Summary
Здесь мы представляем протокол для сбора цветочных ароматлетучих из цветущих цветов, используя неразрушающую процедуру отбора проб.
Abstract
Ароматы многих цветочных семейств были отобраны и летучих веществ проанализированы. Зная соединений, которые составляют ароматы может быть важным шагом к сохранению цветов, которые находятся под угрозой или под угрозой исчезновения. Поскольку цветочный аромат имеет решающее значение для привлечения опылителей, этот метод может быть использован, чтобы лучше понять или даже повысить опыление. Мы представляем протокол с использованием портативного угольного воздушного фильтра и вакуума для сбора цветочных ароматных летучих веществ, которые затем анализируются GC-MS. С помощью этого метода, аромат летучих может быть пробы с помощью неразрушающего метода с машиной, которая легко транспортируется. Эта методология использует быструю процедуру отбора проб, сокращая время отбора проб с 2-3 часов до примерно 10 минут. Используя GC-MS, аромат соединения могут быть определены индивидуально, на основе подлинных стандартов. Представлены шаги, используемые для сбора данных об ароматизаторах и контроле, от установки материалов до сбора выходных данных.
Introduction
Цветы обычно производят аромат, используемый для привлечения опылителей. Эти ароматы состоят из многих химических соединений все действуют вместе, как цветочная смесь1,2,3. Без этих ароматов, цветы были бы менее вероятно, чтобы передать их генетической информации с помощью опылителей. Цветочный аромат был задокументирован во многих семьях цветущих растений, с Orchidaceae является одним из наиболее распространенных семей изучал4. Чтобы понять роль цветочного аромата в опыление, важно неразрушающе собирать и анализировать химические соединения, испускаемые из цветов в разное время суток и в течение нескольких дней до недели цветы открыты, так как аромат может меняться с течением времени5.
Ранний протокол для такого рода выборки был разработан Хит и Manukian6. Цель их методов отбора проб заключалась в снижении нагрузки на исследуемый образец (например, растения, насекомые). Ранее документы документально, что разрушительные процедуры для завода были необходимы, такие как удаление цветущих цветов для того, чтобы собрать аромат. Более поздние цветочные аромат публикации Cancino и Дэймон7,8 использовали аналогичные методы. Это исследование положить цветы в стеклянные камеры и прошел очищенный воздух над ними; затем аромат соединений из камеры были поглощены на пористые полимерные адсорбенты в ясных пипетки Пастер. Ароматы были собраны в течение по крайней мере двух часов в течение этого исследования. Sadler et al.9 провели исследования цветочных ароматов эпифитической орхидеи на юге Флориды, так же, как оригинальное исследование10. Опять же, это исследование требует цветы должны быть отобраны в течение двух часов, чтобы собрать аромат летучих веществ, с ароматом собраны на пористой полимерной адсорбент. В статье представлен неразрушающий метод, который позволяет гораздо быстрее выборки, продолжительностью всего 10 минут. Кроме того, вместо использования стеклянной камерой печь выпечки мешки используются, которые позволяют более гибкое движение камеры и уменьшить шансы повреждения цветов. Эти мешки поставляются в нескольких размерах, что позволяет выбрать размер сумки, которая легко подойдет отдельных образцов, не повреждая образец или окружающий материал. Адсорбент, используемый в этом исследовании, был Tenax Porous Polymer Adsorbent. Это отличается от Porapak, потому что образец может быть термически desorbed на GC-MS колонке для анализа, исключая использование химического растворителя.
Методы в этом исследовании обеспечивают способ быстро образец аромат летучих веществ, производимых цветами и может быть использован для образца летучих веществ из других образцов, а также, таких как поромоны насекомых, или грибных летучих веществ. Сокращение времени отбора проб означает меньшую нагрузку на выборку и возможность сбора многих образцов в течение короткого периода времени. Например, в Sadler et al.9цветок был только ароматным ночью, поэтому только два или три образца можно было собирать каждую ночь. С помощью метода здесь, образцы могут быть взяты всю ночь на 15-20-минутные интервалы от того же цветка. Кроме того, с помощью мешков вместо стеклянных камер, headspace может быть приостановлено легче для отбора проб в поле для in situ сбора на находящихся под угрозой исчезновения или находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Используя представленный здесь метод, мы смогли попробовать цветы на 1,5-2 метра над землей. Эти методы невероятно полезны для сбора ароматов в лаборатории и на местах, и предоставляет исследователям метод отбора проб, который является быстрым и неразрушительным для образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Духи или душистые лосьоны и продукты не должны носить во время любой из этих процедур.
1. Выбор цветов
ПРИМЕЧАНИЕ: Цветы, используемые могут быть либо естественно растет в окружающей среде или хранятся в искусственных условиях окружающей среды. Температура, влажность и уровень освещенности во время сбора могут варьироваться в зависимости от конкретных видов цветов, используемых, и какой тип данных собирается. Например, данные были собраны в течение дня и ночью для того же цветка, чтобы определить, если аромат меняется в течение дня, и собраны как на месте и тепличных цветов.
- Выберите цветок, который изначально не открыт, чтобы стандартизировать время сбора образцов. Это контролирует для цветка меняя аромат над временем.
- В зависимости от продолжительности времени цветения, если это возможно, ждать по крайней мере 24 часов после цветения, чтобы собрать образец, установив стандартное время для всех образцов.
- Если Есть несколько цветущих цветов на заводе, отметьте тот, который будет использоваться с лентой пометки или что-то подобное, чтобы обеспечить повторную выборку одного и того же цветка.
2. Подготовка материала
- Используйте мешки для духовки (примерно 40,5 см и 44,5 см) и гофрированные трубки PTFE.
- Первоначально, варить мешки духовки в воде в течение 30 минут, чтобы удалить остаточные пластиковые соединения. Чтобы высохнуть, выпекать в духовке при температуре 175 градусов по Цельсию.
- После того, как мешки высохли, добавить полипропиленовый переборки союза в каждом углу закрытого конца духовки мешки. Эти вложения позволяют соединение труб нажать уголь фильтрованный воздух и вытащить аромат из headspace.
- Промыть все мешки и трубки с 75% этанола. Дайте обоим воздуху высохнуть после промывки.
- После того, как мешки для духовки высохли, выпекайте мешки и трубки в духовке на слабом огне, примерно 74-85 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
3. Неустойчивая коллекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные неопреновые перчатки необходимо носить на протяжении всего этого процесса, так как контактсмешка с мешком или фильтрованными картриджами может загрязнять образцы.
- Обложка выбранного цветка с запеченной духовке мешок. Cinch мешок вместе плотно с пластиковой застежкой-молнией галстук ниже цветок, чтобы предотвратить нежелательный поток воздуха в мешок.
- Прикрепите трубку из воздухопусковой части коллекционного оборудования и подключите ее к одному из переборочных союзов на пакете с печкой.
- На другом союзе переборки, прикрепите стеклянный картридж фильтра содержа пористую адсорбент полимера.
- Прикрепите вторую трубку к коллекционному оборудованию на вакуумном входе. Соедините конец второй трубки на стеклянный картридж фильтра волатильного сбора.
- Включите как воздушный насос, так и вакуум в то же время, установленный на уровне 0,05 л/мин. Головное пространство вокруг цветка будет наполняться воздухом, но не станет завышенным. Система будет тянуть воздух из мешка через фильтр, захватцветочные летучие вещества.
- Разрешить машине работать в течение 10 минут, а затем выключить как воздушный насос и вакуум.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цветочные виды, которые производят / излучают меньшее количество аромата, возможно, потребуется пробы в течение более длительного периода времени. - Разберите трубки и картридж стеклянного фильтра. Поместите фильтр в стеклянный флакон с винтовой крышкой. Как только крышка на, печать флакон с PTFE труба нить ленты.
- Храните образцы в морозильной камере до анализа с помощью GC-MS.
- Повторите этот процесс с чистой духовкой мешок и стеклянный фильтр, на этот раз с пустой мешок духовки, чтобы собрать чистый образец воздуха в качестве контроля. Это позволяет идентифицировать любые собранные фоновые летучие вещества.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторение сбора образцов должно быть сделано примерно в то же время каждый день, так как некоторые цветы производят различные уровни аромата в течение дня.
4. GC-MS
- Удалите картридж стеклянного фильтра из морозильной камеры и поместите в GC-MS в порт инжектора.
- Высвобожчь летучие вещества, собранные на пористом полимерном адсорбенте из адсорбторта путем нагрева в термической коллекторской ловушке (ТСт) до 220 градусов по Цельсию в течение 8 мин в течение потока гелия (скорость: 1,2 мл/мин).
- Сбор desorbed соединений в TCT холодной ловушки единицы при -130 градусов по Цельсию. Температура холодной ловушки регулируется программой GC-MS.
- Вспышка нагревает холодовую ловушку TCT для впрыска соединений в капиллярный столб газового хроматографа, к которому был подключен блок холодной ловушки ТСТ. Метод TCT начинается при -20 градусов по Цельсию и заканчивается при 150 градусах Цельсия.
- Программа GC-MS, чтобы подняться с 40 градусов по Цельсию до 280 градусов по Цельсию при 15 градусах Цельсия/мин, с 5 мин удержания при 40 градусов по Цельсию.
5. Анализ данных
- Для идентификации сравните масс-спектры образца с спектрами из библиотек масс-спектров (NIST и Департамент химической экологии, Университет Готеборга, Швеция11), а также время хранения летучих веществ во времена подлинных стандартов соединения12.
- Сравните хроматограммы собранных летучих веществ для выявления распространенных пиков.
- После определения пиковых летучих веществ, используйте Pherobase (онлайн база данных полухимических и феромонов), чтобы определить, если они были ранее описаны в цветочных ароматов10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные данные GC-MS отображаются как хроматограмма на рисунке 1. В дополнение к хроматограмме, файл данных результатов также предоставляется(Дополнительный файл 1). Этот файл данных предоставляет время хранения для каждого пика (RT), а также определение того, что соединение, что пик (Библиотека / ID). Пики между 10:00 и 15:00 минут цветочные летучие вещества, из-за молекулярного веса соединений10. Цифры над пиками обозначает время хранения идентифицированных соединений, на которые ссылается файл данных результатов(Дополнительный файл 1). Получая хроматограмму и файл данных для каждого образца аромата, соединения можно сравнить и те, которые повторяются для каждого образца цветка могут быть определены. Коллекции могут быть определены из этого документа по категории "Образец", названный для представления цветок выборки, и время и дата сбора (пример: UF1 8AM 03/16/15). Страница 1 этого документа также показывает идентификацию конкретных соединений, определенных из образца (LibraryID), которые пиковое время удержания с рисунка 1 соединение соответствует (Pk) и процент от общего аромата, что каждая летучая включает в себя (Площадь %). Все собранные летучие вещества, перечисленные в "Библиотека / ID" могут быть указаны в Pherobase, чтобы определить, если они ранее описаны в цветочный аромат. Например, в дополнительном файле 1, соединение #21, с временем удержания (RT) 10.311 был определен как бензальное дегид. В будущих образцах, если бензальдегид присутствует, он может быть ссылкой на Pherobase, чтобы определить, если это вероятно цветочное соединение для цветка. На рисунке 2бензальдегид агонствовали на Феробазе. После того, как соединение было выбрано, страница показывает список всех видов цветов, организованных семейства растений, из которых этот аромат соединения была определена. Выделено в правом нижнем углу Рисунок 2 представляет собой небольшой подмножество видов орхидей (Orchidaceae), из которых бензальдегид был определен, чтобы присутствовать в цветочный аромат.
Рисунок 1: GC-MS летучих пиковых результатов. Графические результаты, показывающие пик летучих веществ цветочный образец аромата. Цифры над пиками соответствуют списку всех собранных летучих соединений, определяя пик к конкретной летучих. Пики между 10:00 и 15:00 минут, скорее всего, летучие от цветочного аромата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Результаты примера феробазы. Пример результатов от поиска Pherobase для соединения аромата. На этой цифре был проведен обыск Бензальцегида, и результаты показывают список всех видов цветов, из которых этот аромат был идентифицирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Данные о результатах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя этот метод невероятно ценен для его скорости отбора проб и переносимости, одним из ограничений является использование его для эпифитических видов, или тех, которые растут на деревьях, а не с земли. В первоначально изучении10, один из цветов пробы был эпифитическим. Поскольку машина слишком тяжела, чтобы свободно висеть, необходимо создать стабильную, повышенную базу для отбора проб. Кроме того, машина может быть подключена к электрической розетке или батареи, так что если есть длительный отбор полевых проб, должен быть источник питания для зарядки батарей, когда машина не используется.
Методы здесь позволяют на месте неразрушающего отбора проб, с быстрым повторным отбором проб и гораздо более быстрое время отбора проб. В то время как некоторые цветочные исследования аромат требуют аромат, который будет собран в течение 2-3 часов для одного образца, представленный метод может точно собирать летучие вещества примерно за 10 минут из-за материала коллекции (пористый полимер адсорбент), используемый в стекле Фильтр.
Эти методы сбора обеспечивают способ быстро и безопасно попробовать аромат, производимый цветами, не разрушая и не нанося вреда цветку. Что так много цветов, особенно в семье Orchidaceae, будучи классифицированы как находящихся под угрозой или находящихся под угрозой исчезновения, анализируя ароматы они производят в неразрушающей образом имеет решающее значение, как работа проводится для понимания их опыления биологии. Информация, полученная в ходе этих исследований, потенциально может быть использована для повышения опыления с использованием синтетических смесей на основе пиковых химических веществ, которые привлекают больше опылителей в районы с цветущей орхидеями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Исследовательский проект USDA-ARS No 6036-22000-028-00D. Использование торговых, фирменных или корпоративных имен в данной публикации предназначено для информации и удобства читателя. Такое использование не является официальным одобрением или одобрением министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов или Службой сельскохозяйственных исследований какого-либо продукта или услуги, за исключением других, которые могут быть пригодными. Кроме того, финансирование предоставили департамент биологии Университета Флориды Льюис и Варина Вон в области биологии орхидеи (2017 год), а также стипендию Университета Флориды (2014-2018). Мы также благодарим Синди Беннингтон из Стетсонского университета за растение орхидеи, используемое во время съемок этого видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
