Summary
Ici, nous présentons un protocole pour recueillir les volatiles de parfum floral des fleurs en fleurs, utilisant une procédure d'échantillonnage non destructive.
Abstract
Les parfums de nombreuses familles de fleurs ont été échantillonnés et les substances volatiles analysées. Connaître les composés qui composent les parfums peut être une étape importante pour la conservation des fleurs qui sont menacées ou en voie de disparition. Parce que le parfum floral est essentiel pour attirer les pollinisateurs, cette méthode pourrait être utilisée pour mieux comprendre ou même améliorer la pollinisation. Nous présentons un protocole utilisant un filtre portatif d'air de charbon de bois et le vide pour recueillir les volatiles de parfum floral, qui sont alors analysés par un GC-MS. En utilisant cette méthode, les éléments volatils des parfums peuvent être échantillonnés à l'aide d'une méthode non destructive avec une machine qui est facilement transportée. Cette méthodologie utilise une procédure d'échantillonnage rapide, réduisant le temps d'échantillonnage de 2-3 heures à environ 10 minutes. En utilisant GC-MS, les composés de parfum peuvent être identifiés individuellement, basés sur des normes authentiques. Les étapes utilisées pour la collecte des données de parfum et de contrôle sont présentées, de la configuration du matériel à la collecte de la sortie de données.
Introduction
Les fleurs produisent généralement un parfum utilisé pour attirer les pollinisateurs. Ces parfums sont constitués de nombreux composés chimiques agissant tous ensemble comme un mélange floral1,2,3. Sans ces parfums, les fleurs seraient moins susceptibles de transmettre leurs informations génétiques à l'aide de pollinisateurs. Parfum floral a été documenté dans de nombreuses familles de plantes à fleurs, avec Orchidaceae étant l'une des familles les plus communesétudié4. Pour comprendre le rôle du parfum floral dans la pollinisation, il est important de recueillir et d'analyser non desdestructisés les composés chimiques émis par les fleurs à différents moments de la journée et pendant les quelques jours à semaines les fleurs sont ouvertes, comme le parfum peut varier au fil du temps5.
Un protocole précoce pour ce type d'échantillonnage a été développé par Heath et Manukian6. L'objectif de leurs méthodes d'échantillonnage était de réduire le stress sur le spécimen (p. ex., les plantes, les insectes) étudiés. Des documents antérieurs ont documenté que des procédures destructrices à la plante étaient nécessaires, telles que l'enlèvement des fleurs en fleurs afin de recueillir le parfum. Des publications plus récentes de parfum floral par Cancino et Damon7,8 ont utilisé des méthodes similaires. Cette étude a mis les fleurs dans des chambres en verre et a passé l'air purifié au-dessus d'eux ; puis les composés de parfum de la chambre ont été absorbés sur les adsorbents poreux de polymère dans les pipettes claires de Pasteur. Les parfums ont été recueillis pendant au moins deux heures au cours de cette étude. Sadler et coll.9 ont effectué des études de parfum floral sur une orchidée épiphyte dans le sud de la Floride, un peu comme l'étude originale10. Encore une fois, cette étude a exigé que les fleurs soient échantillonnées pendant plus de deux heures pour recueillir les volatiles de parfum, avec le parfum recueilli sur l'adsorbent poreux de polymère. L'article présente ici une méthode non destructive qui permet un échantillonnage beaucoup plus rapide, d'une durée de seulement 10 minutes. En outre, au lieu d'utiliser un four à four en verre sont utilisés, ce qui permet un mouvement plus flexible de la chambre et de réduire les risques d'dommages aux fleurs. Ces sacs sont disponibles en plusieurs tailles permettant la possibilité de sélectionner la taille du sac qui s'adaptera facilement à des échantillons individuels sans endommager l'échantillon ou le matériau environnant. L'adsorbent utilisé dans cette étude était Tenax Porous Polymer Adsorbent. Cela diffère de Porapak, parce que l'échantillon peut être thermiquement desorbed sur la colonne GC-MS pour analyse, éliminant l'utilisation d'un solvant chimique.
Les méthodes de cette étude fournissent un moyen d'échantillonner rapidement les substances volatiles des parfums produites par les fleurs et pourraient être utilisées pour échantillonner des substances volatiles provenant d'autres spécimens, comme les phéromones d'insectes ou les champignons volatils. Le temps réduit pour l'échantillonnage signifie qu'il y a moins de stress sur l'échantillon et la capacité de recueillir de nombreux échantillons dans un court laps de temps. Par exemple, dans Sadler et coll.9, la fleur n'était parfumée que la nuit, de sorte que seulement deux ou trois échantillons pouvaient être prélevés chaque nuit. Avec la méthode ici, des échantillons pourraient être prélevés toute la nuit à des intervalles de 15-20 minutes à partir de la même fleur. En outre, en utilisant des sacs au lieu de chambres en verre, l'espace de tête peut être suspendu plus facilement pour l'échantillonnage dans le domaine pour la collecte in situ sur les espèces végétales menacées ou menacées. En utilisant la méthode présentée ici, nous avons pu échantillonner des fleurs de 1,5 à 2 mètres au-dessus du sol. Ces méthodes sont incroyablement utiles pour la collecte de parfums en laboratoire et sur le terrain, et fournit aux chercheurs une technique d'échantillonnage qui est rapide et non destructrice pour l'échantillon.
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Protocol
REMARQUE : Les parfums ou les lotions et produits parfumés ne doivent pas être portés au cours de l'une ou l'autre de ces procédures.
1. Sélection de fleurs
REMARQUE : Les fleurs utilisées peuvent pousser naturellement dans l'environnement ou être conservées dans des conditions environnementales artificielles. La température, l'humidité et le niveau de lumière pendant la collecte peuvent varier en fonction des espèces de fleurs utilisées et du type de données recueillies. Par exemple, des données ont été recueillies pendant la journée et la nuit pour la même fleur afin de déterminer si le parfum varie au cours de la journée, et recueillies à partir de fleurs in situ et de serre.
- Sélectionnez une fleur qui n'est pas ouverte au départ, pour normaliser le temps de collecte de l'échantillon. Cela contrôle un parfum de changement de fleur au fil du temps.
- Selon la durée de la floraison, si possible, attendez au moins 24 heures après la floraison pour prélever l'échantillon, ce qui établit une heure standard pour tous les échantillons.
- S'il y a plusieurs fleurs en fleurs sur une plante, marquez celle qui sera utilisée avec du ruban adhésif ou quelque chose de semblable pour assurer l'échantillonnage répété de la même fleur.
2. Préparation des matériaux
- Utilisez des sacs de four (environ 40,5 cm et 44,5 cm) et des tubes PTFE ondulés.
- Dans un premier temps, faire bouillir les sacs de four dans l'eau pendant 30 min pour éliminer les composés plastiques résiduels. Pour sécher, cuire au four à 175 oC.
- Une fois les sacs séchés, ajouter une cloison en polypropylène à chaque coin de l'extrémité fermée des sacs de four. Ces pièces jointes permettent la connexion des tubes pour pousser l'air filtré au charbon de bois dans et tirer le parfum hors de l'espace de tête.
- Rincer tous les sacs et tubes avec 75% d'éthanol. Laisser sécher à l'air après le rinçant.
- Après que les sacs de four aient séché, cuire les sacs et les tubes dans un four à feu doux, environ 74-85 oC pendant 30 min.
3. Collection volatile
REMARQUE : Des gants en néoprène stérile doivent être portés tout au long de ce processus, car le contact avec le sac ou les cartouches de filtre peut contaminer les échantillons.
- Couvrir la fleur sélectionnée d'un sac de four cuit au four. Enfoncez le sac étroitement avec une cravate zippée en plastique sous la fleur pour empêcher l'écoulement d'air indésirable dans le sac.
- Fixez un tube de la sortie d'air de l'équipement de collecte et connectez-le à l'un des syndicats de cloisons sur le sac de four.
- Sur l'autre union de cloison, attachez une cartouche de filtre en verre contenant adsorbent de polymère poreux.
- Fixez un deuxième tube à l'équipement de collecte sur l'entrée sous vide. Connectez l'extrémité du deuxième tube sur la cartouche de filtre de collecte volatile en verre.
- Allumez à la fois la pompe à air et le vide en même temps réglé à 0,05 L/min. L'espace de tête autour de la fleur se remplira d'air, mais ne deviendra pas surgonflé. Le système tirera l'air du sac à travers le filtre, piégeant les volatiles floraux.
- Laisser la machine fonctionner pendant 10 min, puis éteindre à la fois la pompe à air et le vide.
REMARQUE : Les espèces de fleurs qui produisent ou émettent une plus petite quantité de parfum peuvent avoir besoin d'être échantillonnées pendant une plus longue période de temps. - Démonter les tubes et la cartouche de filtre en verre. Placer le filtre dans une fiole de verre avec un bouchon vissé. Une fois le bouchon allumé, sceller le flacon avec du ruban adhésif PTFE.
- Conserver les échantillons dans un congélateur jusqu'à ce qu'ils soient analysés à l'aide du GC-MS.
- Répétez ce processus avec un sac de four propre et un filtre en verre, cette fois avec un sac de four vide, pour recueillir un échantillon d'air vide comme un contrôle. Cela permet d'identifier tous les composants volatils de fond collectés.
REMARQUE : La collecte répétée d'échantillons doit être effectuée à peu près à la même heure chaque jour, car certaines fleurs produisent des niveaux de parfum variables au cours d'une journée.
4. GC-MS
- Retirez la cartouche de filtre en verre du congélateur et placez-la dans un GC-MS dans le port de l'injecteur.
- Libérer les éléments volatils de l'espace de tête recueillis sur des adsorbents de polymère poreux de l'adsorbent par chauffage dans le piège de collecte thermique (TCT) à 220 oC pendant 8 min dans un flux de gaz d'hélium (taux : 1,2 ml/min).
- Recueillir les composés desorbed dans l'unité de trappe à froid tcT à -130 oC. La température du piège à froid est réglementée par le programme GC-MS.
- Chauffer à l'éclair l'unité de trappe à froid TCT pour injecter les composés dans la colonne capillaire du chromatographe à gaz auquel l'unité de piège à froid TCT était reliée. La méthode du TCT commence à -20 oC et se termine à 150 oC.
- Programmez le GC-MS pour passer de 40 à 280 oC à 15 oC/min, avec une cale de 5 min à 40 oC.
5. Analyse des données
- Pour l'identification, comparez les spectres de masse de l'échantillon à ceux des bibliothèques de spectres de masse (NIST et Département d'écologie chimique, Université de Goteborg, Suède11), ainsi que les temps de rétention des volatiles aux périodes des normes composées authentiques12.
- Comparez les chromatogrammes des substances volatiles recueillies pour identifier les pics récurrents courants.
- Après avoir identifié les volatiles de pointe, utilisez Pherobase (base de données en ligne des produits sémiochimiques et des phéromones) pour déterminer si elles ont été précédemment décrites dans les parfums floraux10.
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Representative Results
Les données représentatives du GC-MS sont présentées sous la forme d'un chromatogramme à la figure 1. En plus du chromatogramme, un fichier de données des résultats est également fourni (Fichier supplémentaire 1). Ce fichier de données fournit le temps de rétention pour chaque pic (RT), et une identification de ce composé que le pic est (Bibliothèque / ID). Les pics entre 10:00 et 15:00 minutes sont volatiles floraux, en raison du poids moléculaire des composés10. Les nombres au-dessus des pics signifient les temps de rétention des composés identifiés qui sont référencés au fichier de données des résultats (Fichier supplémentaire 1). En obtenant le chromatogramme et le fichier de données pour chaque échantillon de parfum, les composés peuvent être comparés et ceux qui se reproduisent pour chaque échantillon de fleur peuvent être identifiés. Les collections peuvent être identifiées à partir de ce document dans la catégorie "Échantillon", nommé pour représenter la fleur échantillonnée, et l'heure et la date de la collection (exemple: UF1 8AM 03/16/15). La page 1 de ce document montre également l'identification de composés spécifiques identifiés à partir de l'échantillon (LibraryID), dont le temps de rétention maximal à partir de la figure 1 correspond à (PkMD), et le pourcentage du parfum total que chaque substance volatile comprend (zone ). Toutes les substances volatiles collectées énumérées sous la « Bibliothèque/ID » peuvent être référencées dans Pherobase pour déterminer si elles ont déjà été décrites dans un parfum floral. Par exemple, dans le fichier supplémentaire 1, composé #21, avec un temps de rétention (RT) de 10.311 a été identifié comme benzaldéhyde. Dans les échantillons futurs, si le benzaldéhyde est présent, il peut être référencé sur Pherobase pour déterminer s'il s'agit d'un composé floral probable pour la fleur. Dans la figure 2, le benzaldéhyde a été fouillé sur Pherobase. Une fois qu'un composé a été sélectionné, la page montre une liste de toutes les espèces de fleurs, organisées par la famille des plantes, à partir de laquelle ce composé de parfum a été identifié. Dans le coin inférieur droit de la figure 2 se trouve un petit sous-ensemble de l'espèce d'orchidée (Orchidaceae) à partir de laquelle le benzaldéhyde a été déterminé pour être présent dans le parfum floral.
Figure 1 : Résultats de pointe volatils du GC-MS. Résultats graphiques montrant les pics volatils de l'échantillon de parfums floraux. Les nombres au-dessus des pics correspondent à une liste de tous les composés volatils collectés, identifiant le pic à la volatile spécifique. Les pics entre 10:00 et 15:00 minutes sont les plus susceptibles d'être volatiles d'un parfum floral. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résultats de l'exemple Pherobase. Un exemple de résultats d'une recherche Pherobase pour un composé de parfum. Dans cette figure, le benzaldéhyde a été recherché, et les résultats montrent une liste de toutes les espèces de fleurs à partir de laquelle ce parfum a été identifié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dossier supplémentaire 1 : Données sur les résultats. S'il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).
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Discussion
Bien que cette technique soit incroyablement précieuse pour sa vitesse d'échantillonnage et sa portabilité, l'une des limites est de l'utiliser pour les espèces épiphytes, ou celles qui poussent sur les arbres et non pas à partir du sol. Dans l'étude originale10, l'une des fleurs échantillonnées était épiphytique. Parce que la machine est trop lourde pour être suspendue librement, une base stable et élevée doit être faite pour l'échantillonnage. En outre, la machine peut être branchée à une prise électrique ou à une batterie alimentée, donc s'il y a un échantillonnage prolongé sur le terrain, il doit y avoir une source d'énergie pour charger les batteries lorsque la machine n'est pas utilisée.
Les méthodes ici permettent un échantillonnage in situ non destructif, avec un échantillonnage répété rapide et un temps d'échantillonnage beaucoup plus rapide. Alors que certaines études de parfum floral exigent que le parfum soit recueilli pendant 2-3 heures pour un échantillon, la méthode présentée peut recueillir avec précision les volatiles dans environ 10 min en raison du matériel de collecte (adsorbent polymère poreux) utilisé dans le verre Filtre.
Ces méthodes de collecte permettent d'échantillonner rapidement et en toute sécurité le parfum produit par les fleurs, sans détruire ni nuire à la fleur. Avec tant de fleurs, en particulier ceux de la famille Orchidaceae, étant classés comme menacés ou en voie de disparition, l'analyse des parfums qu'ils produisent d'une manière non destructive est essentielle que le travail est effectué pour comprendre leur biologie de pollinisation. L'information obtenue à partir de ces études pourrait potentiellement être utilisée pour stimuler la pollinisation à l'aide de mélanges synthétiques à base de produits chimiques de pointe trouvés pour attirer plus de pollinisateurs dans les zones avec des orchidées en fleurs.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
UsDA-ARS Research Project number 6036-22000-028-00D. L'utilisation des noms de commerce, d'entreprise ou de société dans cette publication est pour l'information et la commodité du lecteur. Une telle utilisation ne constitue pas une approbation ou une approbation officielle par le Département de l'agriculture des États-Unis ou le Service de recherche agricole d'un produit ou d'un service à l'exclusion d'autres personnes qui pourraient convenir. De plus, le département de biologie-Lewis de l'Université de Floride et la bourse Varina Vaughn en biologie des orchidées (2017) et une bourse de recherche supérieure de l'Université de Floride (2014-2018) ont également fourni des fonds. Nous remercions également Cindy Bennington de l'Université Stetson pour la plante d'orchidée utilisée pendant le tournage de cette vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
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