Live Cell Analysis of Shear Stress on <em>Pseudomonas aeruginosa</em> Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Arin L. Sutlief; Helena Valquier-Flynn; Christina Wilson; Marco Perez; Hunter Kleinschmidt; Brett J. Schofield; Elizabeth Delmain; Andrea E. Holmes; Christopher D. Wentworth

doi:10.3791/58926

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

חיים תא ניתוח של גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת אוטומטית Microfluidic תפוקה גבוהה

Published: January 16, 2019

doi:

10.3791/58926

Arin L. Sutlief*¹, Helena Valquier-Flynn¹, Christina Wilson¹, Marco Perez¹, Hunter Kleinschmidt², Brett J. Schofield², Elizabeth Delmain³, Andrea E. Holmes¹, Christopher D. Wentworth*⁴

¹Department of Chemistry,Doane University, ²Department of Biology,Doane University, ³Department of Pathology and Microbiology,University of Nebraska Medical Center, ⁴Department of Physics and Engineering,Doane University

Summary

כאן, אנו מתארים את השימוש תפוקה גבוהה יותר microfluidic מגיב ביולוגי בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח של גזירה השפעות על biofilms Pseudomonas aeruginosa המבטאים חלבונים ניאון ירוק, כולל כלי להגדיר, הקביעה של כיסוי biofilm, שיעור הצמיחה ומאפיינים מורפולוגי.

Abstract

תפוקה גבוהה יותר microfluidic במבחנה מגיב ביולוגי בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ שימש ללמוד biofilm חיידקי הצמיחה, מורפולוגיה, כולל Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ). כאן, אנו נתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת כדי ללמוד את קינטיקה גידול והמאפיינים מורפולוגי כגון חספוס פני השטח, רקמתי האנטרופיה של זן aeruginosa פ PA01 המבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (PA01-EGFP משופרת ). פרוטוקול מפורט יתאר כיצד לגדל זרע תרבויות PA01-EGFP, כיצד להגדיר למעלה את המיקרוסקופ (autorun), לנהל את ניתוח התמונה כדי לקבוע שיעור הצמיחה ומאפיינים מורפולוגית באמצעות מגוון של כוחות גזירה נשלטים על ידי microfluidic התקן. מאמר זה מספק תיאור מפורט של טכניקה כדי לשפר את המחקר של biofilms PA01-EGFP אשר בסופו של דבר יכול להיות מיושם לכיוון זנים אחרים של חיידקים, פטריות או אצות biofilms באמצעות פלטפורמת microfluidic.

Introduction

כאן, אנו נדגים שיטה כדי למדוד את ההשפעה של גזירה על היווצרות של פלורסנט biofilms Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ) PA01 באמצעות מערכת אוטומטית microfluidic תפוקה גבוהה יותר.

Biofilms הן קהילות של מיקרואורגניזמים, כגון חיידקים, מאורגן על ידי חומר הפולימרים חוץ-תאית מחוברים תמיכה, ולא נמצאים בדרך כלל הממשק בין נוזל או מוצק פני שטח¹. קהילות אלה biofilm יכול להיות מועיל לסביבה, כגון שיפור איכות המים קווי אספקת מים, למצבה של הסרבן תרכובות²^,³. עם זאת, biofilms יכול להיות גם מאוד מזיק לבריאות האדם עם השלכות לא רצויות. לדוגמה, מכשירים רפואיים, כגון שתלים הירך והברך, הם סוג אחד של השטח שבו biofilm הצטברות כבר אתגר וגורם סיבוכים רפואיים קשים⁴^,⁵. Biofilms ניתן גם להזין מערכות מים טבעיים, כגון נהרות ואגמים, לחדור אספקת המים לצינורות המובילים לזיהום חיידקים במי שתייה וכתוצאה מכך זיהומים-⁶^,–⁷^,–⁸. Biofilms שהוקמה ב סביבות ימיות לדבוק ספינות ותערובות מעשה ידי אדם אחרים ולהציג בעיה כלכלית וסביבתית גדולה כמו הגדלת החיכוך מוביל להגדלת⁹^,צריכת דלק¹⁰. ציפויים מיקרוביאלית, כגון Tributyltin, פותחו כדי למנוע בעיות אלו אך רעיל החיים הימיים¹¹.

Aeruginosa פ הוא חיידק גראם שליליים עם היכולות הגבוהות משגשג במגוון רחב של תנאים סביבתיים וגורמים nutrimental¹². Aeruginosa פ היא גורם שכיח של הקהילה, בית החולים-רכשה זיהומים ומצא להיות הדוק משויך פציעות, כוויות חמורות, ו immunocompromised מארחים, כמו סיסטיק פיברוזיס (CF)⁵^,¹²^, ¹³, איידס, סרטן המטופלים⁵^,¹³. היווצרות biofilms פ aeruginosa חובר באופן חמור ל CF, דלקות ריאות כרונית איפה הגורם המוביל של מוות על מחלה זו⁵.

זן הפניה של aeruginosa פ, PA01, משמש בדו ח זה, הוא מהונדסים גנטית לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (PA-EGFP) משופרת. EGFP מייצג את המוטציות צורה של GFP עם מאפיינים פלורסצנטיות גדול המאפשר בחיי עיר biofilm ניתוח באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. סוג זה של ניתוח פלורסצנטיות היא יתרון עבור חקר biofilms GFP לא יפגע באופן משמעותי עם צמיחת תאים, הפונקציה¹⁷. לדוגמה, תאים Escherichia coli שתויגו עם GFP גדל היטב ובאופן רצוף בלי אחרי שנים של סבל תופעות רעילות לעומת חיידקים שליטה¹⁷. דוחות אחרים לבסס טענה¹⁸^,¹⁹^,²⁰. יתר על כן, השימוש של עיתונאי פלורסנט כגון EGFP הוא מהיר ופשוט, אך תאים חיים רק נמדד כי תאים מתים מהר לחדול לזרוח²¹.

Biofilms יכול לגדול בתנאים סביבתיים שונים, כולל אלה בעלי זרימה שונים המחירים. לדוגמה, סרטים יכול לגדול בגזירה גבוהה, כגון בנהרות, שם התנאים זרימת מים גבוהה להוביל מיקרוביאלי גיוון גדול²². לעומת זאת, מים עומדים בריכות או אוראלי biofilms ניסיון של הרבה התחתון הטיה כוח²³. בנוסף קצב הזרימה, ישנם גורמים אחרים המשפיעים biofilm אדהזיה, חספוס פני שטח כולל hydrophobicity, הרכב מדיה, ו אפילו בקטריאלי תא השטח¹^,⁴^,⁷^, ²⁴. תנאים יכול לגרום גם וריאציה המרחבי או המורפולוגיה של ממבנה biofilm. זה כולל תנאים סביבתיים כגון גזירה שהופעל על ידי נוזל נע או מעברי צבע זמינות חומרי הזנה, גורמים ביולוגיים כגון המינים המצויים המערכת תנועתיות של תאים, החלבונים ספציפית נוכח חוץ-תאית ²⁶^,²⁵^,חומר הפולימרים²⁷. בתנאים מסוימים, biofilm יהיה כמו הדשא זמן (חלקה ולא שטוח), בתנאים אחרים biofilm להיות מחוספס, רכות, או אפילו כמו פטריות²⁸. בעוד ההבדל איכותי בין מדשאות biofilm ומבנים פטריות ניתן לראות בבירור בתמונות מיקרוסקופיים, הבנת הקשר בין קולנוע מבנה ותהליכים ביולוגיים בתוך הסרט דורש שיטתית, תפוקה שיטות לתאר את המורפולוגיה. מאפיינים מורפולוגיים למחקר שהציעו החוקרים כוללים נקבוביות, ממד פרקטל, אורך diffusional, אזור microcolony תשתית האחסון microcolony, מקדם החספוס, אנטרופיה רקמתי²⁹^,³⁰.

אינקובטורים-מטלטל סיבובי משמשים במחקר של biofilms לחקות תנאי החיים האמיתיים³¹. טפטוף זרימה כורים (DFR) מייצגים סביבה נמוך-הטיה איפה מזינים בתקשורת לזרום באיטיות על פני תאים מצרף על פני השטח לאורך זמן כדי ליצור ממבנה biofilm עם צפיפות תאים גבוהה³². ה-CDC כורים הם ריאקטורים יוצר סביבה נוזלים גבוהה גזירה על ידי שליטה על מוט מלהיב זה מסתובב ללא הרף בתוך התקשורת מלא טנק³³. סוגים אלה של ריאקטורים פשוט להגדיר, אך הם מוגבלים בהיקף בגלל גודל המדגם נמוכה יחסית, צריכה גבוהה של מדיה, כמויות גדולות של פסולת ותברואה המופק מדיה טפטוף זורם החל µL 125/דקה טפטוף זרימה כורים יותר מ 1 מ”ל/מינימום עבור CDC כורים, והצורך אוטוקלב כמויות גדולות של המדיה של כלי זכוכית, פסולת-³⁴. Biofilms לא גדלים באופן שווה על פני השטח ב כור זרימה טפטוף כי ההטיה נמוכה של התקשורת גורם נגרר לאורך את התאגידים גדול יותר של חיידקים aeruginosa פ ולכן, הגידול biofilm אינה חלקה מאוד, הדגימות לא אחידה לא יכול להיות ניתחו בקלות עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ³⁵^,³⁶ .

כמה מגבלות ביוריאקטור נפוצים הם להתגבר באמצעות ביוריאקטור תפוקה בינונית microfluidic, שבו רק מיליליטר של מדיה נדרשים, הלוחות התגובה הם קטנים, ברצון חד פעמית לאחר autoclaving³⁷. יתר על כן, תלוי במספר בארות, שכפולי רבים ניתן לבצע ב כור אחד ברח, אשר מספק כמות מספקת של נתונים כדי לבצע ניתוח סטטיסטי משמעותי. איור 1, הרכיבים השונים של המערכת microfluidic-מיקרוסקופ זה לאפשר תנאים מבוקרים, לרבות חום וזרימה שיעור³⁸^,³⁹^,⁴⁰, מוצגים. ביוריאקטור זה משולב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי להמחיש את זריחה של התג EGFP ב PA01 תחת להחיל נמוך באמצעות גזירה גבוהה בתנאים המחקים תרחישים מציאותיים יותר אתה נתקל בסביבה או בתחום הביו-רפואי.

איור 1 : רכיבים בודדים של מערכת Microfluidic. רכיבים בודדים מופיעים משמאל לימין: 1. מצלמת CCD, 2. גבוהה ברזולוציה הפוכה מיקרוסקופ עם שלב אוטומטי, אוטומטי מודול פלורסצנטיות פוקוס אוטומטי מודול, 3. צלחת הבמה, 4: מערכת ממשק, 5 הדמיה: שלב מיקרוסקופ ידני : שליטה, 6 מלכודת קיטור, 7: מערכת בקר (כולל בקר טמפרטורה), 8 הדמיה: חומרת בקרי, 9: זריחה בקר, 10: תצורתו, 11: כונן קשיח חיצוני לאחסון תמונות, 12: תחנת PC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קטע של צלחת microfluidic מוצג באיור2. הלוחות הנפוצים מורכבות 48 בארות. ניסוי אחד מחייב כניסה אחת, שקע אחד בארות, סך של 2 בארות. דבר זה מאפשר 24 סימולטני ניסויים שניתן לבצע עם תנאים ניסויים שונים, כגון זני חיידקים, טיפולים מיקרוביאלית ומדיה מגוונת ערוץ ערוץ ומבוקר הטיה הזרימה עבור כל אחת מהעמודות של שישה ערוצים. הטמפרטורה ניסיוני נשלטת גם עם הגדרה אחת טמפרטורה ברחבי הבסיס. הערוצים microfluidic מראים כי לכל ערוץ יש אזור סרפנטין לספק מספיק לחץ אחורי, הטיה מבוקרת.

איור 2: ויזואליזציה של ערוצי microfluidic, חלון צפייה. שתי בארות כניסת ולשקע עם הערוצים microfluidic חיבורם מודגשים עם צבעי אדום וירוק. לצבוע גורם גלויים אזור סרפנטין בכל אחד מהערוצים אשר יוצרת לחץ אחורי מספיקות ו הטיה מבוקר במהלך זרימת נוזלים. כל ערוץ צפייה (בתוך המעגל האדום) יכול לדימות עם אורכי הגל הרצוי. מוצגות שדה בהיר (למעלה), פלורסנט (למטה) מיקרוסקופיה תמונות של ערוץ אחד עם ממבנה biofilm PA01-EGFP באמצעות מטרה X 20. סרגל קנה מידה = 80 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מדריך צעד אחר צעד מסופק כדי לאפשר למשתמשים של ריאקטורים microfluidic אשר נמצאים ביחד עם קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי לערוך ניסויים biofilm הרומן באמצעות סביבות שונות הטיה. שיטה זו יאפשר ההרחבה של ניסויים מעורבים מיקרואורגניזמים אחרים מלבד חיידקים, כגון פטריות, אצות, בעלי יישומים רפואיים וסביבתיים –⁴¹^,–⁴²^,–⁴³. הגישה מפורט מתאר כיצד תרבות PA01-EGFP, לחסן צלחת 48-ובכן, להגדיר את microfluidic המכשיר והתוכנה, להגדיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להדגים את ניתוח תוכנה כדי לקבל את הכיסוי biofilm, שיעור הצמיחה, ו מאפיינים מורפולוגיים כגון חספוס פני השטח.

Protocol

1. הכנה מדיה להכין תקשורתי מזערי (מ מ) עם 0.25% גלוקוז. כדי להפוך 1 ליטר של מ מ עם 0.25% גלוקוז, להוסיף 200 מיליליטר סטרילי M9 תמיסת מלח, 2 מ של 1 מ’ סטרילי MgSO4, 100 µL של 1 מ’ סטרילי CaCl2, מ”ל של גלוקוז 20% (w/v) סטרילי מים (dH2O) נפח סופי של 1 ל’ העברת מדיה הנדרשים לבקבוק סטרילי בטכניקות סטריליות. להכין את הסכום הנדרש בהתאם למספר ערוצי בשימוש. בדרך כלל, כל אחד מערוצי מחייב 200 µL הטרמה, 300 µL עבור µL זריעה, 1300 לניסוי 24 שעות ביממה. הניחו את הבקבוק באמבט מים או חממה השוכן הטמפרטורה ניסיוני. המדיה צריך להיות בטמפרטורה הניסוי לפני השימוש כדי למנוע מצטברות של microchannels את בועות. 2. הכנת תרבות לילה ו ניסיוני של PA01-EGFP. מקום 15 מ”ל של מדיה ניסיוני לתוך בקבוקון sidearm סטרילי, לחסן עם מושבות אחד או שניים מן צלחת אגר קווצות שער PA01-EGFP. הרחב את התרבות של 12-16 h בטבלת חממה/שייקר ב 37 ° C ו- 180-220 סל”ד. למדוד את יתר600 של התרבות לילה. כאשר ה OD600 גדול מ 0.80, לדלל את התרבות לילה כדי OD הסופי של 0.8 באמצעות טריים מ”מ. המקום התרבות ניסיוני חממה או תנורים ב 37 ° C עד לצורך זריעת הערוצים microfluidic. בדוק את יתר600 שוב מיד לפני זריעה כדי לוודא שהיא לא שינתה באופן משמעותי מן המטרה OD600, 0.8 במקרה זה. 3. ציוד הפעלה להגדיר את התחנה מערכת לפי המדריך למשתמש, הדומה הגדרת באיור1. כדי למנוע שגיאה בחיבור של המכשיר על התוכנה, להפעיל את המכשיר לפי הסדר הבא:תחנת PCקרינה פלואורסצנטית מודול. ודא שהתריס פלורסצנטיות דולקת (אור כחול על ידי לחצן סגירה על)חומרת בקרימערכת בקר הדמיה (ראה טבלה של חומרים)מצלמת CCDתחנת הדמיה (מיקרוסקופ)הערה: הטמפרטורה של צלחת מחוממת צריך להיות מותאם כדי ניסיוני הטמפרטורה הרצויה. הפעל את היישום בקרת והזן מספר לוחית ממוקם על התווית בצד הלוח.הערה: לאחר הפעלת יישום יהיו שני חלונות יישומים נפרדים, אחד עבור התוכנה ששולטים התוכנה מיקרוסקופ/הדמיה ואחד עבור מודול הבקרה ששולט המשאבה ואת הממשק פלייט-טוב. זה מוצג באיור S1, איפה תפריט “רב מימדי רכישה” פתוח על גבי, מודול בקרה מוגדר עבור הפעלה אוטומטית בתחתית. 4. הטרמה, זריעה לצלחת Microfluidic הערה: לקרקע, זריעה, מצורף חיידקי וצמיחה מומחשים באיור3. הסר את לוחית microfluidic 48-ובכן מהאריזה מקפיד לא לגעת משטח זכוכית בתחתית הצלחת. לנקות את השקופית זכוכית בתחתית הצלחת היטב עם טישו עדשה, מטלית ללא מוך או מגבון נמוך-מוך. לשפר את ערוצי microfluidic, פיפטה 200 µL של C ° 37 מ מ לתוך הפלט, אך הקפד להימנע בועות. מקם את הצלחת לשלב את הצלחת ונגב הממשק עם אתנול, ומאפשר להתייבש, לפני איטום זה לבמה צלחת. מצב ידני על מודול הבקרה, הגדר נוזל LB-37 ° C ו הטיה מקס -5.00 דיין/cm2. לחץ על הבארות פלט להפעיל זרימת מהפלט לקלט הטרמה הערוצים. לאחר 5 דקות הטרמה, השהה את הזרימה כדי להתכונן זריעה. הסר את הלוחית של הבמה ובזהירות פיפטה מדיה שיורית הפלט אך לא להסיר את כל המדיה מן המעגל הפנימי שמוביל ערוצי microfluidic. כדי להפיץ את הערוצים ניסיוני, תחילה פיפטה µL 300 מ מ לתוך הקלט טוב ואחריו pipetting µL 300 של התרבות חיידקים לתוך הפלט גם לתוך הפלט היטב. מקם את הצלחת בחזרה לתוך השלב צלחת מוודא לנגב את הממשק לפני הצבתו על הצלחת. על מודול הבקרה, מתמקדים ערוץ אחד תוך שימוש במצלמה בשידור חי לאחר הנחת את הבמה צלחת לבמה מיקרוסקופ. תוך מעקב אחר מבחינה חזותית על-ידי השידור החי, לחדש את זרימת-דיין 1.00-2.00/cm2 עבור 2-4 s לאפשר תאים להזין את הערוץ ניסיוני אבל לא בערוצים סרפנטין. להשאיר את הצלחת על הבמה מבוקרת טמפרטורה עבור h 1 לאפשר את התא מצורף. במהלך הדגירה 1 h, התוכנה מודול בקרת ואני מצרף ניתן להגדיר עבור ההפעלה האוטומטית (שלב 5).הערה: כמות הזמן הדרושה זריעה ישתנו עם המדיה, האורגניזם, אז זה צריך לפקח מקרוב על ידי השידור החי עד ממוטב ומשמש מסגרת זמן כללי. זריעה ברחבי הבסיס עשוי להשתנות אשר ידרוש יותר זמן של זרימת יישומית עמודות מסוימות של ערוצים עבור זריעה מלאה. לאחר תקופת ההחזקה, בעדינות הסר את הלוחית של הבמה, pipette החיידק מהפלט קודם הימנעות מטריד את הערוץ. עם טיפ פיפטה חדש, הסר את המדיה הבארות קלט. איור 3 : סקירה ניסיוני של לקרקע, זריעה, מצורף של PA01-EGFP בערוצים microfluidic. מחולקת לרמות את לקרקע זריעה, קובץ מצורף. הצעד הראשון לראשוניות דורש מדיה טרי הציג את הפלט. כרוך זריעה שווה כרכים של מדיה ותרבות בקטריאלי בקלט ופלט וולס, בהתאמה. התרבות אין לעבור על קטע הצפייה של הערוץ ניסיוני (הקו האדום) כדי למנוע סתימת סרפנטין הערוצים. לאחר תקופת הדגירה הוא מעל, מדיה טריים ללא הרף זורם מן הקלט, לחדר צפייה ו לשקע. זה מאתחל את קובץ מצורף, צמיחת biofilm חיידקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 5. הגדרת התוכנה בהתוכנה, פתח “רכישת ממדי מרובים” כדי לשלוט הרכישה תמונת מיקרוסקופ. תחת תפריט “הראשי”, בחר “Timelapse”, “מספר עמדות הבמה” ו- “מספר אורכי גל” (דמות S1A). הגדרת את שמירת ההגדרות, ליצור פשוט שם הבסיס, מוודא כי תוספת קבועה שם בסיס אם קובץ קיים מסומנת. לחץ על בחירת ספריה לבחור את התיקייה שבה יישמרו כל הקבצים. לכלול פרטים חיוניים של הניסוי תיאור. תחת הלשונית Timelapse , להתאים את משך הזמן ניסיוני ל 24 שעות. כדי לשלוט באיזו תדירות נרכשים תמונות, להגדיר את מרווח הזמן אז תמונות נרכשים כל 5 דקות לאורך כל הניסוי. מספר של נקודות זמן מכוונן באופן אוטומטי עם הגדרת הפרמטרים. הגדר שלב עמדות תוך שימוש במצלמה בשידור חי במיקרוסקופ שדה בהיר, המאפשר השמה נכונה ונוחות. החל מהמטרה X 10, מתמקדים המרכז של הערוץ, הממוקם מעל או מתחת למספרים ערוץ חרוט על הצלחת. לעבור המטרה X 20, מציאת שטח צפייה אופטימלית של מטוס מוקד בתוך הערוץ. להוסיף את המיקום ברשימה או להחליף את תנוחת לערוץ עם ההגדרות החדשות. תחת התפריט אורכי גל , להגדיר את מספר אורכי גל 3. עבור אורך גל 1 (W1), בחר את מצלמת 100% FITC עם זמן חשיפה 10 ms. עבור גל 2 (W2), בחר את מול 50% Brightfield קאם 50% עם זמן חשיפה מינימלית של גב’ 3 עבור אורך גל 3 (W3), להגדיר את המסנן סגור כל כך אין אור נשאר בערוץ האחרון בין רכישת פעמים. בעת הגדרת רכיב הבקרה, בדוק כדי לוודא כי המדריך לרוץ הופסק. בתפריט עריכה הפעלה אוטומטית תחת הלשונית ההתקנה הפרוטוקול , להגדיר פרוטוקול חדש עבור 24 שעות של משך הזמן, זורמת בכיוון קדימה בקצב הטיה הרצוי. הטיה קצב מגוון כדי לחקור את השפעת biofilm צמיחה בקצב הטיה. לחץ על Add Save As הפרוטוקול. תחת הכרטיסיה הגדרת רצף , ליצור רצף חדש על-ידי בחירה LB@37degrees כמו הנוזל ברירת המחדל עבור כל הערוצים. תחת שלב איטראציה 1, עבור ערוצים 1-12, בחר את הפרוטוקול עם קצב ההטיה הרצויה, לאפשר כל הערוצים. עבור ערוצי 13-24, בחר את הפרוטוקול עם קצב ההטיה הרצויה השני, לאפשר לכל הערוצים. בחר החל Save As הרצף. בתפריט ‘ הפעלה אוטומטית ‘, בחר את הרצף השמור כדי לשמש את ההפעלה האוטומטית. 6. מתוזמן Biofilm צמיחה ניסוי ההתקנה Pipette היותר µL 1,300 מ מ סטרילי לתוך הקלט טוב של צלחת microfluidic. מקם את הצלחת בחזרה לבמה צלחת ונגב הממשק עם אתנול, ומאפשר אתנול להתייבש לגמרי לפני איטום לצלחת. הצבת את הצלחת שלב לבמה מיקרוסקופ, להיות בטוח כי פרוטוקולי שבהם, sequence(s) מוגדרות כראוי. בחר להתחיל להפעיל את ההפעלה האוטומטית במהירות ולאחריה לחיצה על רכוש להתחיל אוסף תמונות מיקרוסקופ. התאם את המיקוד ואת המיקום של כל שלב העמדות בין התמונה שנדחפתי. בחר הפסקה , באמצעות מצב תמונה בשידור חי באורך הגל החיובי שדה, בחר ללכת כדי להציג עמדות בכל שלב. קבע את הגדרות חדשות על-ידי בחירת הגדר הנוכחי. לחץ על קורות חיים לפני הזמן רכישה המתוזמן הבא. 7. סקירה וניתוח רצפי תמונות לאחר הניסוי צמיחה Biofilm מתוזמן כדי לסקור את כל ערוץ 24 שעות ביממה בעקבות ההפעלה האוטומטית, בהתוכנה, פתח לסקור נתונים רב-ממדיים, הממוקמים תחת כלי ניתוח. לחץ על בחר קובץ הבסיס | בחר ספריית כדי לנווט אל תיקיית עם רצפי תמונות עבור הניסוי של ריבית. הרשימה של ערכות נתונים בתיקיה שבה מופיע, בחר את שם הבסיס של נתונים מעניינים. ברגע שהנתונים עניין נבחר, לחץ על תצוגה כדי לסקור נתונים אלה. בחר אורך גל כדי לסקור את הנתונים מתחת לחלון אורך הגל (איור S2). סקירה רצף תמונות לכל ערוץ על-ידי בחירת מספר הערוץ תחת מיקום הבמה באמצעות הפקדים וידאו כדי לנתח את הנתונים עבור הזמן 289 נקודות (בהנחה תמונות מתקבלים כל 5 דקות על מסגרת הזמן 24 שעות ביממה). שימו לב של נתוני הצמיחה שמיש.הערה: בכל אחד מהערוצים, לצפות להתפתחות של בועות אוויר, כפכפים זה יפריע את הצמיחה biofilm בתוך התעלה, להשפיע על הנתונים. עם זאת, אם אלו מתרחשים בהמשך הנתונים לרוץ, לפני בנסיבות אלה ניתן למצוא שימושי. לאחר הסקירה של בחירת הנתונים הרצויים עבור ניתוח, צור ערימות של התמונות לכל ערוץ. תחת התפריט קובץ , בחר פתוח מיוחד | לבנות ערימה | ממוספרות שמות. בחלון מחסנית לבנות , בחר בלחצן בחר התמונה הראשונה ולאחר מכן בחר את התמונה הראשונה עבור המחסנית בתיקיה קובץ; בחר בלחצן בחר תמונה אחרונה ולאחר מכן בחר את הקובץ המתאים האחרון התמונה במחסנית. לחץ על אישור כדי לפתוח את המחסנית עם כל התמונות של הערוץ לפי סדר כרונולוגי. ניתן לשמור אוספים תחת התפריט קובץ , שמירה בשם כקובצי tiff.הערה: אל תיצור ערימות עם התמונות האגודל. קבצים אלה אינם מאוד שימושי, ניתן למחוק כדי לחסוך מקום על הכונן הקשיח. כמו כן, קבצי תמונה נשמרים כדלהלן:#_TIMAGE NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL הבסיס #.לדוגמה, 07062018_W1FITC 100_s12_t112 הוא ערוץ 12, נקודת זמן 112, התמונה בנתוני מצלמה 100% אורך הגל-FITC הראשון עם שם הבסיס “07062018”. לבסוף, בחר שמירה בשם מהתפריט הנפתח קובץ כדי לשמור על הרצף ערימה tiff. ערימות יכול להיות גם בשכבות, נשמר כמו סרט. זה נשלח בשלב 9. לפני לכימות כיסוי משטחים את %, לכייל את המרחקים התמונה. תחת כלי ניתוח, לחץ על כיול מרחקים. בחר את המידה המתאימה כיול ‘ ולחץ על ‘ החל על כל התמונות פתוח’. בעוד הערימה על התמונה הראשונה של הרצף, לחץ על לחצן הסף . השתמש אוטומטית הסף עבור אובייקטים של אור לסף ניאון האות (אורך גל FITC) ואת סף אוטומטי עבור אובייקטים כהים לסף בשדה בהיר. להתאים את הסף את הכיסוי המייצג את הכיסוי של התמונה. על סף פלורסנט, לנצל ערוץ עם תאים שאינם-פלורסנט להקים כל אות רקע וערכת ערך הסף המינימלי כדי לא לכלול אות זוהה ערוצי המכיל את אלה שאינם-פלורסנט אינה תאים כדי להבטיח מדידה אות לא מגזים האזור של זריחה. זה עשוי להיות שונה מלרוץ לרוץ אז זה רעיון טוב להשתמש לפחות אחד, אם לא יותר, פרופיל עבור פקדים שאינם-פלורסנט. ספי שדה בהיר, אם כל התאים שאינם מכוסים על-ידי החתימה הסף כתום, להתאים את ערך הסף המרבי או דרך הכלים הזזה או באמצעות תמונה הסף (נמצא תחת כלי ניתוח) כך שכל התאים הם אך כל הרקע אינו נכלל.הערה: ואילו ערכי הסף האלה באופן אידיאלי ישמש עבור כל התמונות בתוך ערמה, כל הערוצים, ערכי הסף שנבחר עבור התמונה/ערוץ אחד אולי לא יאה תמונות או ערוצים אחרים ולכן שהמשתמש ייתכן שיהיה עליך להתאים את טווח הסף מעת לעת. מסיבה זו, זה רעיון טוב תמיד להקליט את המקסימום, ערכי הסף המינימלי בשימוש אשר צריך נתונים הנסקר מאוחר יותר. כדי לכמת את הכיסוי, תחת כלי ניתוח, לחץ על הצג סטטיסטיקה באזור. ודא כי שימוש הסף מסומנת, כל התמונה נבחרה, ולאחר תחת נתונים שהושגו, ודא המידות/ההגדרות הרצויות נבחרו (הסף אזור ממוצע, סטיית תקן, min, max, % מסף אזור). לחץ על יומן פתוח וודא DDE הקובץ שנבחר לפני שתלחץ על אישור. בחר Microsoft Excel ‘ ולחץ על ‘ אישור’. בגיליון זה פתוחה, לחץ על נתוני יומן רישום להקלטה אוטומטית את המידות של תמונת שעוברים ניתוח. עוזב גיליון אלקטרוני זה פתוח, להשתמש באותו הגיליון כדי לאסוף את כל נתוני ניתוח התמונה עבור מחסנית בודדת. בערימה, ללכת התמונה הרביעית ואת סף ההגדרות האופטימליות. לחץ על נתוני יומן רישום במסך הצג סטטיסטיקה האזור ואת הערכים נרשמות לתוך הגיליון האלקטרוני. חזור על הפעולה עבור ניתוח של תמונות כל 15 דקות. 8. אחרים סקריפטים ניתוח כולל ומורפולוגיה השטח כיסוי מדידה באמצעות פיתון מן הסוויטה מורפולוגיה Biofilm התקן בהתפלגות של 3.6 פיתון הכולל מודולים רגילים מדעית באמצעות התפלגות פיתון מדעי רגיל כמו אנקונדה, לרשותכם https://www.anaconda.com/download. לקבל את הסוויטה מורפולוגיה Biofilm GitHub בדפדפן על-ידי ניווט אל https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, ולאחר מכן בחר שיבוט או להורדה (הכפתור הירוק) ובחר הורד Zip. פרוס את הקובץ ולהעביר את התיקיות קוד עבודה בספריה. למדוד אחוז כיסוי thresholded על ידי העתקה של אוסף התמונות לתוך התיקיה “כיסוי”. השתמש בחלון מסוף כדי לנווט אל התיקיה ולאחר מכן לבצע את ה-script באמצעות הפקודהbfCoverage.py פייתון tiffStackName.tifמתוך ממשק שורת פקודה, כאשר tiffStackName.tif הוא שם הקובץ המכיל את ערימת תמונות tiff. קובץ טקסט המכיל את המידות כיסוי בכל נקודה בזמן ייווצר עם השם tiffStackName.txt , קובץ גרפיקה עם מגרש של כיסוי כמו פונקציה של זמן תיווצר בשם tiffStackName.png. השתמש בפרוצדורה זהה שצוין בשלב 8.3 למדוד מאפיינים מורפולוגיים אחרים: biofilm הצטברות מקדם החספוס, אנטרופיה רקמתי. השתמש את התסריט bfAcc.py עבור המידה הצטברות, התסריט roughCoef.py של מדידת מקדם החספוס, את התסריט TEvsTime.py עבור המידה אנטרופיה רקמתי. 9. אחרים יישומי תוכנה – ביצוע כיסויי וסרטים אם נעשה שימוש במספר אורכי גל, ליצור כיסוי ערימות כולל אורכי גל אלה. פתח את כל האוספים של עניין, לכייל את המרחק כפי שנעשה צעד 7.6. תחת כלי ניתוח, בחר באפשרות תמונות כיסוי. הגדר המקורות ערמות של ריבית. באוסף FITC, לחץ על העיגול קשת ובחרו מסנן צבע ירוק שיש להוסיף על מנת להדגיש את הגל הזה. השתמשו bal להתאמת הכיסוי כך הערימה FITC בולטת של תמונות. לאחר כל התאמות נעשו, בחר כל המטוסים עבור שתי ערימות ולחץ על ‘ החל’. שמור את כיסויי באותו אופן כמו ערימות שמתואר בשלב 7.5 או סרט שמתואר בשלב 9.2. כדי לשמור אוספים או כיסויי כסרט timelapse, תחת סטנדרט מ מ מחסנית, לחץ על Make Movie. בחר את המקור מחסנית או כיסוי רצויה. לחץ על שמור ולשמור 1 וידאו Microsoft עם איכות הממוקם בין 70-80.

Representative Results

איור 4 מדגים את האזור thresholded אחוז לאורך זמן של ה 24 להפעיל זרימות הטיה של 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2. Biofilm כיסוי או אחוזים סף שטח (C [%]) היה שונה עבור כל הטיה שלוש ההגדרות. הכיסוי biofilm היה המהיר ליד הטיה2 דיין 1.0/cm, היכן האזור הסף עלה מ 2-5% ל- 100% לאחר מינימום 200 הצמיחה הגיע שלב נייח לאחר 400 דקות. -דיין 0.5/cm2, כיסוי biofilm עוכב והחל להגדיל ב- 400 דקות להגיע 100% כיסוי לאחר מינימום 800. ההטיה הנמוך-דיין 0.2/cm2 הראו בבירור העלייה האיטית ביותר בסיקור biofilm, שבו אחוז כיסוי החלו להגדיל ב- 500 דקה אך לא הגיעה מעבר לאזור הסף 65%. התוצאות הצביעו על הטיה הייתה השפעה ישירה על כיסוי משטחים biofilm. ההטיה גבוהים נראה להיות מצב אופטימלי יותר לצמיחה biofilm, אולי בשל העובדה כי התקשורת סיפק החיידק עם חומרים מזינים יותר כך biofilm יכול להתרבות מהר יותר. איור 4: פינת סף אחוז, הצטברות biofilm הכולל, מקדם החספוס, אנטרופיה רקמתי. הסף a) אחוז שטח (C [%]) לאורך זמן באמצעות 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2 מעל 24 שעות בתקופה. נתונים הושג מערוץ אחד עבור כל תנאי הטיה. b) סה כהצטברות biofilm (מדד יחסי) כפונקציה של זמן באמצעות 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2 מעל 24 שעות בתקופה. הקווים השחורים הם ריבועים מתאים למודל מעריכי. נתונים הושג מערוץ אחד עבור כל תנאי הטיה. ג) מקדם החספוס של PA01-EGFP באמצעות גזירה ערכים של 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2 פיקוח מעל 24 ח’ נתונים הושג מערוץ אחד עבור כל תנאי הטיה. d) אנטרופיה רקמתי של PA01-EGFP באמצעות גזירה ערכים של 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2. הנתונים היה המתקבלים ערוץ אחד עבור כל תנאי הטיה (Valquier-פלין, ה, Sutlief, א. ל, וונטוורת, מועדון, 2018). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 b היא בקנה אחד עם הממצאים המוצגים באיור 4. הצטברות biofilm (N[rel]) נמדדה מבוסס על ההנחה כי האות GFP בכל נקודה בתמונה הוא יחסי לצפיפות תא חי באותו מיקום. הוא מדגים כי סך מדידה יחסית biofilm הצטברות גדל כפונקציה של זמן באמצעות 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2 מעל 24 שעות ביממה תקופת זמן, קצב הצמיחה ירדה מגזירה הגבוהה ביותר ל גזירה הנמוך. יש פרק זמן ברור נותן הגידול האקספוננציאלי שממנו ניתן לחשב קצב גדילה כמותית. איור 4 ג מדגים את מקדם החספוס (R)-הטיה תזרימי של 0.2 0.5, דיין 1.0/ס מ2. חספוס פני השטח, לכמת על ידי מקדם החספוס, מודד את השונות בפרופיל עובי של הסרט. ההגדרה הפורמלית היא Tאני איפה שאני-th עובי המדידה, T הוא עובי ממוצע ו- N הוא המספר של מדידת עובי30. ההליך המתואר בחקירה הזו מודדת את עובי המשויך תאים חיים. סידור שטוח של תאים תניב מקדם החספוס של אפס ואילו וריאציות משמעותיות של עובי מן הממוצע תניב מקדם החספוס גדול מאחד. בדומה השפעת הטיה על הצמיחה ועל סף אחוז הכיסוי של הסרט, biofilms הציג topographies שונים לאורך זמן. בסך הכל, R ירד לאורך זמן עבור כל התנאים הטיה המציין כי כל המשטחים הפך חלקה יותר. עם זאת, בהשוואה הטיה הנמוך של דיין 0.2/cm, ההגדרות הטיה גבוהה יותר של 0.5 ו דיין 1.0/cm2 הביא משטח חלקה לאורך זמן המציינת כי זרם הטיה מהיר תרמו השטח אפילו יותר וחלק יותר, ו את ההטיה הגבוהה ביותר של דיין 1.0/cm2 להגיע מתחת 0.2 R. החלקות, סדירות, או גסות של משטח יכול להתבטא גם ב רקמתי אנטרופיה (TE). טה הינו נכס המשמש בניתוח התמונה כדי למדוד את מידת האקראיות תמונה דו-ממדית. בחישוב מבוסס על המטריצה אפור מופע משותף ברמה, שהוגדרו על-ידי הארליק et al., אשר בוחן אם ערכי פיקסלים במיקום אחד נמצאים בקורלציה עם ערכי פיקסלים-מיקום אחר44. רמה גבוהה של המתאם יוביל אנטרופיה נמוכה. איור 4 d מתארת TE-הטיה תזרימי של 0.2 0.5, דיין 1.0/ס מ2. TE מוגברת לאורך זמן עבור כל התנאים הטיה אבל את הגבוה ביותר מאמץ גזירה על דיין 1.0/ס הגיע המרבי TE (1.0) מוקדם יותר הלחצים הטיה נמוך ב- 900 דקה. ההטיה הנמוך של דיין 0.2/cm2 היה TE הנמוך (0.8) להגיע המקסימאלית שלה לאחר 1,000 דקות. עם זאת, גזירה ביניים של דיין 0.5/cm2 להגיע שלה טה המרבי (1.2) הרבה יותר מאוחר מאשר התנאים גזירה גבוה או נמוך. מקדם החספוס של טה למדוד תכונות שונות. בעוד סרט שטוח מקדם החספוס נמוכה בעלת אנטרופיה נמוכה, סרט עם וריאציה משמעותי עובי מקדם החספוס גבוהה אבל עדיין יכול להיות אנטרופיה נמוכה אם וריאציית הוא sinusoidal ולא אקראי. במקרה זה, R ירד עם גזירה מוגברת זמן בזמן המגמות טה לא יכול להיות קשור ישירות להטיית מתח שהוחל ביופילמים לאורך זמן. איור S1 : תמונה לכידה של windows תוכנת שליטה. להיפתח חלון התוכנה עם תפריט רב מימדי רכישה (למעלה). מודול בקרת סט ההפעלה האוטומטית (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור S2 תמונה לכידה של התוכנה עבור סקירת נתונים. חלון היישום לאחר בחירת ערכת הנתונים עניין באמצעות הכלי סקירה רב מימדי נתונים ‘ מתפריט ‘ כלי ניתוח . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

Microfluidic מערכת ותמונה ניתוח הפרוצדורה שנדונו כאן מתמקדת על הוצאתו להורג של microfluidic biofilm ניסויים כדי לקבוע מאפיינים מורפולוגיים שאינם מצריכים תלת מימדי מלא במידע שנמצא בדרך כלל מקונפוקלי מחקרים מיקרוסקופ. אלה כללו כיסוי תשתית microcolony (אחוז הכיסוי), חספוס פני השטח נמדד לפי מקדם החספוס וכן אנטרופיה רקמתי. שיטה להערכת biofilm יחסית הכולל תא הצטברות מוצג גם מאילו שיעורי צמיחה ביומן יכול להיות מחושב שלב.

ישנם מספר שלבים קטנים אך משמעותיים אמורים להיות מודגשים בשיטה זו. מנגב את הממשק עם אלכוהול מסייעת למנוע זיהום של חיידקים אחרים להיכנס ניסוי כדי ניסוי אבל גם מן טוב עד טוב. ניסוי אחד. הטרמה זריעה הינם גם מאוד חשוב משום לקרקע מאפשרת למשתמש לקבוע אילו ערוצים המאפשר התקשורת לזרום דרך הערוצים ללא כל הפרעות או סתימת. ערוצי צריך גם לא להיות מוטרד (כלומר הם צריכים להיות כל הזמן מלא מדיה) לאחר הטרמה כדי להגדיל את הסיכוי של ניסוי יירוט מוצלח עם אין בועות אוויר או סתימת. הצעד זריעה יכולים להיות מגוונים לפי הסוג של חיידקים, אז צריך להיות אופטימיזציה עבור התא מצורף. לדוגמה, אם תאים שאינם נראים לצרף, שינויים משטח יכול להתרחש על הצלחת microfluidic לפני זריעה או יותר פעמים incubations עשוי להיות נחוץ. חשוב גם לוודא כי המיקרוסקופ מוגדר כראוי כדי לקבל תמונה בפוקוס, צריכים להיות במעקב תקופתי לאורך כל הניסוי כדי להבטיח איכות תמונות מתקבלים. אם המוקד אינו פועל, המיקרוסקופ ניתן, צריך להיות מותאם ממשיך הניסוי. בזמן רכישת התמונה, הגל האחרונה צריכה להיות מוגדרת ל סגור כל כדי למנוע את החשיפה של תאורה לערוץ אחד בלבד בזמן ההמתנה המתרחשת בין הרכישות תמונה ומסננים. כמו כן, ניתוח התמונה קובע את כיסוי משטחים % תוכנן בבית כי המדריך תוכנה מונטאז במפורש לא מתארים את ההליך. יתר על כן, על מנת להרחיב על ניתוח תמונה, לקבוע מאפיינים אחרים כגון חספוס פני השטח, וכו ‘., פתח מקור קוד מבוסס פיתון⁴⁵ פותחה בבית ומשותפים על המאגר gitHub. ישנן גם מגבלות על כמה נתונים יכול להיות שמורים ומנוהלים על הכונן הקשיח המקומי, כך כונן קשיח חיצוני או שיתוף מידע באינטרנט יש צורך כגון CyVerse⁴⁶.

ריאקטורים קונבנציונליים, כגון המגיב ה-CDC ו את הטפטוף זרימה הכור³⁴, דורשים הרבה מדיה, מספקים פחות גודל מדגם, דורשים כמות גבוהה של סטריליזציה של ציוד. לעומת זאת, היתרונות של הפלטפורמה תפוקה גבוהה יותר כוללות את היכולת שליטה הטיה, המחירים זרימה, ומזכירים ההנחה כי חוץ גופית בתוך ניסויים מקרוב ויוו תנאים. החסרונות של המערכת כוללים את האביזרים מרובים, התוכנה דורשת התקנה קפדני שנועד זה חייב להתבצע בסדר הנכון של אירועים. יתר על כן, במדריך המסופק לציוד לא מלא להסביר כל שלב של הניסויים, והן את הפקודות תוכנה, כתוצאה מכך, הרבה טעויות מתרחשות במהלך הניסויים, לרבות סתימת של ערוצים, חוסר גדילה או כקובץ מצורף. או חוסר תמונות מיקרוסקופ באיכות גבוהה או סרטים. המכשיר עצמו חומרים מתכלים, כגון הצלחות microfluidic, גם יקרים יחסית עם תג מחיר של יותר מ-200 דולר לכל צלחת והם אינם לשימוש חוזר. לפיכך, ואילו הטכניקה מקנה תוצאות רבות עוצמה, מומחיות טכנית הדרושים לשימוש שלה גבוה יחסית ודורש תרגול חוזר ונשנה על-ידי מומחים בתחום. דו ח זה מנסה לפתור בעיה זו על-ידי מתן מדריך למשתמשים חדשים של אלה ריאקטורים המחקר biofilms מאפיינים.

מערכת microfluidic, אשר מסוגל לבצע ניתוח הסלולר, צברה תשומת לב רבה על שיטות מדעיות שונות, כגון, מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, המטולוגיה, אונקולוגיה, מחקר תאי הגזע. ליתר דיוק, הטכנולוגיה הביא בפרסומים רבים המתארים נושאים הרלוונטיים במיוחד ביישומים רפואיים³⁷^,⁴⁷, לרבות מיקרוביאלי אדהזיה אוראלי⁴⁸, הקובע את ההשפעות של biosurfactants- Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus⁴⁹^,⁵⁰, לארח הפתוגן אינטראקציות של e. coli⁵¹, סטרפטוקוקוס הדבקות⁵², וטיפול סיסטיק פיברוזיס⁵³. לאור העובדה כי מערכת זו microfluidic היא מאוד תכליתי, הוא צפוי כי יותר ויותר מערכות יופץ ברחבי העולם.

כמה צעדים פרוטוקול ספציפי יש לשקול בזהירות. המדיה יכולה להיות מדולל על 50% עם dH₂O כדי למנוע בועות ואת סתימת אך לא היה נדרש במקרה זה. הערך של יתר₆₀₀ משמש זריעה להיקבע באמצעות האקסאלסיור של ניסוי גידול כדי לראות מה עובד הכי טוב עבור ערכת מסוים התנאים בהם נעשה שימוש. בועות הבארות לפני איטום יכול להוביל בועות בערוצים microfluidic ויש להסירם הכתיב צצו או נשאב החוצה עם טיפ פיפטה. חשוב לשמור על חיידקים מתוך הערוצים סרפנטין קטן. על ידי בעל נפחים שווים של התקשורת לקלט ולפלט במהלך תהליך זריעה, זרימה בלחץ נפח נוזלי נשלטות ולכן הזרימה היא רק בשל הלחץ יישומית מן המערכת. המרחקים כיול צריכה להגדיר במהלך ההתקנה על ידי נציג החברה. הגדרות אלה הם ספציפיים לכל מצלמה.

ישנם מספר אתגרים המתרחשות בעת מציאת סף קנאס לתמונה. הגדרת ערכי הסף המרבי יכול להיות קשה אם עוצמת הפיקסלים הממוצע על פני אזורים של הרקע אינן עקביות נגרם על-ידי בחירת מיקום הבמה שאינו במרכז של הערוץ או מפני פסולת על הצלחת. תחת תקן מ מ, לחץ על התהליך, ולאחר מכן בחר רקע ותיקון הצללת כלי תיקון עבור אלה של חוסר עקביות. עם זאת, כלי זה הוא בדרך כלל רק מועיל אם המשתמש לוקח תמונות של הערוצים לפני זריעה שהם יכולים להשתמש בו כתמונות הפניה. או, אם רקע/הצללה הפניה תמונות אינן זמינות, המשתמש יהיה צורך להשתמש הדין שלהם כדי לקבוע את ערך הסף משתרע ביותר תא שטח ללא רקע עבור התמונה כולה כולל. לחלופין, בחר נציג אזורי למדוד השוללים מחוזות עקביות על-ידי לחץ על האזור המלבני, אזור אליפסהאו מעקב אזור בחר אזור ולבחור אזור פעיל ולא כולו תמונה על החלון הצג סטטיסטיקה אזור (תחת כלי ניתוח). אם האזור מייצג הוא מנוצל עבור קביעת סף תמונת שדה בהיר, יש להשתמש באותו האזור למדידה של תמונת FITC המתאימים. זה עוזר להקליט את מרחבי סטטיסטיקות ספציפיות (שמאל למעלה, רוחב, גובה, אזור, ההיקף) המשויכות באותו אזור נציג כך יימצא באותו האזור, נמדד על התמונה המתאימה FITC.

כדי למנוע הצטברות של נתונים בכונן הקשיח שיגרמו למחשב להאט, ניתן לרכוש כונן קשיח חיצוני לאחסון נתונים. אפשרות נוספת עבור אחסון נתונים ושיתוף נתונים והקלה על היא פלטפורמת ביואינפורמטיקה CyVerse. ליצור חשבון על מערכת CyVerse על ידי הולך http://www.cyverse.org/. ברגע שנכנסת, להפעיל את הסביבה גילוי ולאחר מכן בחר “יומן ב CyVerse”. בחר “נתונים” ונווטו את התיקיה. אם הערימה תמונה במחשב המקומי ולאחר מכן בחר “להעלות” ואז “פשוט להעלות משולחן העבודה“. למצוא את הקובץ מחסנית התמונה ובחר להעלאה. ניתן לשתף את הקובץ או התיקיה עם משתפי פעולה. אם יש חשבון CyVerse, מקבלים הרשאה. שיתוף התיקיה data לקהל הרחב מחייב את המטה-נתונים יתווספו עבור כל קובץ באמצעות CyVerse אושרו תקנים. הליך זה לא יידונו כאן כי זה לא בתוך הטווח של עבודה זו.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו התאפשרה על ידי מענקים מן המכון הלאומי עבור כללי רפואי מדעי (NIGMS) (5P20GM103427), רכיב של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)

Materials

Ammonium Chloride, ACS	VWR	BDH9208-500G	Part of the minimal media composition
BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate	Fluxion Biosciences	910-0047
BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade	VWR	97061-904	Part of the minimal media composition
Dextrose, Anhydrous, ACS	VWR	BDH9230-500G	Part of the minimal media composition
Magnesium Sulfate ACS Grade	VWR	EM-MX0070-1	Part of the minimal media composition
Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade	VWR	BDH9268-500G	Part of the minimal media composition
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.
Sodium Chloride, ACS	VWR	BDH9286-500G	Part of the minimal media composition
Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade	VWR	97061-942	Part of the minimal media composition

References

Donlan, R. M., et al. Model System for Growing and Quantifying Streptococcus pneumoniae Biofilms In Situ and in Real Time. Applied and Environmental Microbiology. 70 (8), 4980-4988 (2004).
Lührig, K., et al. Bacterial Community Analysis of Drinking Water Biofilms in Southern Sweden. Microbes and Environments. 30 (1), 99-107 (2015).
Singh, R., Paul, D., Jain, R. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14 (9), 389-397 (2006).
Veerachamy, S., et al. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 228 (10), 1083-1099 (2014).
Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
Percival, S. L., Knapp, J. S., Edyvean, R., Wales, D. S. Biofilm Development On Stainless Steel In Mains Water. Water Research. 32 (1), 243-253 (1998).
Percival, S. L., Knapp, J. S., Wales, D. S., Edyvean, R. G. J. The effect of turbulent flow and surface roughness on biofilm formation in drinking water. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 22 (3), 152-159 (1999).
Ling, F., Whitaker, R., LeChevallier, M. W., Liu, W. -. T. Drinking water microbiome assembly induced by water stagnation. The ISME Journal. , 1 (2018).
Moss, B. Water pollution by agriculture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1491), 659-666 (2008).
Schultz, M. P., Bendick, J. A., Holm, E. R., Hertel, W. M. Economic impact of biofouling on a naval surface ship. Biofouling. 27 (1), 87-98 (2011).
Tornero, V., Hanke, G. Chemical contaminants entering the marine environment from sea-based sources: A review with a focus on European seas. Marine Pollution Bulletin. 112 (1-2), 17-38 (2016).
LaBauve, A. E., Wargo, M. J. Growth and Laboratory Maintenance of Pseudomonas aeruginosa. Current Protocols in Microbiology. 25 (1), 1-8 (2012).
He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (8), 2530-2535 (2004).
Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R. An Enhanced Green Fluorescent Protein Allows Sensitive Detection of Gene Transfer in Mammalian Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 227 (3), 707-711 (1996).
Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73 (5), 2782-2790 (1997).
Chalfie, M., Tu, Y., Euskirche, G., Ward, W. W., Prashert, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 12501-12504 (1994).
Bakke, R., Kommedal, R., Kalvenes, S. Quantification of biofilm accumulation by an optical approach. Journal of Microbiological Methods. 44 (1), 13-26 (2001).
Heydorn, A., et al. Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression. Applied and Environmental Microbiology. 68 (4), 2008-2017 (2002).
Wilson, E., et al. Using Fluorescence Intensity of Enhanced Green Fluorescent Protein to Quantify Pseudomonas aeruginosa. Chemosensors. 6 (21), (2018).
Fang, H., Chen, Y., Huang, L., He, G. Analysis of biofilm bacterial communities under different shear stresses using size-fractionated sediment. Scientific Reports. 7 (1), 1299 (2017).
Saunders, K. A., Greenman, J. The formation of mixed culture biofilms of oral species along a gradient of shear stress. Journal of Applied Microbiology. 89 (4), 564-572 (2001).
Valquier-Flynn, H., Wilson, C. L., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Growth Rate of Pseudomonas aeruginosa Biofilms on Slippery Butyl Methacrylate-Co-Ethylene Dimethacrylate (BMA-EDMA), Glass and Polycarbonate Surfaces. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 7 (4), (2017).
Trulear, M. G., Characklis, W. G. Dynamics of biofilm processes. Journal (Water Pollution Control Federation). 54 (9), 1288-1301 (1982).
Machineni, L., Rajapantul, A., Nandamuri, V., Pawar, P. D. Influence of Nutrient Availability and Quorum Sensing on the Formation of Metabolically Inactive Microcolonies Within Structurally Heterogeneous Bacterial Biofilms: An Individual-Based 3D Cellular Automata Model. Bulletin of Mathematical Biology. 79 (3), 594-618 (2017).
Jiao, Y., et al. Identification of Biofilm Matrix-Associated Proteins from an Acid Mine Drainage Microbial Community. Applied and Environmental Microbiology. 77 (15), 5230-5237 (2011).
Flemming, H. C., Wingender, J. The Biofilm Matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 632-633 (2010).
Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39 (2), 109-119 (2000).
Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (3), 783-788 (2009).
Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
Swartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus biofilm analysis. Journal of Visual Experiments. (46), e2470 (2010).
Werner, E., et al. Stratified Growth in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
Wilson, C., et al. The Quantitative Assessment of Pseudomonas aeruginosa (PA)14 Biofilm Surface Coverage on Slippery Liquid Infused Polymer Surfaces (SLIPS). International Journal of Nanotechnology in Medicine & Engineering. 3 (3), 35-42 (2018).
Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (94), 52467 (2014).
Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
Kim, J., Park, H. -. D., Chung, S. Microfluidic Approaches to Bacterial Biofilm Formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science Progress. 94 (4), 431-450 (2011).
Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
Chandra, J., Kuhn, D. M., Mukherjee, P. K., Hoyer, L. L., McCormick, T., Ghannoum, M. A. Biofilm Formation by the Fungal Pathogen Candida albicans: Development, Architecture, and Drug Resistance. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5385-5394 (2001).
Vasconcelos, M. A., et al. Effect of Algae and Plant Lectins on Planktonic Growth and Biofilm Formation in Clinically Relevant Bacteria and Yeasts. BioMed Research International. 2014, 9 (2014).
Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural Features for Image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 3 (6), 610-621 (1973).
. Biofilm Morphology Suite Available from: https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git (2018)
. Cyverse Available from: https://user.cyverse.org/services/mine (2018)
Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New Device for High-Throughput Viability Screening of Flow Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 76 (13), 4136-4142 (2010).
Ding, A. M., Palmer, R. J., Cisar, J. O., Kolenbrander, P. E. Shear-Enhanced Oral Microbial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 76 (4), 1294-1297 (2010).
Diaz De Rienzo, M. A., Stevenson, P. S., Marchant, R., Banat, I. M. Effect of biosurfactants on Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus biofilms in a BioFlux channel. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (13), 5773-5779 (2016).
Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus Biofilm: A Complex Developmental Organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
Tremblay, Y. D. N., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. High-Throughput Microfluidic Method To Study Biofilm Formation and Host-Pathogen Interactions in Pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (8), 2827-2840 (2015).
Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus Adherence and Colonization. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 73 (3), 407-450 (2009).
Díez-Aguilar, M., Morosini, M. I., Köksal, E., Oliver, A., Ekkelenkamp, M., Cantón, R. Use of Calgary and Microfluidic BioFlux Systems To Test the Activity of Fosfomycin and Tobramycin Alone and in Combination against Cystic Fibrosis Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01650-01717 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Sutlief, A. L., Valquier-Flynn, H., Wilson, C., Perez, M., Kleinschmidt, H., Schofield, B. J., Delmain, E., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System. J. Vis. Exp. (143), e58926, doi:10.3791/58926 (2019).

Automatically Generated