Summary
在这里，我们提出一个协议，收集花香挥发物从盛开的花朵，使用无损采样程序。
Abstract
许多花系的香料已被取样和分析挥发物。了解构成香料的化合物是保护受到威胁或濒危的花卉的重要一步。因为花香对吸引授粉者至关重要，因此这种方法可用于更好地了解甚至增强授粉。我们提出一个协议，使用便携式木炭空气过滤器和真空收集花香挥发物，然后由GC-MS进行分析。通过使用这种方法，可以使用无损方法对香精挥发物进行取样，并采用易于运输的机器。该方法采用快速采样程序，将采样时间从 2-3 小时缩短到大约 10 分钟。使用GC-MS，香水化合物可以根据真实标准单独识别。介绍了用于收集香料和控制数据的步骤，从材料设置到收集数据输出。
Introduction
花通常产生一种香味，用来吸引授粉者。这些香料由许多化合物组成，它们共同作用于花卉混合物1，2，3。没有这些香料，花儿就不太可能使用传粉剂传递遗传信息。花香已记录在许多开花植物家族，与兰花是比较常见的家族研究4。为了理解花香在授粉中的作用，重要的是无损地收集和分析在一天的不同时间以及花期到几周从花中释放的化合物，因为香味会随时间而变化。
希思和马努基6号为这种取样制定了早期方案。他们的取样方法的目的是减少被研究的标本（如植物、昆虫）的压力。早期的文件记载，对植物的破坏性程序是必需的，如去除盛开的花朵，以收集香味。最近由坎西诺和达蒙7，8的花卉香水出版物采用了类似的方法。本研究将花放在玻璃室中，并通过净化空气在玻璃室;然后，从室的香料化合物被吸收到多孔聚合物吸附剂在明确的巴斯德移液器。在这项研究中，这些香水被收集了至少两个小时。萨德勒等人9日在佛罗里达州南部对一种植物兰花进行了花香研究，与最初的研究10很样。再次，这项研究要求花被取样超过两个小时，以收集香味挥发物，与香味收集到多孔聚合物吸附剂。本文提出了一种非破坏性方法，允许更快的采样，持续仅 10 分钟。此外，不使用玻璃室烤箱烘烤袋使用，这使得更灵活的移动室，并减少损坏花的机会。这些袋子有多种尺寸可供选择，可以选择袋的大小，在不影响样品或周围材料的情况下，可轻松安装单个样品。本研究中使用的吸附剂是泰纳克斯多孔聚合物吸附剂。这与 Porapak 不同，因为样品可以热解吸到 GC-MS 柱上进行分析，从而消除了化学溶剂的使用。
本研究中的方法提供了一种快速采样花产生的香精挥发物的方法，并可用于从其他标本（如昆虫信息素或蘑菇挥发物）中取样挥发物。采样时间的缩短意味着样品的压力较小，而且能够在短时间内采集到许多样品。例如，在萨德勒等人9，花只有香在晚上，所以只有两三个样本可以收集每天晚上。通过这种方法，可以整夜从同一朵花上每隔15-20分钟采集样品。此外，通过使用袋子而不是玻璃室，头部空间可以暂停更容易在外地取样，就地收集濒危或受威胁的植物物种。使用这里介绍的方法，我们能够对距地面1.5至2米的花卉进行取样。这些方法对于实验室和现场的香料收集非常有用，并且为研究人员提供了快速且对样品无损的采样技术。
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Protocol
注意：在任何此类过程中，不得佩戴香水或香味乳液和产品。
1. 花卉选择
注：使用的花卉可以在环境中自然生长，也可以保存在人工环境条件下。收集期间的温度、湿度和光照水平可能因所使用的特定花种以及收集的数据类型而异。例如，白天和晚上收集了同一朵花的数据，以确定一天中的香味是否随时间而变化，并从原地和温室花卉中收集。
- 选择最初未开封的花，以标准化样品收集时间。这控制花改变香水随着时间的推移。
- 根据开花时间的持续时间（如果可能，在开花后至少等待 24 小时）收集样品，为所有样品设定标准时间。
- 如果一株植物上有多个盛开的花朵，则标记一种将用于标记胶带或类似的东西，以确保对同一朵花进行重复采样。
2. 材料准备
- 使用烤箱袋（约 40.5 厘米 × 44.5 厘米）和瓦楞 PTFE 管。
- 最初，将烤箱袋在水中煮沸约30分钟，以去除残留的塑料化合物。干燥时，在175°C的烤箱中烘烤。
- 袋子干燥后，在烤箱袋封闭端的每个角落添加聚丙烯隔板联体。这些附件允许连接管将木炭过滤的空气推入并拉出头部空间的香味。
- 用75%乙醇冲洗所有袋子和管子。洗洗后让两种空气干燥。
- 烤箱袋干燥后，在烤箱中以低热烘烤袋和管子，约74-85°C，30分钟。
3. 易失性收集
注：在此过程中需要佩戴无菌氯丁酮手套，因为接触袋子或滤芯可能会污染样品。
- 用烤烤箱袋盖住选定的花。将袋子紧紧地绑在花下，用塑料拉链系住，防止不必要的气流进入袋子。
- 从收集设备的出风口连接一根管子，并将其连接到烤箱袋上的一个隔板接头上。
- 在另一个隔板联合体上，连接一个包含多孔聚合物吸附剂的玻璃滤芯。
- 将第二根管子连接到真空输入上的收集设备。将第二根管的末端连接到玻璃挥发性收集滤芯上。
- 同时打开空气泵和真空，设置为 ±0.05 L/min。花周围的头部空间将充满空气，但不会变得过度膨胀。系统会通过过滤器从袋子中抽出空气，捕获花的挥发物。
- 让机器运转 10 分钟，然后关闭空气泵和真空。
注：产生/散发出少量香料的花卉品种可能需要在较长时间内取样。 - 拆卸管和玻璃滤芯。将过滤器放入带螺钉盖的玻璃瓶中。盖打开后，用 PTFE 管螺纹胶带密封小瓶。
- 将样品存放在冰箱中，直到使用 GC-MS 进行分析。
- 用干净的烤箱袋和玻璃过滤器重复此过程，这次用空烤箱袋，收集一个空白的空气样本作为控制。这允许识别收集的任何背景挥发物。
注意：重复样品收集需要在每天大约同一时间进行，因为有些花在一天中会产生不同的香味水平。
4. GC-MS
- 从冰箱中取出玻璃滤芯，放入喷油器端口中的 GC-MS 中。
- 通过在热收集陷阱 （TCT） 中加热到 220°C，在氦气流中释放从吸附剂中收集的多孔聚合物吸附剂的头部空间挥发物 8 分钟（速率：1.2 mL/min）。
- 在-130°C的TCT冷捕水装置中收集脱吸化合物。冷疏水阀温度由 GC-MS 程序调节。
- 闪热 TCT 冷疏水阀单元，将化合物注入 TCT 冷疏水阀单元所连接的气体色谱仪的毛细管柱中。TCT 的方法从 -20°C 开始，在 150°C 结束。
- 在 15°C/min 下，将 GC-MS 从 40°C 上升到 280°C，在 40°C 下保持 5 分钟。
5. 数据分析
- 为了进行识别，将样品的质谱与质谱库（NIST和化学生态学系，瑞典哥德堡大学11）进行比较，并将挥发物的保留时间与正宗化合物标准12的时间进行比较。
- 比较收集的挥发物的色谱图，以识别常见的复发峰。
- 在识别峰值挥发物后，使用Pherobase（半化学和信息素的在线数据库）来确定它们是否以前在花香10中描述过。
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Representative Results
来自 GC-MS 的代表性数据显示为色谱图，如图1所示。除了色谱图外，还提供结果数据文件（补充文件1）。此数据文件提供每个峰值 （RT） 的保留时间，并标识该峰值的复合值（库/ID）。由于化合物10的分子量，10：00至15：00之间的峰值是花挥发物。峰值上方的数字表示被引用结果数据文件（补充文件1）的已识别化合物的保留时间。通过获取每个香料样品的色谱图和数据文件，可以比较化合物，并识别每个花样重复出现的化合物。可以从本文档的类别"Sample"下标识集合，该类别以表示采样的花以及收藏的时间和日期（例如：UF1 8AM 03/16/15）。本文档的第 1 页还显示了从样本 （LibraryID） 中标识的特定化合物的标识，该化合物从图 1中达到的峰值保留时间（Pk+），以及每种挥发物构成的总香味的百分比（面积百分比）。"库/ID"下列出的所有收集的挥发物都可以在 Pherobase 中引用，以确定它们以前是否在花香中描述过。例如，在补充文件1中，化合物#21，保留时间（RT）为10.311，已被确定为苯甲醛。在未来的样品中，如果存在苯甲醛，可以在Pherobase上引用，以确定它是否可能是花卉的花的化合物。在图2中，苯甲醛在Pherobase上被搜索。一旦选择了化合物，该页面将显示所有花卉品种的列表，按植物家族组织，从中确定了该香料化合物。图2右下角突出显示的是兰花品种（兰花）的一小部分，其中苯醛已被确定为存在于花香中。
图 1：GC-MS 波动峰值结果。图形结果显示花卉香料样品的峰值挥发性。峰值上方的数字对应于所有收集的挥发性化合物的列表，确定峰值到特定挥发性。10：00至15：00之间的高峰最有可能是花香的挥发物。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：Pherobase 示例结果。Pherobase 搜索香料化合物的结果示例。在这个数字中，苯甲醛被搜索，结果显示了从中鉴定出这种香味的所有花种的列表。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件 1：结果数据。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
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Discussion
虽然这种技术对于它的采样速度和可移植性非常有价值，但一个限制是将其用于附生物种，或那些生长在树上而不是从地面的物种。在最初的研究中，一种被取样的花是附生。由于机器太重，不能自由悬挂，因此必须制作一个稳定、高架的底座进行取样。此外，机器可以插入电源插座或电池供电，因此，如果长时间进行现场采样，则在不使用机器时必须有电源为蓄电池充电。
此处的方法允许原位无损采样，具有快速重复采样和更快的采样时间。虽然一些花香研究要求收集一个样品的香料2-3小时，但提出的方法可以准确地收集挥发物在大约10分钟，由于收集材料（多孔聚合物吸附剂）在玻璃中使用滤波器。
这些收集方法提供了一种快速、安全地品尝花产生的香味的方法，而不会破坏或损害花朵。有这么多的花，尤其是那些家庭兰花，被归类为威胁或濒危，分析他们生产无损的香味是至关重要的，因为工作是进行了解他们的授粉生物学。从这些研究获得的信息可能被用来促进授粉使用合成混合物基于峰值化学品发现吸引更多的授粉者与开花兰花的地区。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
美国农业部-ARS研究项目号6036-22000-028-00D。在本出版物中使用贸易、公司或公司名称是为了便于读者使用。此类使用不构成美国农业部或农业研究处对任何产品或服务的正式认可或批准，而不包括其他可能合适的产品或服务。此外，佛罗里达大学生物学系-刘易斯和瓦里娜·沃恩兰花生物学奖学金（2017年）和佛罗里达大学研究生研究奖学金（2014-2018年）也提供了资金。我们也感谢来自斯蒂森大学的辛迪·本宁顿在拍摄这段视频时使用的兰花植物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
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