Summary
여기서, 우리는 비파괴 샘플링 절차를 사용하여 꽃꽃에서 꽃 향기 휘발성을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
많은 꽃 가문의 향기가 샘플링되고 휘발성 물질분석되었습니다. 향기를 구성하는 화합물을 아는 것은 위협적이거나 멸종 위기에 처한 꽃을 보존하는 중요한 단계가 될 수 있습니다. 꽃 향기는 꽃가루를 유치하는 데 매우 중요하기 때문에이 방법은 수분을 더 잘 이해하거나 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 휴대용 숯 공기 필터와 진공을 사용하여 꽃 향기 휘발성을 수집하는 프로토콜을 제시한 다음 GC-MS에 의해 분석됩니다. 이 방법을 사용하면 쉽게 운반할 수 있는 기계를 사용하여 무파괴 방법을 사용하여 향수 휘발성을 샘플링할 수 있습니다. 이 방법론은 빠른 샘플링 절차를 사용하여 샘플링 시간을 2-3시간에서 약 10분으로 단축합니다. GC-MS를 사용하여, 향수 화합물은 본격적인 기준에 따라 개별적으로 식별 될 수있다. 재료 설정에서 데이터 출력 수집에 이르기까지 향기 및 제어 데이터를 수집하는 데 사용되는 단계가 표시됩니다.
Introduction
꽃은 일반적으로 수분 공급자를 유치하는 데 사용되는 향기를 생산하고 있습니다. 이 향기는 모두 꽃 혼합1,2,3로함께 작용하는 많은 화학 화합물로 구성되어 있습니다. 이러한 향기가 없다면 꽃은 꽃가루를 사용하여 유전 정보를 전달할 가능성이 적습니다. 꽃 향기는 많은 꽃 식물 가족에 문서화되어 있으며, 오키다과는 4연구 된 일반적인 가족 중 하나입니다. 수분에서 꽃 향기의 역할을 이해하려면, 비파괴적으로 수집하고 하루 중 다른 시간에 꽃에서 방출되는 화학 화합물을 분석하는 것이 중요하다 몇 일에서 몇 주 동안 꽃이 열려, 향기는 시간이 지남에 따라 다를 수 있기 때문에5.
이러한 종류의 샘플링에 대한 초기 프로토콜은 히스와 마누키안6에의해 개발되었습니다. 그들의 샘플링 방법의 목표는 연구되는 표본 (예를 들어, 식물, 곤충)에 대한 스트레스를 줄이는 것이었습니다. 이전 논문은 향기를 수집하기 위해 꽃꽃을 제거하는 등 식물에 파괴적인 절차가 필요하다고 문서화했다. 최근 칸치노와 데이먼7,8에 의해 꽃 향기 간행물은 유사한 방법을 사용했다. 이 연구는 유리 챔버에 꽃을 넣고 그 위에 정화 된 공기를 전달; 이어서 챔버로부터의 향료 화합물을 투명한 파스퇴르 피펫에서 다공성 폴리머 흡착제 에 흡수되었다. 향료는 본 연구 기간 동안 적어도 2시간 동안 수집되었다. Sadler et al.9는 원래 연구10과마찬가지로 플로리다 남부의 에피피틱 난초에 대한 꽃 향기 연구를 수행했습니다. 다시, 이 연구는 다공성 폴리머 흡착제에 수집 된 향기와 함께, 향기 휘발성을 수집하기 위해 2 시간 이상 꽃을 샘플링할 것을 요구했다. 이 백서는 훨씬 더 빠른 샘플링을 허용하는 비파괴 방법을 제시하며 10분 만 지속됩니다. 또한, 대신 유리 챔버 오븐 베이킹 백을 사용하는 챔버의 보다 유연한 움직임을 허용하고 꽃에 손상의 가능성을 줄일 수 있습니다 사용된다. 이 가방은 여러 가지 크기로 제공되므로 샘플이나 주변 재료를 손상시키지 않고 개별 샘플에 쉽게 맞을 수있는 가방 크기를 선택할 수 있습니다. 본 연구에 사용된 흡착제는 테낙스 다공성 폴리머 흡착제였다. 이는 샘플을 분석을 위해 GC-MS 컬럼에 열적으로 탈착할 수 있기 때문에 Porapak과 다르므로 화학 용매의 사용을 제거합니다.
이 연구의 방법은 꽃에 의해 생성된 향수 휘발성을 신속하게 샘플링하는 방법을 제공하며 곤충 페로몬 또는 버섯 휘발성 물질과 같은 다른 표본의 휘발성 물질도 샘플링하는 데 사용될 수 있습니다. 샘플링 시간이 단축되면 샘플에 대한 스트레스가 줄어들고 단기간에 많은 샘플을 수집할 수 있습니다. 예를 들어, Sadler et al.9에서는밤에만 꽃이 향기가 나기 때문에 매일 밤 2~3개의 샘플만 수집할 수 있었습니다. 이 방법을 사용하면 같은 꽃에서 15-20 분 간격으로 밤새 샘플을 채취할 수 있습니다. 또한 유리 챔버 대신 가방을 사용하여 위험에 처한 식물 종에 대한 현장 수집을 위해 현장에서 샘플링하기 위해 헤드 스페이스를 쉽게 일시 중단 할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법을 사용하여 지상 1.5~2m높이의 꽃을 시음할 수 있었습니다. 이러한 방법은 실험실과 현장에서 향수 수집에 매우 유용하며, 연구원들에게 샘플에 빠르고 비파괴적인 샘플링 기술을 제공합니다.
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Protocol
참고: 향수 나 향이 나는 로션 및 제품은 이러한 절차 중 착용해서는 안됩니다.
1. 꽃 선택
참고: 사용되는 꽃은 자연적으로 환경에서 자라거나 인공 환경 조건하에서 보관될 수 있습니다. 수집 중 온도, 습도 및 조명 수준은 사용되는 특정 꽃 종과 수집되는 데이터의 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 같은 꽃에 대해 낮과 밤에 데이터를 수집하여 향기가 하루 중 시간에 따라 달라지는지 확인하고, 현장에서 온실 꽃에서 수집되었습니다.
- 처음에 개봉되지 않은 꽃을 선택하여 샘플 수집 시간을 표준화합니다. 이것은 시간이 지남에 따라 향기를 변화하는 꽃에 대한 제어합니다.
- 개화 시간의 지속 시간에 따라 가능하면, 모든 샘플에 대한 표준 시간을 설정, 샘플을 수집하기 위해 개화 후 적어도 24 시간을 기다립니다.
- 식물에 여러 개의 꽃이 피는 경우, 같은 꽃의 반복 샘플링을 보장하기 위해 플래그 테이프 또는 유사한 것과 함께 사용되는 꽃을 표시합니다.
2. 재료 준비
- 오븐 백 (약 40.5 cm × 44.5 cm)과 골판지 PTFE 튜브를 사용합니다.
- 처음에는 오븐 백을 물에 30분 동안 끓여 잔류 플라스틱 화합물을 제거합니다. 말리려면 175 °C의 오븐에서 굽습니다.
- 가방이 건조되면 오븐 봉투의 닫힌 끝 모서리에 폴리 프로필렌 격벽 유니온을 추가합니다. 이러한 부착물은 튜브를 연결하여 숯으로 여과된 공기를 밀어 내고 헤드스페이스에서 향기를 끌어낼 수 있게 합니다.
- 75% 에탄올로 모든 가방과 튜브를 헹구십시오. 헹구고 나서 두 공기를 모두 말리십시오.
- 오븐 백을 건조 한 후, 낮은 열에서 오븐에 가방과 튜브를 구워, 약 74-85 °C 에 대 한 30 분.
3. 휘발성 수집
참고: 가방이나 필터 카트리지에 접촉하면 시료가 오염될 수 있기 때문에 멸균 네오프렌 장갑은 이 과정 전반에 걸쳐 착용해야 합니다.
- 구운 오븐 가방으로 선택한 꽃을 덮습니다. 꽃 아래에 플라스틱 지퍼 넥타이로 가방을 단단히 끼워 가방에 원치 않는 공기가 유입되는 것을 방지합니다.
- 수집 장비의 공기 출구에서 튜브를 부착하고 오븐 가방에 격벽 유니온 중 하나에 연결합니다.
- 다른 격벽 결합체에 다공성 폴리머 흡착제가 포함된 유리 필터 카트리지를 부착합니다.
- 진공 입력의 수집 장비에 두 번째 튜브를 부착합니다. 두 번째 튜브의 끝을 유리 휘발성 수집 필터 카트리지에 연결합니다.
- ~0.05 L/min으로 설정된 에어 펌프와 진공을 동시에 켭니다. 꽃 주위의 헤드 스페이스는 공기로 채워지지만 과도하게 팽창되지는 않습니다. 시스템은 필터를 통해 가방에서 공기를 끌어, 꽃 휘발성 을 트래핑합니다.
- 기기가 10분 동안 실행되도록 한 다음 에어 펌프와 진공 을 모두 끕니다.
참고: 더 적은 양의 향을 생산/방출하는 꽃 종은 더 오랜 기간 동안 샘플링해야 할 수도 있습니다. - 튜브와 유리 필터 카트리지를 분해합니다. 필터를 나사식 캡이 있는 유리 병에 넣습니다. 캡이 켜지면 PTFE 파이프 스레드 테이프로 바이알을 밀봉합니다.
- GC-MS를 사용하여 분석할 때까지 샘플을 냉동실에 보관합니다.
- 깨끗한 오븐 가방과 유리 필터로이 과정을 반복, 빈 오븐 가방이 시간, 제어로 빈 공기 샘플을 수집합니다. 이렇게 하면 수집된 모든 배경 휘발성을 식별할 수 있습니다.
참고: 일부 꽃은 하루 동안 다양한 향기 수준을 생성하기 때문에 샘플 수집을 반복하는 것은 매일 거의 같은 시간에 수행되어야합니다.
4. GC-MS
- 냉동고에서 유리 필터 카트리지를 분리하고 인젝터 포트의 GC-MS에 넣습니다.
- 열 수집 트랩(TCT)에서 가열하여 흡착제에서 흡착제상에 수집된 헤드스페이스 휘발성 물질은 헬륨 가스의 흐름 내에서 8분 동안 220°C(속도: 1.2 mL/min)로 방출한다.
- -130 °C에서 TCT 콜드 트랩 유닛에서 탈착 화합물을 수집합니다. 콜드 트랩 온도는 GC-MS 프로그램에 의해 조절됩니다.
- 플래시는 TCT 콜드 트랩 유닛이 연결된 가스 크로마토그래프의 모세관 기둥에 화합물을 주입하기 위해 TCT 콜드 트랩 유닛을 가열합니다. TCT에 대한 방법은 -20 °C에서 시작하여 150 °C에서 끝납니다.
- GC-MS를 15°C/min에서 40°C에서 280°C로 상승하도록 프로그래밍하고 40°C에서 5분 간 유지합니다.
5. 데이터 분석
- 식별을 위해, 질량 스펙트럼 라이브러리 (NIST 및 화학 생태학과, 고테보그 대학, 스웨덴11)에서그와 샘플의 질량 스펙트럼뿐만 아니라 본격적인 화합물 표준의 시간에 휘발성 물질의 보존 시간을 비교12.
- 수집된 휘발성 물의 크로마토그램을 비교하여 일반적인 재발 피크를 식별합니다.
- 피크 휘발성 물질을 식별 한 후, 그들은 이전에 꽃 향기10에설명 된 경우 를 결정하기 위해 Pherobase (반화학 및 페로몬의 온라인 데이터베이스)를 사용합니다.
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Representative Results
GC-MS의 대표적인 데이터는 도 1에서크로마토그램으로 나타내고 있다. 크로마토그램 외에도 결과의 데이터 파일도 제공됩니다(보충파일 1). 이 데이터 파일은 각 피크(RT)에 대한 보존 시간을 제공하고 해당 피크가 어떤 화합물인지 식별합니다(라이브러리/ID). 10:00에서 15:00 분 사이의 피크는화합물10의분자량으로 인해 꽃 휘발성이다. 피크 위의 숫자는 결과의 데이터 파일을 참조하는 식별 된 화합물의 보존 시간을 의미합니다(보충 파일 1). 각 향기 샘플에 대한 크로마토그램 및 데이터 파일을 획득함으로써, 화합물을 비교할 수 있고 각 꽃 샘플에 대해 재발하는 화합물을 식별할 수 있습니다. 컬렉션은 샘플링된 꽃을 나타내는 이름인 "샘플" 범주, 컬렉션의 시간 및 날짜(예: UF1 8AM 03/16/15)에서 이 문서에서 식별할 수 있습니다. 본 문서의 1페이지는 또한 샘플로부터 확인된 특정 화합물의 식별을 도시한다(LibraryID), 이는 도 1로부터의 피크 보존 시간이 화합물(Pk#)에 해당하며, 각 휘발성이 포함하는 총 향료의 백분율(Area %)에 해당한다. "라이브러리/ID"에 나열된 모든 수집된 휘발성 물질은 Pherobase에서 참조하여 이전에 꽃 향기에 설명된 것인지 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 보충 파일 1에서,화합물 #21, 10.311의 체류 시간(RT)을 가진 벤잘데히드로 확인되었다. 미래의 샘플에서, 벤잘데히드가 존재하는 경우, 그것은 꽃에 대한 가능성이 꽃 화합물인지 확인하기 위해 Pherobase에 참조 할 수 있습니다. 도 2에서,벤잘데히드는 페로베이스에서 검색하였다. 화합물이 선택되면, 페이지는 식물 가족에 의해 조직 된 모든 꽃 종의 목록을 보여줍니다, 그 향기 화합물이 확인된. 도 2의 오른쪽 하단에 강조된 것은 벤잘데히드가 꽃향기에 존재하는 것으로 결정된 오키다과(Orchidaceae)의 작은 서브세트이다.
그림 1: GC-MS 휘발성 피크 결과. 꽃 향기 샘플의 피크 휘발성을 보여주는 그래픽 결과. 피크 위의 숫자는 수집된 모든 휘발성 화합물의 리스트에 해당하며, 피크를 특정 휘발성 으로 식별합니다. 10:00에서 15:00 분 사이의 피크는 꽃 향기로 인해 휘발성이 있을 가능성이 높습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 페로베이스 예제 결과. 향기 화합물에 대 한 Pherobase 검색에서 결과의 예. 이 그림에서 벤잘데히드가 검색되었고, 결과는이 향기가 확인된 모든 꽃 종의 목록을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 결과 데이터. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
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Discussion
이 기술은 샘플링 속도와 휴대성에 매우 유용하지만, 한 가지 제한은 epiphytic 종, 또는 나무에서 자라는 것을 위해 그것을 사용하는 것이지 땅에서 자라지 않습니다. 본래 의10에서,샘플링된 꽃 중 하나는 골상이었다. 기계가 너무 무거워서 자유롭게 걸 수 없기 때문에 샘플링을 위해 안정적이고 높은 베이스를 만들어야 합니다. 또한 기기를 전기 콘센트또는 배터리 전원에 연결할 수 있으므로 필드 샘플링이 길어지면 기기를 사용하지 않을 때 배터리를 충전할 전원이 있어야 합니다.
여기서 의 방법을 사용하면 빠른 반복 샘플링과 훨씬 더 빠른 샘플링 시간으로 내부 비파괴 샘플링을 할 수 있습니다. 일부 꽃 향기 연구는 한 샘플에 대해 2-3 시간 동안 수집되는 향기를 필요로하지만, 제시 된 방법은 유리에 사용되는 수집 물질 (다공성 폴리머 흡착제)으로 인해 약 10 분 에서 휘발성 물질을 정확하게 수집 할 수 있습니다. 필터.
이러한 수집 방법은 꽃을 파괴하거나 손상시키지 않고 꽃에 의해 생성 된 향기를 빠르고 안전하게 샘플링 할 수있는 방법을 제공합니다. 많은 꽃, 특히 가족 의꽃, 위협 또는 멸종 위기로 분류되는, 그들은 비 파괴적인 방식으로 생산하는 향기를 분석하는 것은 그들의 수분 생물학을 이해하기 위해 작업이 수행으로 중요하다. 이러한 연구에서 얻은 정보는 잠재적으로 피는 난초와 지역에 더 많은 수분을 유치 하는 것으로 나타났습니다 피크 화학 물질에 따라 합성 혼합을 사용 하 여 수 분을 향상 하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
USDA-ARS 연구 프로젝트 번호 6036-22000-028-00D. 이 출판물에서 거래, 회사 또는 법인 이름을 사용하는 것은 독자의 정보와 편의를 위한 것입니다. 이러한 사용은 미국 농무부 또는 농업 연구 서비스에서 적합할 수 있는 다른 제품 또는 서비스를 배제하는 공식적인 승인 또는 승인을 구성하지 않습니다. 또한, 플로리다 생물학 부 루이스와 발리나 본 교제의 대학 난초 생물학 (2017), 플로리다 대학 대학원 연구 펠로우십 (2014-2018) 뿐만 아니라 자금을 제공. 우리는 또한이 비디오의 촬영 중에 사용되는 오키드 식물에 대한 Stetson 대학에서 신디 베닝턴 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
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