selecteer onder het menu bestand Open speciale | Stack bouwen | Genummerde namen. In de Stack bouwen -venster, selecteer de Eerste afbeelding selecteren en selecteer vervolgens het eerste beeld voor de stack in de bestandsmap; Selecteer de knop Vorige afbeelding selecteren en selecteer vervolgens het bestand overeenkomend met het laatste beeld in de stack. Klik op OK om te openen de stack met alle afbeeldingen van het kanaal in chronologische volgorde. Stapels kunnen worden opgeslagen in het menu bestand , Opslaan als als TIFF-bestanden.Opmerking: Maak geen stapels met de beelden van de duim. Deze bestanden zijn niet zeer nuttig en kunnen worden verwijderd om ruimte op de harde schijf opslaan. Ook, worden afbeeldingsbestanden opgeslagen als volgt:BASIS NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #.07062018_W1FITC 100_s12_t112 is bijvoorbeeld voor het kanaal 12, tijdstip 112, afbeelding in het eerste golflengte-FITC 100% cameragegevens met de naam “07062018”. Tot slot Selecteer Opslaan als in het bestand drop-down menu de volgorde opslaan als een TIFF-stapel. Stapels kunnen ook worden bedekt en opgeslagen als een film. Dit wordt behandeld in stap 9. Kalibreren voordat het kwantificeren van de % oppervlakte dekking, de afstanden van de afbeelding. Klik onder Hulpmiddelen voor analyse, op Kalibreren afstanden. Selecteer de juiste kalibratie-meting en klik op toepassen op alle afbeeldingen openen. Terwijl de stack op het eerste beeld van de reeks is, klik op de knop van de drempel . Kunt Auto drempel voor licht objecten drempel voor fluorescent signaal (FITC golflengte) en Automatische drempel voor donkere objecten naar dorpel in helder veld. Pas de drempel naar de dekking die de dekking van de afbeelding aangeeft. Voor fluorescerende drempels, gebruik maken van een kanaal met niet-belichting fluorescerende cellen vast te stellen van de achtergrond signaal en de reeks de minimale drempelwaarde uit te sluiten van signaal gedetecteerd in kanalen met deze niet-belichting fluorescerende cellen om de signaal-meting doet overschat niet het gebied van fluorescentie. Dit afwijken van run naar run dus het is een goed idee om ten minste één, te gebruiken als niet meer, zender (s) voor niet-belichting fluorescerende besturingselementen. Voor lichte veld drempels, als alle cellen niet onder de handtekening oranje drempel vallen, past de maximale drempelwaarde, hetzij via de glijdende werkbalk of de Drempel Image (te vinden onder de Analysehulpmiddelen) gebruiken, zodat alle cellen zijn bedekt, maar een achtergrond is uitgesloten.Opmerking: Terwijl deze drempelwaarden zou idealiter worden gebruikt voor alle afbeeldingen in een stapel en voor alle kanalen, drempelwaarden voor één afbeelding/kanaal geselecteerd wellicht niet geschikt voor andere beelden of kanalen, dus dat de gebruiker wellicht de drempel bereik aanpassen periodiek. Om deze reden, is een goed idee om altijd de maximale en minimale drempelwaarden gebruikt moeten de gegevens moeten later worden herzien. Klik op Toon regio statistiekenom te kwantificeren van de dekking, onder Analysetools. Zorg ervoor dat Gebruik drempel wordt gecontroleerd, de Volledige afbeelding is geselecteerd, en controleer onder Verkregen gegevens, de gewenste metingen/instellingen zijn geselecteerd (drempel gebied, gemiddelde, standaarddeviatie, min, max en % drempel gebied). Klik op Logboek openen en zorg ervoor dat DDE-bestand is geselecteerd voordat u op OKklikt. Selecteer Microsoft Excel en klik op OK. In het werkblad dat wordt geopend, klikt u Logboekgegevens automatisch opnemen de afmetingen van de afbeelding wordt geanalyseerd. Laat dit werkblad open en gebruiken hetzelfde vel te verzamelen van alle afbeeldingsgegevens analyse voor één stapel. In de stack, ga naar het vierde beeld en de drempel tot de optimale instellingen. Klik op de Logboekgegevens in het Toon regio statistieken scherm en de waarden worden vastgelegd in het werkblad. Herhaal dit voor de analyse van beelden elke 15 min. 8. andere analyse met inbegrip van morfologie en oppervlak dekking maatregel met behulp van Python scripts uit de Biofilm morfologie Suite Installeer een distributie van Python 3.6 waarin standaard wetenschappelijke modules met behulp van een wetenschappelijke Python standaardverdeling zoals Anaconda, beschikbaar op https://www.anaconda.com/download. De Biofilm morfologie Suite van GitHub ophalen in een browser door te navigeren naar https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, dan Selecteer kloon of download (groene knop) en selecteer Download Zip. Unzip het bestand en de code-mappen verplaatsen naar een werkmap. Maatregel percentage thresholded dekking door de afbeeldingsstapel kopiëren naar de map “dekking”. Een terminalvenster gebruiken om te navigeren naar die map en vervolgens het script met de opdrachtpython bfCoverage.py tiffStackName.tifvanaf de command line interface, waarbij tiffStackName.tif de naam van het bestand met de TIFF-stack van beelden is. Een tekstbestand dat de dekking-metingen op elk tijdstip zal worden gemaakt met de naam tiffStackName.txt en een grafisch bestand met een perceel van dekking als functie van de tijd zal worden gemaakt met de naam tiffStackName.png. Gebruik dezelfde procedure in stap 8.3 hebt opgegeven voor het meten van de andere morfologische kenmerken: biofilm accumulatie, ruwheid coëfficiënt en textuur entropie. Het bfAcc.py script voor de meting van de accumulatie, het roughCoef.py-script voor het meten van de coëfficiënt ruwheid en het TEvsTime.py script gebruiken voor de meting van de textuur entropie. 9. andere softwaretoepassingen – Overlays en films maken Als meerdere golflengten worden gebruikt, maak overlay stapels met inbegrip van deze golflengten. Open alle stapels van belang en kalibreren van de afstand zoals gedaan in stap 7.6. Selecteer onder Hulpmiddelen voor analyse, Overlay afbeeldingen. Stel de bronnen als de stapels van belang. Klik op de regenboog cirkel in de FITC-stack, en selecteer groen kleur filter worden toegevoegd om te benadrukken deze golflengte. Gebruik de bal de overlay aanpassen zodat de FITC-stack herkenbaar in de beelden is. Nadat alle aanpassingen hebt doorgevoerd, Alle vliegtuigen voor beide stapels selecteren en klik op toepassen. Sla de overlays op dezelfde manier als beschreven in stap 7.5 stapels of als een film die is beschreven in stap 9.2. Als u wilt opslaan van stapels of overlays als een timelapse film, onder MM standaard en Stack, klik op de Film maken. Selecteer de bron als de stapel of overlay die gewenst is. Klik op Opslaan en opslaan als een Microsoft Video 1 met een kwaliteit instellen tussen 70-80.

Representative Results

Figuur 4 een toont het percentage thresholded gebied na verloop van tijd van een 24u op schuintrekken stromen van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2uitgevoerd. De biofilm dekking of procent drempel oppervlakte (C [%]) is verschillend voor alle instellingen van de drie schuintrekken. De biofilm dekking was snelste op 1.0 dyne/cm2 shear, waar de drempel gebied steeg van 2-5% tot 100% na 200 min van groei en een stationaire fase na 400 min te bereiken. Op 0.5 dyne/cm2, de biofilm dekking werd uitgesteld en begon te verhogen op 400 min 100% dekking na 800 min te bereiken. De laagste schuintrekken op 0.2 dyne/cm2 duidelijk de langzaamste toename van de dekking van de biofilm, waar procent dekking beginnen te stijgen op 500 min maar nooit buiten het gebied van 65% drempel bereikt. Deze resultaten aangegeven Schuintrekken een directe invloed gehad in de dekking van de oppervlakte van de biofilm. De hogere schuintrekken leek te zijn een meer optimale voorwaarde voor groei van de biofilm, eventueel wijten aan het feit dat de media de bacteriën met meer voedingsstoffen, verstrekt zodat de biofilm sneller kan vermenigvuldigen. Figuur 4: procentuele drempel gebied, totale biofilm accumulatie, ruwheid coëfficiënt, en textuur entropie. a) percentage drempel gebied (C [%]) na verloop van tijd met behulp van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2 over een 24-uurs periode. Gegevens is afkomstig van één kanaal voor elke voorwaarde schuintrekken. b) total biofilm accumulatie (relatieve maatregel) als een functie van de tijd met behulp van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2 over een 24-uurs periode. De zwarte lijnen zijn kleinste kwadraten past op een exponentiële model. Gegevens is afkomstig van één kanaal voor elke voorwaarde schuintrekken. c) ruwheid coëfficiënt van PA01-EGFP met behulp van shear stress waarden van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2 gecontroleerd van meer dan 24 h. gegevens is afkomstig van één kanaal voor elke voorwaarde schuintrekken. d) textuur entropie van PA01-EGFP met behulp van shear stress waarden van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2. Gegevens is afkomstig van één kanaal voor elke voorwaarde schuintrekken (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 b komt overeen met de bevindingen die zijn weergegeven in Figuur 4een. De biofilm accumulatie (N[rel]) werd gemeten op basis van de veronderstelling dat het GFP-signaal op een punt in een afbeelding evenredig met de dichtheid van de levende cellen op die positie is. Het blijkt dat de totale relatieve meting biofilm accumulatie verhoogd als een functie van de tijd met behulp van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2 over een 24-uurs periode, en het groeitempo van hoogste schuifspanning naar laagste schuifspanning daalde. Er is een duidelijke periode geven van exponentiële groei waaruit een kwantitatieve groei kan worden berekend. Figuur 4 c toont de ruwheid coëfficiënt (Reen) op schuintrekken stromen van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2. Oppervlakte ruwheid, gekwantificeerd door de ruwheid-coëfficiënt, meet de variantie in het profiel van de dikte van de film. De formele definitie is waar Tik het ik-th Laagdiktemeting, Teen is de gemiddelde dikte, en N is het aantal dikte meting30. De procedure die wordt beschreven in dit onderzoek meet de dikte levende cellen zijn gekoppeld. Een platte rangschikking van cellen zal opleveren een coëfficiënt van de ruwheid van nul, terwijl aanzienlijke verschillen van dikte van het gemiddelde een ruwheid coëfficiënt groter dan 1 opleveren zal. Gelijkaardig aan de shear invloed op de groei en de dekking van de procentuele drempel van de film, de biofilms tentoongesteld verschillende topografieën na verloop van tijd. Over het geheel genomen Reen daalde na verloop van tijd voor alle schuintrekken omstandigheden die aangeeft dat alle oppervlakken zachter werd. Echter, in vergelijking met de laagste shear van 0.2 dyne/cm, de hogere schuintrekken instellingen van 0.5 en 1.0 dyne/cm2 resulteerde in een gladder oppervlak na verloop van tijd die aangeeft dat een snellere schuintrekken stroom tot soepeler en gelijkmatiger oppervlak, en de hoogste schuintrekken van bijgedragen 1.0 dyne/cm2 bereiken onder 0.2 Reen. De gladheid, regelmaat of ruwheid van een oppervlak kan ook worden uitgedrukt in textuur entropie (TE). TE is een eigenschap die in de beeldanalyse wordt gebruikt voor het meten van de mate van willekeur, in een tweedimensionaal beeld. De berekening is gebaseerd op de grijze niveau co voorval matrix, gedefinieerd door Haralick et al.., die kijkt of de pixelwaarden op één locatie zijn gecorreleerd met pixelwaarden op een andere locatie44. Een hoge mate van correlatie zal leiden tot lage entropie. Figuur 4 d toont de TE op schuintrekken stromen van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2. De TE verhoogd na verloop van tijd voor alle schuintrekken voorwaarden maar de hoogste schuifspanning 1.0 dyne/cm bereikt de maximale TE (1.0) eerder dan de lagere schuifspanningen op 900 min. De laagste schuintrekken van 0.2 dyne/cm2 had de laagste TE (0.8) bereikt zijn maximum na 1000 min. Echter bereikt de tussenliggende schuifspanning van 0.5 dyne/cm2 zijn maximale TE (1.2) veel later dan de hoge of lage shear stress voorwaarden. De coëfficiënt van de ruwheid en de TE meten verschillende functies. Terwijl een vlakke film, een lage ruwheid coëfficiënt en lage entropie hebben zou, kan een film met aanzienlijke variatie in dikte zou hebben een hoge ruwheid coëfficiënt maar nog steeds lage entropie als de variatie sinusvormige in plaats van willekeurige is. In dit geval Reen daalde met verhoogde shear stress en tijd terwijl de trends TE kunnen niet rechtstreeks verband houden met de shear stress toegepast op biofilm vorming na verloop van tijd. Figuur S1 : Afbeelding van de verovering van de controle software windows. Software venster met Multi-dimensionale overname menu openen (boven). Controlemodule instellen voor een AutoRun (onder). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur S2 Beeld vastleggen van de software voor de herziening van de gegevens. Toepassingsvenster na het selecteren van de gegevensset van belang met behulp van de Review Multi Dimensional Data tool in het menu Extra van de analyse . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het microfluidic-systeem en imago-analyseprocedure besproken hier richt zich op de uitvoering van microfluidic biofilm experimenten om morfologische eigenschappen waarvoor de volledige driedimensionale informatie meestal gevonden in confocale niet te bepalen Microscoop onderzoeken. Deze omvatten microcolony substraat dekking (percentage dekking), oppervlakteruwheid gemeten door de ruwheid coëfficiënt en textuur entropie. Een methode voor het schatten van de totale relatieve biofilm cel accumulatie wordt ook gepresenteerd van welke groeipercentages in logboek fase kan worden berekend.

Er zijn verschillende kleine maar betekenisvolle stappen die moeten worden gemarkeerd in deze methode. Het afvegen van de interface met alcohol voorkomt besmetting van andere bacteriën in gaan van experiment aan experiment maar ook van goed tot goed in één experiment. Priming en zaaien zijn ook zeer belangrijk omdat priming de gebruiker om te bepalen welke kanalen zijn waardoor de media toestaat te stromen via de kanalen zonder verstoringen of verstopping. Kanalen mag ook niet gestoord (dat wil zeggen ze moeten voortdurend vol media) na priming te verhogen de kans op een succesvolle experiment met geen luchtbellen of verstopping. De seeding stap kan gevarieerd worden volgens het type van bacteriën en dus moet worden geoptimaliseerd voor bevestiging van de cel. Bijvoorbeeld, als cellen niet lijken te koppelen, kunnen oppervlakte wijzigingen optreden op de microfluidic plaat vóór het zaaien of langere incubations tijden nodig kunnen zijn. Het is ook cruciaal om ervoor te zorgen dat de Microscoop correct is ingesteld om een in-focus-beeld te krijgen en periodiek worden gedurende het gehele experiment om te verzekeren bekeken moet dat kwaliteitsbeelden worden verkregen. Als de focus uitgeschakeld is, wordt de microscoop kan en moet worden aangepast als het experiment blijft. Tijdens de beeld-Acquisitietijd, moet de laatste golflengte worden ingesteld op Alle gesloten om te voorkomen dat de blootstelling van filters en verlichting aan slechts één kanaal tijdens de wachttijd die tussen de overnames van de afbeelding optreedt. Ook werd de beeldanalyse die de % oppervlakte dekking bepaalt ontworpen in huis omdat de Montage softwarehandleiding de procedure niet expliciet beschrijven. Verder ingaan op de beeldanalyse te bepalen andere kenmerken zoals oppervlakteruwheid, enz., open bron Python gebaseerde code⁴⁵ werd ontwikkeld in eigen huis en gedeelde op de gitHub repository. Er zijn ook beperkingen op hoeveel gegevens kan worden opgeslagen en beheerd op de lokale vaste schijf, zodat er een externe harde schijf of online gegevens delen zoals CyVerse⁴⁶nodig is.

Conventionele bioreactoren, zoals de CDC reactor en de drip stroom reactor³⁴, vereisen veel media bieden minder omvang van de steekproeven en eisen een hoog gehalte aan sterilisatie van apparatuur. In tegenstelling, de voordelen van deze hogere doorvoer platform omvatten de mogelijkheid om controle shear, debiet, en de veronderstelling dat de in vitro experimenten nauw lijken op in vivo voorwaarden. Nadelen van het systeem omvat de meerdere accessoires en software die vereisen een nauwgezette setup die moet worden uitgevoerd in de juiste volgorde van gebeurtenissen. Bovendien, de handleiding die beschikbaar is voor de apparatuur verklaart niet volledig elke stap van de experimenten, en de opdrachten van de software, en bijgevolg veel fouten optreden tijdens de experimenten, met inbegrip van verstopping van kanalen, gebrek aan groei of bijlage, of het gebrek aan hoge kwaliteit microscopie afbeeldingen of films. Het instrument zelf en verbruiksgoederen, zoals de microfluidic platen, zijn ook relatief duur met een prijskaartje van meer dan $200 per plaat en zijn niet herbruikbaar. Dus, terwijl de techniek krachtige resultaten leent, de technische expertise die nodig is voor het gebruik ervan is relatief hoog en vereist herhaalde opleiding door deskundigen op dit gebied. Dit verslag probeert dit probleem oplossen door het verstrekken van een gids voor nieuwe gebruikers van deze bioreactoren om te bestuderen van biofilms kenmerken.

Het microfluidic systeem, dat is het kundig voor cellulaire analyses uit te voeren, heeft opgedaan veel aandacht voor verschillende wetenschappelijke modaliteiten, zoals in de microbiologie, immunologie, hematologie, oncologie en stamcelonderzoek. Meer in het bijzonder, heeft de technologie geleid tot vele publicaties met een beschrijving van de onderwerpen die zeer relevant voor medische toepassingen^{37,47 zijn}, met inbegrip van microbiële mondelinge hechting⁴⁸, bepaling van de effecten van biosurfactants op Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus^49,50, gastheer-pathogeen interacties in E. coli⁵¹, Streptococcus naleving van⁵², en behandeling cystic fibrosis⁵³. Gezien het feit dat dit microfluidic systeem zeer veelzijdig is, verwacht wordt dat meer en meer systemen zal worden verdeeld over de hele wereld.

Enkele stappen specifiek protocol moeten zorgvuldig worden overwogen. Media kan worden verdund tot 50% met dH₂O om te voorkomen dat bubbels en verstoppingen, maar in dit geval niet nodig was. De specifieke waarde van OD₆₀₀ gebruikt voor het zaaien moet worden bepaald met behulp van proef runs van een groei-experiment om te zien wat het beste werkt voor de specifieke set van omstandigheden gebruikt. Bubbels in de putjes vóór de afdichting kunnen leiden tot de bubbels in de microfluidic-kanalen en moeten worden verwijderd door hetzij gezogen uit met een pipet tip of geknald. Het is belangrijk om te houden van de bacteriën uit de kleine serpentine kanalen. Doordat gelijke hoeveelheid media in de input en output tijdens het seeding, zal stroom als gevolg van druk van het vloeibare volume dus stroom alleen te wijten aan de toegepaste druk uit het systeem is worden gecontroleerd. De afstanden van de kalibratie moeten worden ingesteld tijdens de installatie door de vertegenwoordiger van het bedrijf. Deze instellingen zijn specifiek voor elke camera.

Er zijn verschillende uitdagingen die zich voordoen bij het vinden van de meest representatieve drempel voor een afbeelding. Instellen van de maximale drempelwaarden kunnen moeilijk als de intensiteit van de gemiddelde pixel in regio’s van de achtergrond niet consistent veroorzaakt door ofwel het selecteren van een fase positie die niet in het midden van het kanaal of puin op de plaat. Klik op procesonder de MM standaard, en selecteer vervolgens achtergrond en Shading Correction tool correctie voor deze inconsistenties. Deze tool is echter meestal alleen nuttig zijn als de gebruiker heeft genomen beelden van de kanalen voor het zaaien die ze als referentie afbeeldingen gebruiken kunnen. Of, als referentie in-/ achtergrondarcering afbeeldingen niet beschikbaar zijn, de gebruiker zal moeten hun oordeel stelt u een drempelwaarde oppervlakte de meest cel zonder achtergrond voor de hele afbeelding. Als alternatief, selecteer representatieve gebieden voor het meten van die regio’s van inconsistentie door Klik Rechthoekig gebied, Ellips regioof Trace regio een regio selecteren en selecteert u Actief gebied in plaats van gehele uitsluiten Afbeelding op de Toon regio statistiekvenster (onder Analysetools). Als een vertegenwoordiger regio wordt gebruikt voor drempelmethode het beeld helder veld, dezelfde regio moet worden gebruikt voor het meten van de overeenkomstige FITC-afbeelding. Het is nuttig om het opnemen van de specifieke ruimtelijke statistiek (links, boven, breedte, hoogte, gebied, Perimeter) die is gekoppeld aan die vertegenwoordiger regio dus dezelfde regio zal worden gevonden en gemeten op de overeenkomstige FITC-afbeelding.

Om te voorkomen dat een opeenhoping van gegevens op de harde schijf die leiden de computer tot zullen te vertragen, kan een externe harde schijf voor gegevensopslag worden gekocht. Een andere optie voor gegevensopslag en vergemakkelijken het delen van gegevens is de CyVerse bio-informatica platform. Maak een account op het CyVerse-systeem door naar http://www.cyverse.org/ te gaan. Eenmaal ingelogd, lanceren de ontdekking milieu en selecteer vervolgens “Log in CyVerse”. Selecteer “gegevens” en ga naar je de map. Als de afbeeldingsstapel op de lokale computer is en selecteer vervolgens “uploaden” en vervolgens “Eenvoudig uploaden van Desktop“. Zoek het afbeeldingsbestand voor de stapel en selecteer voor uploaden. Het bestand of een map kan worden gedeeld met medewerkers, als zij een CyVerse account hebt en gemachtigd zijn. Delen van de datamap aan het grote publiek, moet dat metagegevens worden toegevoegd voor elk bestand met CyVerse goedgekeurde normen. Deze procedure zal niet hier worden besproken omdat dit niet binnen de werkingssfeer van dit werk.

Materials

Ammonium Chloride, ACS	VWR	BDH9208-500G	Part of the minimal media composition
BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate	Fluxion Biosciences	910-0047
BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade	VWR	97061-904	Part of the minimal media composition
Dextrose, Anhydrous, ACS	VWR	BDH9230-500G	Part of the minimal media composition
Magnesium Sulfate ACS Grade	VWR	EM-MX0070-1	Part of the minimal media composition
Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade	VWR	BDH9268-500G	Part of the minimal media composition
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.
Sodium Chloride, ACS	VWR	BDH9286-500G	Part of the minimal media composition
Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade	VWR	97061-942	Part of the minimal media composition