Summary
Her præsenterer vi en protokol for indsamling af blomsterduft flygtige fra blomstrende blomster, ved hjælp af en ikke-destruktiv prøveudtagning procedure.
Abstract
Duftstoffer af mange blomster familier er blevet udtaget og flygtige analyseret. At kende de forbindelser, der udgør duftstoffer kan være et vigtigt skridt til bevaring af blomster, der er truet eller truet. Fordi blomstret duft er afgørende for at tiltrække bestøvere, denne metode kan bruges til bedre at forstå eller endda forbedre bestøvning. Vi præsenterer en protokol ved hjælp af en bærbar kulluft filter og vakuum til at indsamle blomsterduft flygtige, som derefter analyseres af en GC-MS. Ved hjælp af denne metode kan duft flygtige stoffer udtages ved hjælp af en ikke-destruktiv metode med en maskine, der let transporteres. Denne metode anvender en hurtig prøvetagnings procedure, der skærer Prøvetagningstiden ned fra 2-3 timer til ca. 10 minutter. Ved hjælp af GC-MS kan duft forbindelserne identificeres individuelt baseret på autentiske standarder. De trin, der anvendes til indsamling af duft-og kontroldata, vises fra materiale opsætningen til indsamling af data output.
Introduction
Blomster producerer typisk en duft, der bruges til at tiltrække bestøvere. Disse duftstoffer består af mange kemiske forbindelser, der alle handler sammen som en blomstret blanding1,2,3. Uden disse duftstoffer, ville blomster være mindre tilbøjelige til at videregive deres genetiske oplysninger ved hjælp af bestøvere. Blomstret duft er blevet dokumenteret i mange blomstrende plante familier, med Orchidaceae er en af de mere almindeligt familier studerede4. For at forstå rollen som blomstret duft i bestøvning, er det vigtigt at ikke destruktivt indsamle og analysere de kemiske forbindelser, der udsendes fra blomsterne på forskellige tidspunkter af dagen og i løbet af de flere dage til uger blomster Blooms er åbne, som duft kan variere over tid5.
En tidlig protokol for denne type prøveudtagning blev udviklet af Heath og Manukian6. Formålet med deres prøvetagningsmetoder var at reducere stress på præparatet (f. eks. planter, insekter), der blev undersøgt. Tidligere papirer dokumenteret, at destruktive procedurer til anlægget var påkrævet, såsom at fjerne blomstrende blomster for at indsamle duften. Nyere blomster dufte publikationer af Cancino og Damon7,8 brugt lignende metoder. Denne undersøgelse satte blomsterne i glas kamre og passerede renset luft over dem; derefter blev duftstoffer fra kammeret absorberet på porøse polymer adsorbenter i klare Pasteur pipetter. Duftstofferne blev indsamlet i mindst to timer i løbet af denne undersøgelse. Sadler et al.9 gennemførte blomsterduft undersøgelser på en epifytiske orkidé i South Florida, meget gerne den oprindelige undersøgelse10. Igen, denne undersøgelse krævede blomsterne skal udtages prøver i over to timer til at indsamle duft flygtige, med duft indsamlet på den porøse polymer adsorbent. Papiret her præsenterer en ikke-destruktiv metode, der giver mulighed for meget hurtigere prøvetagning, varig kun 10 minutter. Også i stedet for at bruge et glas kammer ovn bageposer anvendes, som giver mulighed for mere fleksibel bevægelse af kammeret og reducere chancerne for skader på blomsterne. Disse poser kommer i flere størrelser giver mulighed for at vælge størrelsen af posen, der nemt vil passe individuelle prøver uden at beskadige prøven eller det omgivende materiale. Den adsorbent, der anvendes i denne undersøgelse, var Tenax porøs polymer adsorbent. Dette adskiller sig fra Porapak, fordi prøven kan termisk desorberet på GC-MS kolonne til analyse, eliminere brugen af et kemisk opløsningsmiddel.
Metoderne i denne undersøgelse giver en måde til hurtigt at prøve duft flygtige produceret af blomster og kunne bruges til at prøve flygtige stoffer fra andre eksemplarer samt, såsom insekt feromoner, eller svampe flygtige. Den reducerede tid for prøvetagning betyder, at der er mindre stress på prøven og evnen til at indsamle mange prøver i løbet af kort tid. For eksempel, i sadler et al.9, blomsten var kun duftende om natten, så kun to eller tre prøver kunne indsamles hver nat. Med metoden her, prøver kunne tages hele natten på 15-20-minutters intervaller fra samme blomst. Desuden kan headspace ved brug af poser i stedet for glas kamre suspenderes lettere for prøvetagning i marken til in situ-opsamling på truede eller truede plantearter. Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, vi var i stand til at prøve blomster 1,5 til 2 meter over jorden. Disse metoder er utroligt nyttige for duft samling i laboratoriet og marken, og giver forskerne en prøveudtagningsteknik, der er hurtig og ikke-destruktiv til prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: parfume eller duftende lotion og produkter må ikke bæres under nogen af disse procedurer.
1. valg af blomst
Bemærk: de anvendte blomster kan enten være naturligt voksende i miljøet eller holdes under kunstige miljøforhold. Temperatur, fugtighed og lysniveau under samlingen kan variere baseret på de specifikke blomsterart, der anvendes, og hvilken type data der indsamles. For eksempel, data er blevet indsamlet i løbet af dagen og om natten for den samme blomst til at afgøre, om duften varierer over tid på dagen, og indsamlet fra både in situ og drivhus blomster.
- Vælg en blomst, der oprindeligt uåbnet, for at standardisere prøve indsamlings tiden. Denne kontrol for en blomst skiftende duft over tid.
- Afhængigt af varigheden af den blomstrende tid, hvis det er muligt, vente mindst 24 timer efter blomstrende at indsamle prøven, indstilling af en standard tid for alle prøver.
- Hvis der er flere blomstrende blomster på en plante, markere den, der vil blive brugt med Flagning tape eller noget lignende for at sikre gentagen prøvetagning af samme blomst.
2. materiale forberedelse
- Brug ovnposer (ca. 40,5 cm × 44,5 cm) og bølgepap PTFE slange.
- I første omgang koge ovnposer i vand til ~ 30 min at fjerne resterende plast forbindelser. Til tørring, bages i en ovn ved 175 °C.
- Når poserne er tørret, tilsættes en polypropylen skotforening til hvert hjørne af den lukkede ende af ovnen poser. Disse vedhæftede filer tillader tilslutning af rør til at skubbe kul filtreret luft ind og trække duft ud af headspace.
- Skyl alle poser og rør med 75% ethanol. Lad begge lufttørre efter skylning.
- Efter ovnposer er tørret, bage poser og rør i en ovn ved lav varme, ca. 74-85 °C i 30 min.
3. flygtig indsamling
Bemærk: sterile neopren handsker skal bæres under hele denne proces, da det kan kontaminere prøverne at kontakte posen eller filterpatronerne.
- Dæk den valgte blomst med en bagt ovntaske. Cinch posen sammen stramt med en plastik zip slips under blomsten for at forhindre uønsket luftstrøm i posen.
- Fastgør et rør fra opsamlings udstyrets luftudtag, og Tilslut det til en af skotternes fagforeninger på ovnposen.
- På den anden skotunion monteres en glasfilter patron, der indeholder porøs polymer adsorbent.
- Fastgør et andet rør til opsamlings udstyret på vakuum indgangen. enden af det andet rør til glas flygtige opsamlings filterpatron.
- Tænd både luftpumpen og vakuum på samme tid sat til ~ 0,05 L/min. Headspace omkring blomsten vil fylde med luft, men ikke blive over oppustet. Systemet vil trække luft fra posen gennem filteret, fældefangst af blomster flygtige.
- Lad maskinen køre i 10 minutter og sluk for både luftpumpen og vakuum.
Bemærk: blomsterarter, der producerer/udsender en mindre mængde duft, skal muligvis udtages i en længere periode. - Demontere rørene og glasfilter patronen. Anbring filteret i et hætteglas med skruelåg. Når hætten er tændt, Forsegl hætteglasset med PTFE-rørtrådtape.
- Opbevar prøverne i en fryser, indtil de analyseres med GC-MS.
- Gentag denne proces med en ren ovnpose og glasfilter, denne gang med en tom ovnpose, for at indsamle en blank luftprøve som kontrol. Dette gør det muligt at identificere de baggrunds flygtige stoffer, der indsamles.
Bemærk: gentagen prøveindsamling skal udføres på omtrent samme tidspunkt hver dag, da nogle blomster producerer varierende duft niveauer i løbet af en dag.
4. GC-MS
- Tag glasfilter patronen ud af fryseren og anbring den i en GC-MS i injektor porten.
- Frigør headspace flygtige stoffer indsamlet på porøs polymer adsorbent fra adsorbent ved opvarmning i den termiske opsamlings fælde (TCT) til 220 °C i 8 minutter inden for en strøm af helium gas (hastighed: 1,2 mL/min).
- Saml desorberet-forbindelser i TCT Cold Trap-enheden ved-130 °c. Kold fælde temperaturen reguleres af GC-MS-programmet.
- Flashen opvarmes TCT Cold Trap-enheden for at injicere forbindelserne til kapillar søjlen i den gaskromatograf, som TCT-kold fælde enheden var tilsluttet. Metoden til TCT begynder ved-20 °C og slutter ved 150 °C.
- Programmet GC-MS til at stige fra 40 °C til 280 °C ved 15 °C/min, med en 5 min hold ved 40 °C.
5. data analyse
- Til identifikation, sammenligne massespektre af prøven til dem fra massespektre biblioteker (NIST og Department of Chemical Ecology, GOTEBORG University, Sverige11), samt opbevaringstider af flygtige stoffer til tider med autentiske sammensatte standarder12.
- Sammenlign kromatogrammer af indsamlede flygtige stoffer for at identificere fælles tilbagevendende toppe.
- Efter at identificere peak flygtige, bruge Pherobase (online database af semiochemicals og feromoner) at afgøre, om de tidligere er beskrevet i blomster dufte10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative data fra GC-MS er vist som et kromatogram i figur 1. Ud over kromatogrammet gives der også en datafil med resultater (supplerende fil 1). Denne datafil giver Opbevaringstiden for hver spids (RT), og en identifikation af, hvad forbindelse, at peak er (bibliotek/ID). Toppe mellem 10:00 og 15:00 minutter er blomstret flygtige, på grund af molekylvægten af forbindelserne10. Tallene over toppene tilkendegiver opbevaringstiderne for de identificerede forbindelser, som er refereret datafilen af resultaterne (supplerende fil 1). Ved opnåelse af kromatogrammet og datafilen for hver duftprøve kan forbindelserne sammenlignes, og de, der er tilbagevendende for hver blomst prøve, kan identificeres. Samlinger kan identificeres fra dette dokument under kategorien "eksempel", der er angivet til at repræsentere blomsten udtaget, og tidspunkt og dato for samlingen (eksempel: UF1 8AM 03/16/15). Side 1 i dette dokument viser også identifikationen af specifikke forbindelser, der er identificeret fra prøven (LibraryID), som peak retentionstiden fra figur 1 sammensatte svarer til (PK #), og den procentdel af den samlede duft, at hver flygtige omfatter (område%). Alle de indsamlede flygtige stoffer opført under "bibliotek/ID" kan refereres i Pherobase for at afgøre, om de tidligere har beskrevet i en blomstret duft. For eksempel, i den supplerende fil 1, sammensatte #21, med en retentions tid (RT) af 10,311 er blevet identificeret som benzaldehyde. I fremtidige prøver, hvis benzaldehyd er til stede, det kan refereres på pherobase at afgøre, om det er en sandsynlig blomstret forbindelse til blomsten. I figur 2blev benzaldehyd søgt på pherobase. Når en forbindelse er blevet valgt, viser siden en liste over alle blomsterarter, arrangeret af plante familien, hvorfra denne duftstof er blevet identificeret. Fremhævet i nederste højre hjørne af figur 2 er en lille delmængde af orkidé arterne (Orchidaceae), hvorfra benzaldehyd har været fast besluttet på at være til stede i blomstret duft.
Figur 1: GC-MS volatile peak resultater. Grafiske resultater viser peak flygtige af blomstret duftprøve. Tal over toppene svarer til en liste over alle indsamlede flygtige forbindelser, der identificerer toppen til den specifikke flygtige. Toppe mellem 10:00 og 15:00 minutter er mest tilbøjelige til at være flygtige fra en blomstret duft. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempelresultater for Pherobase. Et eksempel på resultater fra en Pherobase søgning efter en duftstof. I dette tal Benzaldehyde blev søgt, og resultaterne viser en liste over alle blomsterarter, hvorfra denne duft er blevet identificeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: resultat data. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om denne teknik er utrolig værdifuld for sin prøvetagning hastighed og bærbarhed, en begrænsning bruger det til epifytiske arter, eller dem, der vokser på træer og ikke fra jorden. I den oprindelige undersøgelse10, en af blomsterne udtaget var Epiphytic. Da maskinen er for tung til at hænge frit, skal der laves en stabil, forhøjet base til prøvetagning. Desuden kan maskinen enten tilsluttes til en stikkontakt eller batteridrevet, så hvis der er langvarige Mark prøvetagning, skal der være en strømkilde til opladning af batterierne, når maskinen ikke er i brug.
Metoderne her giver mulighed for en in-situ ikke-destruktiv prøvetagning, med hurtig gentagen prøvetagning og en meget hurtigere prøvetagningstidspunkt. Mens nogle blomsterduft undersøgelser kræver, at duften skal opsamles i 2-3 timer for en prøve, kan den præsenterede metode præcist indsamle flygtige stoffer i ca. 10 min på grund af indsamlings materialet (porøs polymer adsorbent), der anvendes i glasset Filter.
Disse indsamlingsmetoder giver en måde at hurtigt og sikkert prøve duften produceret af blomster, uden at ødelægge eller skade blomsten. Med så mange blomster, især dem i familien Orchidaceae, der kategoriseres som truede eller truede, analysere duftstoffer, de producerer i en ikke-destruktiv måde er kritisk, da arbejdet er udført for at forstå deres bestøvning biologi. De oplysninger, der blev indhentet fra disse undersøgelser, kunne potentielt bruges til at øge bestøvning ved hjælp af syntetiske blandinger baseret på spids kemikalier, der blev fundet for at tiltrække flere bestøvere til områder med blomstrende orkideer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
USDA-ARS forskningsprojekt nummer 6036-22000-028-00D. Brugen af handels-, firma-eller selskabsnavne i denne publikation er til information og bekvemmelighed for læseren. En sådan anvendelse udgør ikke en officiel godkendelse eller godkendelse fra Usa's landbrugsministerium eller landbrugs forskningstjeneste af nogen vare eller tjenesteydelse til udelukkelse af andre, der kan være egnede. Desuden, University of Florida Biology Department-Lewis og Varina Vaughn Fellowship i Orchid Biology (2017), og en University of Florida Graduate Research Fellowship (2014-2018) forudsat finansiering samt. Vi takker også Cindy Bennington fra Stetson University for orkidé planten, der bruges under optagelserne af denne video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
