Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף ניחוח פרחוני אנטימיקרוביאלים מפרחים פורחים, באמצעות הליך דגימה לא הרסני.
Abstract
בריחות של משפחות פרחים רבות שנדגמו והבולנים נותחו. ידיעת תרכובות המרכיבים את הניחוחות יכול להיות צעד חשוב לשימור של פרחים מאוימים או בסכנת הכחדה. כי ניחוח פרחוני הוא קריטי למשיכת המאביקים, שיטה זו יכולה לשמש כדי להבין טוב יותר או אפילו לשפר את האבקה. אנו מציגים פרוטוקול באמצעות מסנן אוויר נייד ואקום לאסוף ניחוח פרחוני volatiles, אשר מנותח לאחר מכן על ידי GC-MS. על-ידי שימוש בשיטה זו, ניתן לדגום את הבושם באמצעות שיטה שאינה הרסנית עם מכונה שהיא מועברת בקלות. מתודולוגיה זו משתמשת הליך דגימה מהירה, חיתוך זמן הדגימה למטה מ 2-3 שעות עד כ 10 דקות. באמצעות GC-MS, תרכובות הניחוח ניתן לזהות בנפרד, מבוסס על סטנדרטים אותנטיים. השלבים המשמשים לאיסוף נתונים ניחוח ושליטה מוצגים, מתוך הגדרת חומרים לאיסוף פלט הנתונים.
Introduction
פרחים בדרך כלל לייצר ניחוח המשמש למשיכת מאביקים. ניחוחות אלה מורכב של תרכובות כימיות רבות מתנהגים יחד כמו תערובת פרחונית1,2,3. ללא ניחוחות אלה, פרחים יהיה פחות סביר להעביר את המידע הגנטי שלהם באמצעות המאביקים. ניחוח פרחוני תועד במשפחות צמחים פורחים רבים, עם ורצ להיות אחת המשפחות הנפוצות יותר למדו4. כדי להבין את התפקיד של ניחוח פרחוני באבקה, חשוב לאסוף ולנתח את תרכובות כימיות הנפלטים מן הפרחים בזמנים שונים של היום, במהלך מספר ימים לשבועות פורח פרחים פתוחים, כמו ניחוח יכול להשתנות לאורך זמן5.
פרוטוקול מוקדם לסוג זה של דגימה פותחה על ידי הית ו מאנוקיאן6. המטרה של שיטות הדגימה שלהם הייתה להפחית את הלחץ על הדגימה (למשל, צמחים, חרקים) שנחקרו. עיתונים קודמים תועדו כי הליכים הרסניים למפעל נדרשו, כגון הסרת פרחים פורחים על מנת לאסוף את הבושם. יותר לאחרונה הפרסומים ניחוח פרחוני על ידי cancino ו דיימון7, 8 השתמשו בשיטות דומות. מחקר זה לשים את הפרחים בתאי זכוכית והעביר אוויר מטוהרים עליהם; אז תרכובות ניחוח מן החדר נספג על adsorbents פולימר נקבובי ברור פיפטות פסטר. הניחוחות נאספו לפחות שעתיים במהלך המחקר הזה. Sadler ואח '9 ביצע מחקרים בניחוח פרחוני על סחלב אפיטי בדרום פלורידה, בדומה למחקר המקורי10. שוב, מחקר זה דרש את הפרחים להיות שנדגמו במשך יותר משעתיים כדי לאסוף את הבושם ניחוח, עם ניחוח שנאסף על adsorbent נקבובי מכופף. הנייר כאן מציג שיטה שאינה הרסנית המאפשרת דגימה מהירה הרבה יותר, הנמשכת רק 10 דקות. כמו כן, במקום להשתמש בתנור חדר זכוכית שקיות אפייה משמשים, אשר מאפשרים תנועה גמישה יותר של החדר ולהפחית את הסיכויים של נזק לפרחים. תיקים אלה מגיעים במספר גדלים המאפשרים אפשרות לבחור את גודל השקית שתתאים בקלות לדגימות בודדות מבלי לפגוע במדגם או בחומר שמסביב. Adsorbent בשימוש במחקר זה היה Tenax נקבובי מפולימר Adsorbent. זה שונה Porapak, בגלל המדגם יכול להיות thersorbed על העמודה GC-MS לניתוח, ביטול השימוש של ממיס כימית.
השיטות במחקר זה לספק דרך במהירות לדגום וולאטילס ניחוח המיוצר על ידי פרחים, ניתן להשתמש כדי לדגום אנטימיקרוביאלים מדגימות אחרות, כמו גם, כמו פרומונים חרקים, או וולאטיקלס פטריות. הזמן המוקצב לדגימה משמעו שיש פחות לחץ על המדגם והיכולת לאסוף דגימות רבות בפרק זמן קצר. לדוגמה, ב-Sadler et al.9, הפרח היה רק ריחני בלילה, כך רק שניים או שלושה דגימות ניתן לאסוף בכל לילה. עם השיטה כאן, ניתן לקחת דגימות כל הלילה במרווחים של 15-20 דקות מאותו פרח. בנוסף, על-ידי שימוש בשקיות במקום בתאי זכוכית, ניתן להשעות את החלל הקדמי בצורה קלה יותר לדיגום בשטח באוסף באתרו בסכנת הכחדה או מאיימת על מינים צמחיים. באמצעות השיטה המוצגת כאן, הצלחנו לדגום פרחים 1.5 עד 2 מטר מעל הקרקע. שיטות אלה שימושיות במידה רבה עבור אוסף הבושם במעבדה ובתחום, ומספקת לחוקרים טכניקת דגימה מהירה ובלתי הרסנית למדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: אין לענוד בשמים או תחליבים ריחניים ומוצרים במהלך כל אחד מההליכים הללו.
1. בחירת פרח
הערה: פרחים בשימוש יכול להיות גדל באופן טבעי בסביבה או נשמר בתנאים סביבתיים מלאכותיים. הטמפרטורה, הלחות ורמת האור במהלך האיסוף עשויות להשתנות בהתאם לסוג הפרח המסוים המשמש, ולאילו סוגי נתונים נאספים. לדוגמה, הנתונים נאספו במהלך היום ובלילה לאותו פרח כדי לקבוע אם הניחוח משתנה לאורך זמן היום, ונאסף משני הפרחים האתרו והחממה.
- בחר בפרח שנפתח בתחילה, כדי לתקנן את זמן איסוף הדגימה. זה שולט לפרח המשתנה ניחוח לאורך זמן.
- בהתאם למשך הזמן הפורח, אם אפשרי, לחכות לפחות 24 שעות לאחר הפריחה כדי לאסוף את המדגם, הגדרת זמן סטנדרטי עבור כל הדגימות.
- אם יש מספר פרחים פורחים על הצמח, לסמן את אחד שישמש עם הסימון קלטת או משהו דומה כדי להבטיח דגימה חוזרת של אותו פרח.
2. הכנת חומר
- השתמש בשקיות התנור (כ-40.5 ס מ × 44.5 ס מ) ובצינורות מצופפי גלי.
- בתחילה, מרתיחים שקיות התנור במים ~ 30 דקות כדי להסיר תרכובות פלסטיק שיורית. לייבוש, אופים בתנור ב 175 ° c.
- לאחר הייבוש השקיות, להוסיף האיחוד המחיצה פוליפרופילן לכל פינה של הקצה הסגור של שקיות התנור. ההחזקות האלה מאפשרות חיבור של צינורות לדחוף פחם מסונן אוויר פנימה ולמשוך את הניחוח מהחלל הקדמי.
- לשטוף את כל התיקים והצינורות עם 75% אתנול. בואו להתייבש באוויר לאחר שטיפה.
- לאחר שקיות התנור התייבשו, אופים שקיות וצינורות בתנור בחום נמוך, כ-74-85 ° c למשך 30 דקות.
3. איסוף נדיפות
הערה: כפפות ניאופרן סטרילי צריך להיות שחוקים לאורך תהליך זה, כאשר הפנייה לשקית או מחסניות מסנן יכול לזהם את הדגימות.
- מכסים את הפרח שנבחר עם שקית תנור אפוי. החזק את השקית יחד עם מיקוד פלסטיק מתחת לפרח כדי למנוע זרימת אוויר לא רצויה לתוך השקית.
- חברו צינור משקע האוורור של ציוד האיסוף וחברו אותו לאחד האיגודים המחיצה על שקית התנור.
- על האיחוד המחיצה האחרת, לצרף מחסנית מסנן זכוכית המכילה היפומים נקבובי הפולימר.
- חבר צינורית שניה לציוד הגבייה בכניסת הוואקום. התחבר לקצה הצינור השני אל מחסנית מסנן האוסף הנדיף של הזכוכית.
- הפעל הן משאבת האוויר ואקום באותו זמן להגדיר ב ~ 0.05 L/min. החלל הקדמי סביב הפרח יתמלא באוויר, אך לא יהיה מנופח מדי. המערכת תמשוך אוויר מן השק דרך המסנן, לוכדת את הוולאטילס פרחוני.
- לאפשר למכונה לרוץ 10 דקות ולאחר מכן לכבות הן משאבת האוויר ואקום.
הערה: מינים של פרחים שמייצרים/פולטים כמות קטנה יותר של ניחוח ייתכן שיהיה צורך לדגום למשך פרק זמן ארוך יותר. - פירוק הצינורות ומחסנית מסנני הזכוכית. מניחים את המסנן לתוך בקבוקון זכוכית עם כובע בורג. כשהמכסה מופעל, אטום את המבחנה. עם סרט הדבקה של הצינור
- החנות דגימות במקפיא עד שנותחו באמצעות GC-MS.
- חזור על תהליך זה עם שקית ומסנן זכוכית נקיים, הפעם עם שקית תנור ריקה, כדי לאסוף דגימת אוויר ריקה כפקד. זה מאפשר כל רקע והכל שנאסף להיות מזוהה.
הערה: האוסף החוזר צריך להיעשות בערך באותו הזמן בכל יום, כמו פרחים מסוימים לייצר רמות ניחוח שונות במהלך היום.
4. GC-MS
- הסר את מחסנית מסנן זכוכית מן המקפיא ומקום לתוך GC-MS בנמל מזרק.
- שחרור ראש שטח וולאטילס שנאסף על מלכודת נקבובי הפולימר מתוך adsorbent על ידי חימום במלכודת אוסף תרמי (TCT) כדי 220 ° צ' עבור 8 דקות בתוך זרימה של גז הליום (קצב: 1.2 mL/min).
- לאסוף תרכובות desorbed ביחידת TCT קר המלכודת ב-130 ° c. הטמפרטורה המלכודת הקרה מוסדר על ידי התוכנית GC-MS.
- פלאש חום היחידה TCT המלכודת הקרה כדי להזריק את התרכובות לתוך העמודה קפילר של גז chromatograph שאליו יחידת TCT קר המלכודת היה מחובר. השיטה עבור TCT מתחילה ב-20 ° c ומסתיימת ב 150 ° c.
- התוכנית GC-MS לעלות מ 40 ° צ' עד 280 ° c ב 15 ° c/min, עם החזקת 5 דקות ב 40 ° c.
5. ניתוח נתונים
- לצורך זיהוי, השווה את הספקטרום ההמוני של המדגם לאלה מספריות ספקטרום מסה (מחלקה לאקולוגיה כימית, אוניברסיטת גוטברג, שבדיה11), כמו גם זמני שמירה של הוולאטילס לתקופות של תקנים אותנטיים מורכבים12.
- השוו כרומאטוגרמות של שנאסף וולאטילס כדי לזהות פסגות משותפות.
- לאחר זיהוי השיא volatiles, השתמש Pherobase (מאגר נתונים מקוון של כימיקלים ופרומונים) כדי לקבוע אם הם כבר תוארו בעבר ניחוחות פרחים10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתוני הנציג מתוך ה-GC-MS מוצגים כרומוטוגרמה באיור 1. בנוסף ל chromatogram, קובץ נתונים של תוצאות מסופק גם (קובץ משלים 1). קובץ נתונים זה מספק את זמן השמירה עבור כל שיא (RT), וזיהוי של התרכובת המהווה שיא (ספריה/מזהה). פסגות בין 10:00 ו 15:00 דקות הם volatiles פרחוני, בשל המשקל המולקולרי של תרכובות10. המספרים שמעל הפסגות מסמלים את זמני ההחזקה של התרכובות המזוהות אשר מוזכרים בקובץ הנתונים של התוצאות (קובץ משלים 1). על ידי קבלת כרומטוגרמה ואת קובץ הנתונים עבור כל מדגם ניחוח, תרכובות ניתן להשוות את אלה מחדש עבור כל דגימת פרח ניתן לזהות. ניתן לזהות אוספים ממסמך זה תחת הקטגוריה "לדוגמה", הקרויה על שם המייצג את הפרח שנדגם, ואת השעה והתאריך של האוסף (לדוגמה: UF1 8AM 03/16/15). עמוד 1 של מסמך זה מציג גם את הזיהוי של תרכובות ספציפיות המזוהות מהדוגמה (מזהה הספרייה), אשר השיא זמן השמירה מתוך איור 1 המתחם מתאים (Pk), ואת אחוז הניחוח הכולל שכל נדיף מורכב (שטח%). כל הוולאטילס שנאסף רשום תחת "ספריה/מזהה" ניתן להפנות ב Pherobase כדי לקבוע אם הם תיארו בעבר בניחוח פרחוני. לדוגמה, בקובץ המשלים 1, #21 מורכב, עם זמן שמירה (RT) של 10.311 זוהה כבנזלדהייד. בדוגמאות עתידיות, אם benzaldehyde נמצא, זה יכול להיות מופנה על Pherobase כדי לקבוע אם זה מתחם פרחוני סביר עבור הפרח. , באיור 2. בנזלדהייד חיפש בפרוסיס לאחר שנבחר תרכובת, העמוד מציג רשימה של כל מיני הפרחים, המאורגנים על-ידי משפחת צמחים, ממנה זוהתה תרכובת הבושם. מודגש בפינה הימנית התחתונה של איור 2 היא תת-קבוצה קטנה של מיני סחלב (ורצ) שממנו benzaldehyde נקבע להיות נוכח ניחוח פרחוני.
איור 1: באמצעות GC-MS תוצאות שיא נדיף. התוצאות הגרפיות מציגות את שיא הוולאטילס של דגימת הניחוח הפרחוני. מספרים מעל הפסגות מתאים לרשימה של כל התרכובות הנדיף שנאספו, זיהוי השיא הנדיף הספציפי. פסגות בין 10:00 ו 15:00 דקות סביר ביותר להיות אנטימיקרוביאלים מניחוח פרחוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות הדוגמה Pherobase. דוגמה לתוצאות מחיפוש Pherobase עבור תרכובת ניחוח. באיור זה בנזלדהייד חיפש, והתוצאות מציגות רשימה של כל סוגי הפרחים שמהם זוהו הבושם הזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: נתוני תוצאות. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שטכניקה זו היא בעלת ערך רב מאוד עבור מהירות הדגימה והניידות שלה, מגבלה אחת משתמשת בו עבור מינים אפיפטיים, או הגדלים על עצים ולא מהקרקע. במחקר המקורי10, אחד הפרחים שנדגמו היה אפיטיק. מכיוון שהמכונה כבדה מכדי להיתלות בחופשיות, יש לעשות בסיס יציב ומוגבה לדגימה. בנוסף, ניתן לחבר את המחשב לשקע חשמל או לסוללה מופעל, כך שאם יש דגימת שדה ממושכת, חייב להיות מקור כוח להטעין את הסוללות כאשר המחשב אינו בשימוש.
השיטות כאן מאפשרות לדגימה בלתי הרסנית באתרו, עם דגימה חוזרת מהירה וזמן דגימה הרבה יותר מהיר. בעוד כמה מחקרים ניחוח פרחוני דורשים את הניחוח להיות נאסף עבור 2-3 שעות עבור מדגם אחד, השיטה המוצגת יכולה במדויק לאסוף את אנטימיקרוביאלים כ 10 דקות בגלל החומר האוסף (נקבובי מכופף פולימר adsorbent) השתמשו בזכוכית סנן.
אלה שיטות איסוף לספק דרך במהירות ובבטחה לדגום את הניחוח המיוצר על ידי פרחים, מבלי להרוס או לפגוע בפרח. עם כל כך הרבה פרחים, במיוחד אלה במשפחה ורצ, להיות מסווגים מאוימים או בסכנת הכחדה, ניתוח הניחוחות שהם מייצרים בצורה לא הרסנית הוא קריטי כמו העבודה מתנהלת להבנת ביולוגיה האבקה שלהם. המידע שנרכש ממחקרים אלה עלול לשמש להגברת האבקה באמצעות תערובות סינתטיות המבוססות על כימיקלים מהשיא שנמצאו כדי למשוך יותר מואביקים לאזורים עם סחלבים פורחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
משרד החקלאות משרד המחקר מספר 6036-22000-028-00D. השימוש בשמות המסחר, המשרד או התאגידים בפרסום זה מיועד למידע ולנוחות של הקורא. שימוש כזה אינו מהווה הסכמה רשמית או אישור של מחלקת החקלאות של ארצות הברית או שירות המחקר החקלאי של כל מוצר או שירות להדרה של אחרים שעשויים להיות מתאימים. בנוסף, מחלקת אוניברסיטת פלורידה ביולוגיה-לואיס ו ורנה ווהן מלגת ביולוגיה של אורכידאה (2017), ומלגת מחקר בוגרת אוניברסיטת פלורידה (2014-2018) סיפקה גם מימון. אנו מודים גם סינדי בנינגטון מאוניברסיטת סטטסון עבור צמח הסחלב בשימוש במהלך הצילומים של וידאו זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
