Automatically Generated

Summary

Qui, descriviamo l’uso di un bioreattore di throughput più elevato microfluidici accoppiato con un microscopio a fluorescenza per l’analisi degli effetti di sollecitazione di taglio su biofilm di Pseudomonas aeruginosa che esprimono le proteine fluorescenti verde, compreso lo strumento istituito, la determinazione delle proprietà morfologiche, tasso di crescita e copertura di biofilm.

Abstract

Un throughput più elevato microfluidica in vitro bioreattore accoppiato con microscopia di fluorescenza è stato utilizzato per studiare la crescita di biofilm batterico e morfologia, compreso Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa). Qui, descriviamo come il sistema può essere utilizzato per studiare la cinetica di crescita e le proprietà morfologiche come la rugosità superficiale e tessiturale entropia di p. aeruginosa ceppo PA01 che esprime una proteina fluorescente verde avanzata (PA01-EGFP ). Un protocollo dettagliato descriverà come coltivare e culture PA01-EGFP del seme, come impostare il microscopio e autorun e condurre l’analisi di immagine per determinare il tasso di crescita e le proprietà morfologiche utilizzando una varietà di forze di taglio che sono controllati dalla dispositivo microfluidico. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di una tecnica per migliorare lo studio dei biofilm PA01-EGFP che alla fine può essere applicato nei confronti di altri ceppi di batteri, funghi o alghe biofilm utilizzando la piattaforma microfluidica.

Introduction

Qui, dimostriamo un metodo per misurare l’effetto dello shear stress sulla formazione di fluorescente biofilm PA01 Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa) utilizzando un sistema automatizzato microfluidici throughput più elevato.

I biofilm sono comunità di microrganismi, quali batteri, organizzati da una sostanza polimerica extracellulare che sono fissati ad un supporto e sono in genere presenti all’interfaccia tra un liquido e un solido superficie¹. Queste comunità di biofilm possono essere vantaggiosa per l’ambiente, come migliorare la qualità dell’acqua in linee di approvvigionamento idrico e nel biorisanamento di recalcitranti i composti^2,3. Tuttavia, i biofilm possono anche essere altamente nocivi per la salute umana con conseguenze indesiderabili. Ad esempio, dispositivi medici, quali protesi di anca e ginocchio, sono un tipo di superficie dove accumulo di biofilm è stata una sfida e provoca gravi complicazioni mediche^4,5. Biofilm possono anche entrare in sistemi naturali di acqua, come fiumi e laghi e infiltrarsi acqua tubazioni che conducono alla contaminazione di batteri nell’acqua potabile conseguente infezioni^6,7,8. Biofilm formato negli ambienti marini aderire alle navi e altri substrati artificiali e presentare un grave problema economico e ambientale come maggiore attrito porta ad aumento carburante consumo^9,10. Rivestimenti antimicrobici, quali tributilstagno, sono stati sviluppati per evitare questi problemi ma sono tossici per la vita marina¹¹.

P. aeruginosa è un batterio gram-negativo con elevate capacità prospera in una varietà di condizioni ambientali e nutrimental¹². P. aeruginosa è una causa comune delle infezioni comunità – e ospedale-acquistata e trovato per essere strettamente associati a lesioni, quali gravi ustioni e ospiti immunocompromessi, come nella fibrosi cistica (CF)^{5,12, 13}, AIDS e cancro pazienti^5,13. La formazione di biofilm di p. aeruginosa è stata collegata più seriamente al CF, dove le infezioni polmonari croniche sono la principale causa di morte per questa malattia⁵.

Un ceppo di riferimento di p. aeruginosa, PA01, viene utilizzato in questa relazione e geneticamente modificato per esprimere una proteina fluorescente verde avanzata (PA-EGFP). EGFP rappresenta una forma mutante di GFP con maggiore proprietà di fluorescenza che permette in situ biofilm analisi con microscopia di fluorescenza^14,15,16. Questo tipo di analisi di fluorescenza è vantaggioso per lo studio dei biofilm perché GFP non interferisce significativamente con la crescita delle cellule e funzione¹⁷. Ad esempio, le cellule di Escherichia coli che sono stata contrassegnate con GFP è cresciuta bene e continuamente senza aver subito effetti tossici rispetto il controllo batteri¹⁷. Altri rapporti di motivare questa affermazione^18,19,20. Inoltre, l’uso di un reporter fluorescente quali EGFP è semplice e veloce, ma saranno misurate cellule vive solo perché le cellule morte rapidamente cessano di essere flourescente²¹.

Biofilm possono crescere nelle varie condizioni ambientali, compresi quelli con diverse portate. Ad esempio, film può crescere in alto shear stress, come ad esempio nei fiumi, dove le condizioni di flusso di acqua alta portano ad una maggiore diversità microbica²². Al contrario, acqua stagnante in stagni o biofilm orali esperienza un molto inferiore al taglio forza²³. Oltre alla portata, ci sono altri fattori che influenzano l’adesione di biofilm, compresa la rugosità superficiale e idrofobicità, composizione media, e anche il batterico delle cellule superficiali^{1,4,7, 24}. condizioni possono anche causare la variazione della struttura spaziale o la morfologia di un biofilm. Questo include condizioni ambientali quali la sollecitazione di taglio esercitata da un fluido in movimento o gradienti nella disponibilità di nutrienti e fattori biologici quali le specie presentano nel sistema, motilità delle cellule e le proteine specifiche presenti in extracellulare sostanza polimerica^25,26,27. In alcune condizioni, il biofilm sarà simile a Prato (liscio e piatto), mentre in altre condizioni il biofilm sarà ruvido, soffice, o anche fungo-come²⁸. Mentre la differenza qualitativa tra prati di biofilm e strutture del fungo può essere visto chiaramente in immagini microscopiche, comprendere la relazione tra la struttura del film e processi biologici all’interno del film richiede sistematiche e quantitative metodi di descrizione della morfologia. Proprietà morfologiche suggerito per studio dai ricercatori includono porosità, dimensione frattale, lunghezza diffusionale, area microcolony presso il substrato, microcolony volume, coefficiente di scabrezza e tessiturali entropia^29,30 .

Bioreattori sono utilizzati nello studio dei biofilm per imitare la vita reale condizioni³¹. Gocciolamento flusso reattori (DFR) rappresentano un ambiente di basso-shear dove nutrienti nei media scorrono lentamente le cellule che si collega a una superficie nel tempo per formare un biofilm con una cella ad alta densità³². Reattori di CDC vengono riempiti di bioreattori che creano un ambiente fluido di alta sollecitazione di taglio di controllo di una bacchetta che continuamente ruota all’interno della media serbatoio³³. Questi tipi di bioreattori sono semplici da impostare, ma sono limitati nell’ambito a causa delle dimensioni relativamente basso del campione, l’elevato consumo dei media, grandi quantità di rifiuti a rischio biologico prodotto da media del gocciolamento flussi che vanno da 125 µ l/minuto per reattori di flusso gocciolare a più di 1 mL/min per i reattori di CDC e la necessità di grandi quantità di autoclave di vetro e rifiuti media³⁴. Biofilm non crescono in modo uniforme su tutta la superficie in un reattore di flusso goccia perché il taglio basso dei media provoca finali lungo i più grandi conglomerati di batteri di p. aeruginosa di conseguenza, la crescita di biofilm non è molto liscia e i campioni irregolari non possono essere facilmente analizzabile con microscopia di fluorescenza^35,36 .

Alcune limitazioni di bioreattore comuni sono superare utilizzando un bioreattore medio-throughput microfluidica, dove solo millilitri di media sono necessari, e le piastre di reazione sono piccole e facilmente eliminabile dopo sterilizzazione in autoclave³⁷. Inoltre, a seconda del numero di pozzi, molte repliche possono essere eseguite in un solo reattore esegue, che fornisce una quantità sufficiente di dati per condurre analisi statistiche significative. Nella Figura 1sono mostrati i diversi componenti del sistema microfluidico-microscopia che permettono condizioni controllate, tra cui temperatura e flusso tasso^38,39,40. Il bioreattore è accoppiato con microscopia di fluorescenza per visualizzare la fluorescenza del tag EGFP in PA01 sotto basso applicato attraverso condizioni di taglio alto che imitano scenari più realistici che si verificano nell’ambiente o in campo biomedico.

Figura 1 : Singoli componenti del sistema microfluidico. I singoli componenti sono elencati da sinistra a destra: 1. telecamera CCD, 2. ad alta risoluzione microscopio invertito con fase automatizzata, Automated modulo per fluorescenza e modulo Autofocus, 3. portapiastre, 4: Imaging system Interface, 5: fase di microscopio manuale Controllo, 6: Vapor trappola, 7: Imaging system Controller (Controller di temperatura compresi), 8: controller Hardware, 9: Controller di fluorescenza, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: External Hard Drive per la memorizzazione di immagini, 12: PC Workstation. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un estratto della piastra microfluidica è illustrato nella Figura 2. Le piastre più comunemente usate è costituito da 48 pozzetti. Un esperimento richiede un ingresso e un’uscita wells, un totale di 2 pozzi. Questo consente per 24 esperimenti simultanei che possono essere eseguiti con varie condizioni sperimentali, quali ceppi batterici, trattamenti antimicrobici e media varia da canale a canale e controllato il flusso di shear per ogni colonna di sei canali. La temperatura sperimentale è anche controllata con una regolazione della temperatura in tutta la piastra. I canali microfluidici mostrano che ogni canale ha una serpentina regione per fornire sufficiente pressione posteriore e taglio controllato.

Figura 2: visualizzazione della finestra di visualizzazione e canali microfluidici. Due pozzi di aspirazione e mandata con i canali microfluidici che li collega sono evidenziati con coloranti rossi e verdi. La tintura rende visibile una regione serpentina in ciascun canale che crea sufficiente pressione posteriore e taglio controllato durante il flusso del fluido. Ogni canale di visualizzazione (all’interno del cerchio rosso) può essere imaged con lunghezze d’onda desiderate. Vengono mostrati campo luminoso (in alto) e fluorescente (in basso) immagini di microscopia di un singolo canale con un biofilm PA01-EGFP utilizzando un obiettivo X 20. Barra della scala = 80 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una guida passo per passo è fornita per consentire agli utenti di bioreattori microfluidici che sono accoppiati con microscopia di fluorescenza per condurre esperimenti di biofilm romanzo utilizzando ambienti differenti del taglio. Questo metodo consentirà l’espansione degli esperimenti che coinvolgono altri microrganismi oltre a batteri, quali funghi e alghe, che dispongono di applicazioni mediche e ambientali^41,42,43. L’approccio dettagliato viene descritto come cultura PA01-EGFP, inoculare una piastra 48 pozzetti e impostare il dispositivo microfluidico e software, impostare il microscopio a fluorescenza e dimostrare l’analisi del software per ottenere la copertura del biofilm, il tasso di crescita, e proprietà morfologiche come la rugosità superficiale.

Protocol

1. Media preparazione Preparare i supporti minimi (MM) con 0,25% del glucosio. Per rendere L 1 mm con 0,25% glucosio, aggiungere 200 mL di soluzione salina sterile M9, 2 mL di sterile 1m MgSO4, 100 µ l di sterile 1m CaCl2e 12,5 mL di sterile 20% (p/v) di glucosio a acqua (dH2O) ad un volume finale di 1 L. Trasferire file multimediali necessari per una bottiglia sterile usando tecniche sterili. Preparare la quantità necessaria a seconda del numero di canali adoperati. In genere, ogni canale richiede 200 µ l per l’innesco, 300 µ l per semina e 1300 µ l per l’esperimento di 24 h. Posizionare la bottiglia in un incubatore o bagnomaria impostato alla temperatura sperimentale. I media dovrebbero essere alla temperatura di esperimento prima dell’uso per evitare bolle formando i microcanali. 2. preparazione di una cultura durante la notte e sperimentale di PA01-EGFP. Posto 15 mL di terreno sperimentale in un matraccio da sidearm sterile e inoculare con una o due colonie da una piastra di agar striato PA01-EGFP. Espandere la cultura per 12-16 h su una tabella di incubatore/agitatore a 37 ° C e 180-220 giri/min. Misurare il OD600 della cultura durante la notte. Quando il OD600 è maggiore di 0,80, diluire la cultura durante la notte per la finale OD di 0,8 utilizzando freschi MM. luogo della cultura sperimentale in un incubatore o un bagnomaria a 37 ° C fino a quando necessario per il seeding dei canali microfluidici. Verifica il OD600 nuovo immediatamente prima della semina per garantire che non è cambiato significativamente dalla destinazione OD600, 0,8 in questo caso. 3. attrezzature avvio Impostare la stazione di sistema secondo la Guida utente, simile all’impostazione in Figura 1. Per evitare un errore nel collegamento dello strumento al software, è possibile accendere lo strumento nel seguente ordine:PC WorkstationModulo per fluorescenza. Assicurarsi che l’otturatore di fluorescenza è ON (luce blu dal pulsante di scatto sul)Controller hardwareImaging system Controller (Vedi Tabella materiali)Telecamera CCDImaging Station (microscopio)Nota: La temperatura della piastra riscaldata dovrebbe essere regolata alla temperatura desiderata sperimentale. Avviare l’applicazione di controllo e immettere il numero di targa si trova sull’etichetta sul lato della piastra.Nota: Dopo l’applicazione di controllo avvio ci saranno due finestre di applicazione separati, uno per il software che controlla il software di microscopio/imaging e uno per il modulo di controllo che controlla la pompa e l’interfaccia piastra. Questo è mostrato in Figura S1, dove il menu “Multi dimensionale acquisizione” è aperto sulla parte superiore e il modulo di controllo è impostato per un autorun sul fondo. 4. innesco e semina la piastra microfluidica Nota: L’adescamento, la semina, batterica allegato e crescita sono illustrati nella Figura 3. Rimuovere la piastra microfluidica 48 pozzetti dalla confezione facendo attenzione a non toccare la superficie di vetro nella parte inferiore della piastra. Pulire il vetrino nella parte inferiore della piastra bene con un panno per lenti, un panno pulito o un panno basso wipe. Per adescare i canali microfluidici, Pipettare 200 µ l di 37 ° C MM nell’uscita bene, facendo attenzione ad evitare bolle. Inserire la piastra il portapiastre e pulire l’interfaccia con l’etanolo, che permette di asciugare, prima di sigillarlo sul palco piastra. In Modalità manuale del modulo di controllo, impostare fluido come LB a 37 ° C e Max taglio alle 5,00 dyne/cm2. Fare clic sui pozzi di uscita per attivare il flusso dall’uscita all’ingresso ben, i canali di adescamento. Dopo 5 min di adescamento, mettere in pausa il flusso per preparare per il seeding. Con attenzione togliere la piastra dal palco e pipettare residua media dall’output ma non rimuovere alcun dei media dal cerchio interno che conduce ai canali microfluidici. Per i canali sperimentali del seme, prima Dispensare 300 µ l di MM nell’ingresso ben seguita da pipettaggio 300 µ l di coltura batterica nell’uscita bene nell’uscita bene. Inserire la piastra il portapiastre assicurandosi di pulire l’interfaccia prima di posizionarlo sul piatto. Il modulo di controllo, concentrarsi su un unico canale utilizzando il feed dopo aver piazzato il portapiastre sul palco microscopio videocamera live. Durante il monitoraggio visivamente dal feed dal vivo, riprendere il flusso alle 1.00-2.00 dyne/cm2 per circa 2-4 e consentire alle cellule di entrare nel canale sperimentale, ma non nei canali di serpentino. Lasciare la piastra sul palco a temperatura controllata per 1 h consentire collegamento delle cellule. Durante l’incubazione di 1 h, è possibile impostare il software modulo di controllo e montaggio per l’autorun (passo 5).Nota: La quantità di tempo necessaria per il seeding variano con i media e organismo, quindi devono essere strettamente monitorato dal feed dal vivo fino a quando non ottimizzato e utilizzato come un termine generale. Semina in tutta la piastra può variare che richiederebbe più tempo di flusso applicata ad alcune colonne di canali per il seeding completo. Dopo il periodo di attaccamento, delicatamente togliere la piastra dal palco e pipettare i batteri dall’output prima evitando di disturbare il canale. Con una punta di pipetta nuova, rimuovere il supporto dai pozzetti inpui. Figura 3 : Panoramica sperimentale di adescamento, semina e pignoramento di PA01-EGFP nei canali microfluidici. L’adescamento, semina e allegato è descritto. Il primo passo di priming richiede supporto fresco introdotto all’uscita. La semina comporta volumi uguali dei media e batterico cultura nell’input e output pozzi, rispettivamente. La cultura non deve passare il segmento di visualizzazione del canale sperimentale (linea rossa) per evitare l’intasamento dei canali serpentino. Dopo il periodo di incubazione è finita, media fresca scorre continuamente dall’ingresso, alla camera di osservazione e alla presa. Questo consente di avviare l’attaccamento e la crescita di biofilm batterico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 5. impostazione del Software Nel software, aprire “Più dimensionale acquisizione” per controllare l’acquisizione di immagini del microscopio. Sotto il menu “Main”, selezionare “Timelapse”, “Multiple posizioni di fase” e “Lunghezze d’onda Multiple” (Figura S1A). Configurare le impostazioni di salvataggio , creare un semplice Nome di Base, assicurandosi che sia selezionato il nome base incremento, se il file esiste . Fare clic su Seleziona cartella per selezionare la cartella in cui verranno salvati tutti i file. Includi dettagli essenziali dell’esperimento nella Descrizione. Sotto la scheda Timelapse , regolare la durata del tempo sperimentale a 24 h. Per controllare quante volte le immagini sono acquisite, impostare l’ Intervallo di tempo in modo che le immagini sono acquisite ogni 5 min in tutto l’esperimento. Il Numero di intervalli di tempo si regola automaticamente con i parametri impostati. Impostare le posizioni di fase utilizzando il feed nel microscopio luminoso campo, consentendo la messa a fuoco e corretto posizionamento videocamera live. A partire con l’obiettivo 10x, concentrarsi sul centro del canale, che si trova sopra o sotto i numeri di canale incisi sulla piastra. Passare all’obiettivo X 20, trovare l’area di visualizzazione ottimale e il piano focale all’interno del canale. Aggiungere la posizione all’elenco o sostituire la posizione di canale preimpostato con le nuove impostazioni. Sotto il menu di lunghezze d’onda , è possibile impostare il numero di lunghezze d’onda a 3. Per lunghezza d’onda 1 (W1), selezionare il modulo CAM 100% FITC con un tempo di esposizione di 10 ms. Per lunghezza d’onda 2 (W2), selezionare il campo chiaro 50% CAM 50% VIS con un tempo di esposizione minimo di 3 ms per lunghezza d’onda 3 (W3), impostare come il filtro Chiuso tutti così nessuna luce rimane l’ultimo canale tra tempi di acquisizione. Quando si configura il modulo di controllo, verificare che il manuale eseguito è stato arrestato. Nel menu Esecuzione automatica modifica sotto la scheda Installazione di protocollo , impostare un nuovo protocollo per 24 ore di tempo di durata, che scorre in avanti alla velocità di taglio desiderata. Velocità di taglio è vario per studiare l’effetto della crescita di biofilm con velocità di taglio. Fare clic su Aggiungi e Salva il protocollo. Sotto la scheda Installazione di sequenza , è necessario creare una nuova sequenza selezionando LB@37degrees come il fluido di predefinito per tutti i canali. In Iterazione passo 1, per i canali 1-12, selezionare il protocollo con la velocità di taglio desiderata e attivare tutti i canali. Per i canali 13-24, selezionare il protocollo con la seconda velocità di taglio desiderata e attivare tutti i canali. Selezionare applica e Salva la sequenza. Nel menu esecuzione automatica , selezionare la sequenza salvata da utilizzare per l’esecuzione automatica. 6. il programma di installazione di Biofilm crescita esperimento a tempo Pipettare un massimo di 1.300 µ l di sterili MM nell’apposito ingresso ben della piastra microfluidica. Posizionare la piastra torna sul palco piastra e pulire l’interfaccia con l’etanolo, permettendo l’etanolo per asciugare completamente, prima di sigillare la piastra. Posizionare la piastra in scena sul palco microscopio ed essere sicuri che il Protocol (s) e sequenze sono impostati correttamente. Selezionare Avvia per avviare l’autorun seguito rapidamente facendo clic su Acquisisci per avviare la raccolta di immagine del microscopio. Regolare la messa a fuoco e il posizionamento di tutte le posizioni di fase tra acquisizioni di immagine. Selezionare pausa e, utilizzando la modalità di immagine live nella lunghezza d’onda del campo luminoso, selezionare Vai a per visualizzare ogni posizioni di fase. Impostare nuove impostazioni selezionando impostato su corrente. Fare clic su Riprendi prima la prossima volta di acquisizione programmata. 7. esaminare e analizzare sequenze di immagini dopo l’esperimento di crescita di Biofilm temporizzato Per esaminare ciascun canale seguendo le 24 h autorun, nel software, aprire Rivedere dati multidimensionali, sotto Strumenti di analisi. Fare clic su selezionare il File Base | Selezionare la Directory per passare alla cartella con sequenze di immagini per l’esperimento di interesse. Nell’elenco dei set di dati nella cartella che viene visualizzata, selezionare il nome di base di dati di interesse. Dopo aver selezionati i dati di interesse, fare clic su Visualizza per esaminare questi dati. Selezionare una lunghezza d’onda di rivedere i dati sotto la finestra di lunghezza d’onda (Figura S2). Modifica la sequenza di immagini per ogni canale selezionando il numero del canale in Posizione di fase e utilizzando i controlli video per analizzare i dati per il tempo di 289 punti (supponendo che le immagini sono ottenute ogni 5 min per un lasso di tempo di 24 ore). Prendere nota dei dati di crescita utilizzabile.Nota: In ogni canale, Guarda per lo sviluppo di bolle d’aria e zoccoli che possano disturbare la crescita di biofilm all’interno del canale, che interessano i dati. Tuttavia, se questi si verificano più tardi nei dati di esecuzione, prima di queste circostanze può essere trovate utile. Dopo aver esaminato e selezionare i dati desiderati per l’analisi, creare pile di immagini per ogni canale. Sotto il menu File , selezionare Open speciale | Compilare Stack | Numerate i nomi. Nella finestra Stack di costruire , selezionare il pulsante Seleziona immagine prima quindi selezionare la prima immagine per lo stack nella cartella del file; Selezionare il pulsante Seleziona Ultima immagine e quindi selezionare il file corrispondente all’ultima immagine nello stack. Fare clic su OK per aprire lo stack con tutte le immagini del canale in ordine cronologico. Pile possono essere salvati sotto il menu File , Salva come file tiff.Nota: Non creare pile con le immagini di pollice. Questi file non sono molto utili e possono essere eliminati per risparmiare spazio sul disco rigido. Inoltre, i file di immagine vengono salvati come indicato di seguito:BASE NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #.Ad esempio, 07062018_W1FITC 100_s12_t112 è per il canale 12, tempo punto 112, immagine nei primi dati di lunghezza d’onda-FITC fotocamera 100% con il nome di base “07062018”. Infine, selezionare Salva con nome dal menu a discesa File per salvare la sequenza come una pila di tiff. Pile possono essere anche sovrapposti e salvati come un film. Questo problema è risolto nel passaggio 9. Prima di quantificare la % di copertura superficiale, calibrare le distanze di immagine. Strumenti di analisi, fare clic su Calibra Distanze. Selezionare la misura di calibrazione appropriata e fare clic su applica a tutte le immagini aperte. Mentre lo stack è sulla prima immagine della sequenza, fare clic sul pulsante di soglia . Utilizzare Soglia automatica per gli oggetti di luce alla soglia per segnale fluorescente (lunghezza d’onda FITC) e Soglia automatica per gli oggetti scuri alla soglia nel campo luminoso. Regolare la soglia per la copertura che rappresenta la copertura dell’immagine. Per le soglie fluorescente, utilizzano un canale con cellule non fluorescente di stabilire qualsiasi segnale di fondo e impostare il valore di soglia minima per escludere il segnale rilevato nei canali contenenti tali non fluorescente cellule affinché la misurazione del segnale viene non sopravvalutare l’area della fluorescenza. Questo può essere diverso da una esecuzione al quindi è una buona idea di utilizzare almeno uno, se non di più, canale (s) per i controlli non fluorescenti. Per le soglie di campo luminoso, se tutte le celle non sono coperti dalla firma della soglia arancione, regolare il valore di soglia massima tramite la barra di scorrimento o utilizzando l’ Immagine di soglia (che si trova sotto gli Strumenti di analisi) in modo che tutte le cellule sono coperto ma è escluso qualsiasi sfondo.Nota: Mentre questi valori di soglia idealmente dovrebbe essere utilizzati per tutte le immagini all’interno di una pila e per tutti i canali, i valori di soglia selezionati per un immagine/canale potrebbero non essere appropriati per altre immagini o canali, pertanto che l’utente potrebbe essere necessario regolare l’intervallo di soglia periodicamente. Per questo motivo, è una buona idea registrare sempre il massimo e i valori di soglia minima utilizzati in caso di necessità di dati riesaminati più tardi. Per quantificare la copertura, in Strumenti di analisi, fare clic su Visualizza le statistiche di regione. Assicurarsi che la Soglia di utilizzo è selezionata, l’ Intera immagine è selezionata e sotto I dati ottenuti, assicurarsi che siano selezionate le misure/impostazioni desiderate (zona di soglia, media, deviazione standard, min, max e soglia % zona). Fare clic su Apri registro e assicurarsi che DDE file è selezionato prima di scegliere OK. Selezionare Microsoft Excel e fare clic su OK. Nel foglio di calcolo che si aprirà, fare clic su Dati di registro per registrare automaticamente le misurazioni dell’immagine analizzata. Lasciando aperto il foglio di calcolo, utilizzare lo stesso foglio per raccogliere tutti i dati di analisi di immagine per un’unica pila. Nello stack, andare alla quarta immagine e soglia per le impostazioni ottimali. Fare clic su Registro dati nella schermata Visualizza le statistiche di regione e vengono registrati i valori nel foglio di lavoro. Ripetere l’operazione per l’analisi di immagini ogni 15 min. 8. altri script di analisi tra cui morfologia e superficie copertura misura utilizzando Python dalla Suite di morfologia di Biofilm Installare una distribuzione di Python 3.6 che include moduli standard scientifici utilizzando una distribuzione di Python standard scientifica come Anaconda, disponibile presso https://www.anaconda.com/download. Ottenere la Suite di morfologia di Biofilm da GitHub in un browser di navigazione verso https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, poi selezionare Clone o scaricare (tasto verde) e selezionare Scarica Zip. Decomprimere il file e spostare le cartelle di codice in una cartella di lavoro. Misura percentuale di copertura con soglia copiando lo stack di immagine nella cartella “copertura”. Utilizzare una finestra di terminale per accedere a tale cartella e quindi eseguire lo script con il comandopitone bfCoverage.py tiffStackName.tifda riga di comando, dove tiffStackName.tif è il nome del file contenente lo stack di tiff di immagini. Verrà creato un file di testo contenente le misure di copertura in ogni momento con il nome tiffStackName.txt e un file di grafica con un terreno di copertura come funzione del tempo verrà creata con il nome tiffStackName.png. Utilizzare la stessa procedura specificata nel passaggio 8.3 per misurare le altre caratteristiche morfologiche: biofilm accumulo, coefficiente di scabrezza e tessiturale entropia. È possibile utilizzare lo script bfAcc.py per la misurazione di accumulazione, lo script roughCoef.py per la misura del coefficiente di rugosità e lo script TEvsTime.py per la misura di entropia tessiturali. 9. altre applicazioni Software – facendo sovrapposizioni e film Se si utilizzata lunghezze d’onda multiple, creare pile di sovrapposizione tra cui queste lunghezze d’onda. Aprire tutti gli stack di interesse e calibrare la distanza come fatto nel passaggio 7,6. In Strumenti di analisi, selezionare Sovrapposizione immagini. Impostare le fonti come gli stack di interesse. Nello stack di FITC, fare clic sul cerchio arcobaleno e selezionare filtro di colore verde per essere aggiunto al fine di evidenziare questa lunghezza d’onda. Utilizzare bal per regolare la sovrapposizione, in modo che lo stack FITC è evidente nelle immagini. Dopo aver effettuate tutte le regolazioni, selezionare Tutti gli aerei per entrambi gli stack e fare clic su applica. Salvare le sovrapposizioni nello stesso modo come descritti nel passaggio 7,5 pile o come un film descritto al punto 9.2. Per salvare pile o sovrapposizioni come filmato timelapse, sotto Standard MM e Stack, fare clic su Crea filmato. Selezionare l’origine come lo stack o la sovrapposizione che è desiderato. Fare clic su Salva e salvare come un Microsoft Video 1 con una qualità impostata tra 70-80.

Representative Results

Figura 4 un dimostra l’area con soglia percentuale nel tempo da un 24h eseguire a flussi di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2. Il biofilm copertura o per cento soglia superficie (C [%]) era diversa per tutte le impostazioni di taglio tre. La copertura di biofilm è stata più veloce a forze di taglio di 1,0 dyne/cm2 , dove la zona di soglia aumentata da 2-5% a 100% dopo 200 min di crescita ed ha raggiunto una fase stazionaria dopo 400 min. A 0,5 dyne/cm2, la copertura di biofilm era in ritardo e ha cominciato ad aumentare a 400 min raggiungendo una copertura del 100% dopo 800 min. Il taglio più basso a 0,2 dyne/cm2 ha dimostrato chiaramente l’aumento più lento in biofilm copertura, dove la percentuale di copertura ha cominciato ad aumentare a 500 min ma non raggiunse mai oltre la soglia del 65%. Questi risultati hanno indicato il taglio ha avuto un’influenza diretta in biofilm copertura della superficie. Il taglio superiore sembrava essere una condizione più ottima per la crescita di biofilm, forse dovuto al fatto che il supporto fornito i batteri con più sostanze nutritive in modo che il biofilm possono proliferare più velocemente. Figura 4: area percentuale soglia, accumulo di biofilm totale, coefficiente di scabrezza e tessiturali entropia. area di soglia) percentuale (C [%]) nel tempo utilizzando 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2 sopra un 24h periodo di tempo. Dati sono stati ottenuti da un canale per ogni condizione di taglio. b) totale accumulo di biofilm (misura relativa) come funzione del tempo utilizzando 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2 sopra un 24h periodo di tempo. Le linee nere sono minimi quadrati si adatta a un modello esponenziale. Dati sono stati ottenuti da un canale per ogni condizione di taglio. c) rugosità coefficiente di PA01-EGFP utilizzando i valori di sollecitazione di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2 monitorati oltre 24 h. dati è stata ottenuta da un canale per ogni condizione di taglio. d) tessiturale entropia di PA01-EGFP utilizzando i valori di sollecitazione di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2. Dati sono stati ottenuti da un canale per ogni condizione di taglio (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 b è coerente con i risultati mostrati in Figura 4un. L’accumulo di biofilm (N[rel]) è stato misurato basato sul presupposto che il segnale GFP in un punto in un’immagine è proporzionale alla densità di cellule vive in quella posizione. Viene illustrato che accumulo di biofilm misura relativa totale aumentato come funzione del tempo utilizzando 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2 sopra un 24h periodo di tempo, e il tasso di crescita è diminuito da sollecitazione di taglio massima alla minima sollecitazione di taglio. C’è un periodo di tempo chiaro dando una crescita esponenziale da cui può essere calcolato un tasso di crescita quantitativa. Figura 4 c viene illustrato il coefficiente di scabrezza (Run) a flussi di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2. Rugosità superficiale, quantificato mediante il coefficiente di scabrezza, misura la varianza nel profilo spessore del film. La definizione formale è dove Tho è l’io-th misurazione dello spessore, Tuna è lo spessore medio, e N è il numero di spessore misura30. La procedura descritta in questa indagine misura lo spessore associato con le cellule viventi. Una disposizione piana delle cellule consente di ottenere un coefficiente di rugosità pari a zero mentre significative variazioni di spessore dalla media produrrà un coefficiente di rugosità maggiore di uno. Simile all’influenza di taglio sul tasso di crescita e la copertura di soglia percentuale del film, il biofilm esposte diverse topografie nel corso del tempo. Nel complesso, Runa diminuita nel corso del tempo per tutte le condizioni di taglio, che indica che tutte le superfici è diventato più fluide. Tuttavia, in confronto il taglio minimo di 0,2 dyne/cm, le impostazioni di taglio maggiore di 0,5 e 1,0 dyne/cm2 ha provocato una superficie più liscia nel tempo che indica che un veloce flusso di shear contribuito alla superficie più liscia e più uniforme e il taglio più alto di 1,0 dyne/cm2 , raggiungendo di sotto dei 0,2 Runa. La scorrevolezza, regolarità o grossolanità di una superficie può anche essere espressa in tessiturale entropia (TE). TE è una proprietà utilizzata nell’analisi dell’immagine per misurare il grado di casualità in un’immagine bidimensionale. Relativo calcolo si basa sulla matrice grigio livello co-occorrenza, definita da Haralick et al., che esamina se i valori dei pixel in un’unica sede siano correlati con i valori dei pixel in un’altra posizione44. Un alto grado di correlazione porterà a bassa entropia. Figura 4 d raffigura il TE a flussi di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2. Il TE è aumentato nel corso del tempo per tutte le condizioni di taglio ma la sollecitazione di taglio massima a 1,0 dyne/cm ha raggiunto la massima TE (1.0) precedenti alle sollecitazioni di taglio inferiore a 900 min. Il taglio minimo di 0,2 dyne/cm2 aveva il TE più basso (0,8), raggiungendo il suo massimo dopo 1.000 min. Tuttavia, la sollecitazione di taglio intermedia di 0,5 dyne/cm2 raggiunto sua massima TE (1.2) molto più tardi rispetto alle condizioni di sollecitazione di taglio di alta o bassa. Il coefficiente di scabrezza e TE misurare diverse caratteristiche. Mentre una pellicola piana avrebbe un coefficiente di rugosità bassa e bassa entropia, un film con significative variazioni di spessore avrebbe un coefficiente di rugosità elevata ma potrebbe ancora essere bassa entropia se la variazione è sinusoidale, piuttosto che casuale. In questo caso, Run diminuito con una maggiore sollecitazione di taglio e momento mentre le tendenze di TE non possono essere direttamente correlate shear stress applicato alla formazione del biofilm nel corso del tempo. Figura S1 : Acquisizione del software windows controllo immagine. Finestra di software con menu Multi dimensionale acquisizione aprire (in alto). Modulo di controllo impostato per un AutoRun (in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura S2 Acquisizione del software per l’analisi dei dati immagine. Finestra dell’applicazione dopo aver selezionato il Set di dati di interesse utilizzando lo strumento di Revisione Multi dimensionale dei dati dal menu Strumenti di analisi . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La procedura di analisi di immagine e sistema microfluidico discusso qui si concentra sull’esecuzione di microfluidica biofilm esperimenti per determinare le proprietà morfologiche che non richiedono le informazioni completo tridimensionale in genere trovate da confocale studi del microscopio. Questi hanno incluso microcolony copertura di substrato (percentuale di copertura), rugosità di superficie misurata dal coefficiente di scabrezza e tessiturale entropia. Un metodo per la stima totale biofilm relativa accumulazione delle cellule inoltre è presentato da che i tassi di crescita nel registro fase può essere calcolato.

Ci sono diversi passi piccoli ma significativi che dovrebbero essere evidenziate in questo metodo. Pulendo l’interfaccia con l’alcol aiuta a evitare la contaminazione di altri batteri in andando da esperimento a esperimento ma anche da un pozzetto a altro in un esperimento. Semina e priming sono anche molto importanti perché innesco permette all’utente di determinare quali canali sono consentendo il supporto di fluire attraverso i canali senza disturbi o intasamento. Canali non dovrebbero anche essere disturbato (cioè dovrebbero essere costantemente pieno di media) dopo priming per aumentare le probabilità di un esperimento riuscito senza bolle d’aria o di intasamento. Il passo di semina può essere variato secondo il tipo di batteri e quindi dovrebbe essere ottimizzato per collegamento delle cellule. Ad esempio, se le cellule non sembrano collegare, superficie modifiche potrebbero essere necessario verificarsi sulla piastra microfluidica prima della semina o tempi di incubazione più lunghi possono essere necessari. È anche fondamentale per assicurarsi che il microscopio è correttamente impostato per ottenere un’immagine messa a fuoco e dovrebbe essere controllato periodicamente in tutto l’esperimento per assicurare che si ottengono immagini di qualità. Se il fuoco è spento, il microscopio può e deve essere regolato come l’esperimento continua. Durante il tempo di acquisizione di immagini, l’ultima lunghezza d’onda deve essere impostata Chiuso tutti al fine di evitare l’esposizione dei filtri e illuminazione a un solo canale durante il tempo di attesa che si verifica tra le acquisizioni di immagine. Inoltre, l’analisi di immagine che determina la % di copertura superficiale è stato progettato in casa perché il manuale del software di montaggio non descrivere in modo esplicito la procedura. Inoltre, al fine di ampliare l’analisi di immagine e determinare altre caratteristiche quali rugosità superficiale, ecc., open source codice basato su Python⁴⁵ è stato sviluppato in casa e condiviso il repository su gitHub. Esistono anche alcune limitazioni su quanti dati possono essere archiviati e gestiti sul disco rigido locale, quindi è necessario un disco rigido esterno o condivisione dati online come CyVerse⁴⁶.

Bioreattori convenzionali, come il reattore di CDC e il gocciolamento flusso reattore³⁴, richiedono molto media, forniscono meno dimensioni del campione e richiedono una quantità elevata di sterilizzazione delle attrezzature. Al contrario, i vantaggi di questa piattaforma di velocità effettiva superiore includono la possibilità di controllo taglio, velocità di flusso, e il presupposto che in vitro gli esperimenti molto attentamente assomigliare condizioni in vivo . Svantaggi del sistema includono i molteplici accessori e software che richiedono una meticolosa di installazione che dovrà essere eseguite nell’ordine corretto di eventi. Inoltre, il manuale che viene fornito per le attrezzature non completamente spiegare ogni passaggio di esperimenti e i comandi del software e, di conseguenza, molti errori si verificano durante gli esperimenti, tra cui ostruzione dei canali, mancanza di crescita o allegato, o la mancanza di alta qualità microscopia immagini o filmati. Lo strumento stesso e materiali di consumo, quali le piastre di microfluidica, inoltre sono relativamente costosi con un prezzo di oltre $200 per piastra e non sono riutilizzabili. Così, mentre la tecnica conferisce risultati potente, la competenza tecnica necessaria per il suo utilizzo è relativamente alta e richiede ripetuti formazione di esperti nel campo. Questa relazione tenta di risolvere questo problema, fornendo una guida per nuovi utenti di questi bioreattori per studiare le caratteristiche di biofilm.

Il sistema di microfluidica, che è in grado di eseguire analisi cellulare, ha guadagnato l’attenzione considerevole per le varie modalità scientifica, come ad esempio in microbiologia, immunologia, ematologia, oncologia e la ricerca sulle cellule staminali. Più specificamente, la tecnologia ha portato a numerose pubblicazioni Descrizione degli argomenti che sono altamente rilevanti per le applicazioni mediche^37,47comprese microbica orale adesione⁴⁸, determinazione degli effetti delle biotensioattivi su Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus^49,50, ospitano interazioni patogeno in⁵¹di Escherichia coli, streptococco di aderenza⁵²e trattamento di fibrosi cistica⁵³. Dato il fatto che questo sistema di microfluidica è molto versatile, si prevede che più sistemi saranno distribuiti in tutto il mondo.

Alcuni passaggi del protocollo specifico dovrebbero essere considerate con attenzione. Media può essere diluito al 50% con dH₂O per aiutare a prevenire bolle e intasamento ma non è stato richiesto in questo caso. Il valore specifico di OD₆₀₀ utilizzato per la semina deve essere determinato con prove di un esperimento di crescita per vedere cosa funziona meglio per il particolare insieme di condizioni utilizzate. Bolle in pozzi prima del sigillamento possono portare a bolle nei canali microfluidici e dovrebbero essere rimosso da spuntato o succhiato fuori con un puntale. È importante mantenere i batteri fuori le piccole scanalature del serpentine. Avendo volumi uguali di media in ingresso e in uscita durante il processo di seeding, flusso dovuto pressione dal volume di liquido sarà controllato quindi flusso è solo a causa della pressione applicata dal sistema. Le distanze di taratura devono essere impostare durante l’installazione dal rappresentante della società. Queste impostazioni sono specifiche per ogni telecamera.

Ci sono diverse sfide che si verificano quando trovare la soglia più rappresentativa per un’immagine. Impostazione dei valori di soglia massima può essere difficile se l’intensità medio dei pixel in tutte le regioni dello sfondo non è coerente causato selezionando una posizione di fase che non è al centro del canale o da detriti sulla piastra. Sotto lo Standard MM, fare clic sul processoe quindi selezionare sfondo e ombreggiatura correzione strumento di correzione per queste contraddizioni. Tuttavia, questo strumento è generalmente utile solo se l’utente ha scattato immagini dei canali prima della semina che possono utilizzare come immagini di riferimento. O, se ombreggiatura di sfondo/riferimento immagini non sono disponibili, l’utente avrà bisogno di usare il loro giudizio per impostare un valore di soglia che copre più area di cella senza includere lo sfondo per l’immagine intera. In alternativa, selezionare aree rappresentative per misurare che escludono le regioni di incoerenza con un click Regione rettangolare, Ellisse areao Regione traccia per selezionare una regione e selezionare Regione attiva piuttosto che intero Immagine sulla finestra Visualizza le statistiche di regione (in Strumenti di analisi). Se una rappresentanza regione è utilizzata per soglia l’immagine di campo luminoso, la stessa regione deve essere utilizzata per la misura dell’immagine corrispondente FITC. È utile registrare le statistiche spaziali specifiche (sinistra, alto, larghezza, altezza, Area, perimetro) associate a quella regione rappresentante così si troverà la stessa regione e misurato sull’immagine corrispondente FITC.

Per evitare un accumulo di dati sul disco rigido che causa il computer a rallentare, un disco rigido esterno può essere acquistato per archiviazione dei dati. Un’altra opzione per l’archiviazione e semplificando la condivisione dei dati è la piattaforma di bioinformatica di CyVerse. Creare un account sul sistema CyVerse andando a http://www.cyverse.org/. Una volta loggato, avviare l’ambiente di Discovery, quindi selezionare “Log in CyVerse”. Selezionare “dati” e passare al sei la cartella. Se lo stack di immagine è sul computer locale quindi selezionare “Upload” e poi “Caricamento semplice dal Desktop“. Individuare il file di immagine dello stack e selezionare per l’upload. Il file o una cartella possa essere condivisi con collaboratori se hanno un account CyVerse e viene concessa l’autorizzazione. Condivisione della cartella dati al pubblico richiede che i metadati aggiunti per ogni file utilizzando CyVerse gli standard approvati. Questa procedura non sarà discusso qui perché questo non è nell’ambito di questo lavoro.

Materials

Ammonium Chloride, ACS	VWR	BDH9208-500G	Part of the minimal media composition
BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate	Fluxion Biosciences	910-0047
BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade	VWR	97061-904	Part of the minimal media composition
Dextrose, Anhydrous, ACS	VWR	BDH9230-500G	Part of the minimal media composition
Magnesium Sulfate ACS Grade	VWR	EM-MX0070-1	Part of the minimal media composition
Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade	VWR	BDH9268-500G	Part of the minimal media composition
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.
Sodium Chloride, ACS	VWR	BDH9286-500G	Part of the minimal media composition
Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade	VWR	97061-942	Part of the minimal media composition