Summary
Her presenterer vi en protokoll for å samle blomsterduft flyktige fra blomstrende blomster, ved hjelp av en ikke-destruktiv prøvetaking prosedyre.
Abstract
Dufter av mange blomster familier har blitt samplet og flyktige analysert. Kjenne forbindelsene som utgjør dufter kan være et viktig skritt til bevaring av blomster som er truet eller truet. Fordi Floral duft er avgjørende for å tiltrekke pollinatorer, kan denne metoden brukes til å bedre forstå eller til og med forbedre pollinering. Vi presenterer en protokoll ved hjelp av en bærbar trekull luftfilter og vakuum for å samle blomsterduft flyktige, som deretter analyseres av en GC-MS. Ved å bruke denne metoden, duft flyktige kan samples ved hjelp av en ikke-destruktiv metode med en maskin som er lett transporteres. Denne metodikken bruker en rask prøvetaking prosedyre, kutte prøvetaking tid ned fra 2-3 timer til ca 10 minutter. Ved hjelp av GC-MS, kan duft forbindelsene identifiseres individuelt, basert på autentiske standarder. Trinnene som brukes for innsamling av duft-og kontroll data presenteres, fra Material oppsett til innsamling av data utdata.
Introduction
Blomster produserer vanligvis en duft som brukes til å tiltrekke seg pollinatorer. Disse dufter består av mange kjemiske forbindelser alle opptrer sammen som en floral blanding1,2,3. Uten disse dufter, ville blomstene være mindre sannsynlighet for å formidle sin genetiske informasjon ved hjelp pollinatorer. Floral duft har blitt dokumentert i mange blomstrende plantefamilier, med Orchidaceae å være en av de mer vanlige familiene studert4. For å forstå rollen til Floral duft i pollinering, er det viktig å destruktiv samle og analysere de kjemiske forbindelsene som slippes ut fra blomstene på forskjellige tider av dagen og i løpet av flere dager til uker blomsten blomstrer er åpne, som duft kan variere over tid5.
En tidlig protokoll for denne typen prøvetaking ble utviklet av Heath og Manukian6. Målet med deres Prøvetakings metoder var å redusere belastningen på prøven (f.eks. planter, insekter) som ble studert. Tidligere papirer dokumentert at destruktive prosedyrer til anlegget var nødvendig, for eksempel fjerne blomstrende blomster for å samle duften. Nyere Floral duft publikasjoner av Cancino og Damon7,8 brukt lignende metoder. Denne studien satte blomstene i glass kamre og passerte renset luft over dem; deretter duft forbindelser fra kammeret ble absorbert på porøse polymer adsorbenter i klare Pasteur pipetter. Den dufter ble samlet i minst to timer i løpet av denne studien. Sadler et al.9 utført Floral duft studier på en epifyttiske orkidé i Sør Florida, omtrent som den opprinnelige studien10. Igjen, denne studien krevde blomstene til å bli samplet i over to timer for å samle duften flyktige, med duft samlet inn på porøse polymer adsorbent. Papiret Her presenterer en ikke-destruktiv metode som gjør det mulig for mye raskere prøvetaking, som varer bare 10 minutter. Også, i stedet for å bruke et glass kammer ovn bakervarer poser brukes, som gir mulighet for mer fleksibel bevegelse av kammeret og redusere sjansene for skade på blomstene. Disse posene kommer i flere størrelser slik at muligheten til å velge størrelsen på posen som vil lett passe individuelle prøver uten å skade prøven eller det omkringliggende materialet. Adsorbent som ble brukt i denne studien var tenax porøse polymer adsorbent. Dette er forskjellig fra Porapak, fordi prøven kan være termisk desorbed på GC-MS kolonne for analyse, eliminerer bruk av et kjemisk løsningsmiddel.
Metodene i denne studien gir en måte å raskt prøve duft flyktige produsert av blomster og kan brukes til å prøve flyktige fra andre eksemplarer også, for eksempel insekt feromoner, eller sopp flyktige. Den reduserte tiden for prøvetaking betyr at det er mindre stress på prøven og evnen til å samle mange prøver i løpet av kort tid. For eksempel, i Sadler et al.9, var blomsten bare duftende om natten, så bare to eller tre prøver kunne samles hver natt. Med metoden her, kan prøvene tas hele natten på 15-20-minutters intervaller fra samme blomst. I tillegg, ved å bruke poser i stedet for glass kamre, kan Headspace bli suspendert lettere for prøvetaking i feltet for in situ samling på truede eller truede plantearter. Ved hjelp av metoden som presenteres her, var vi i stand til å prøve blomster 1,5 til 2 meter over bakken. Disse metodene er utrolig nyttig for duft samling i laboratoriet og feltet, og gir forskere med en prøvetaking teknikk som er rask og ikke-ødeleggende for prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: parfymer eller duftende lotion og produkter må ikke brukes under noen av disse prosedyrene.
1. Flower utvalg
Merk: blomster som brukes kan enten være naturlig voksende i miljøet eller holdt under kunstige miljøforhold. Temperatur, fuktighet og lys nivå under oppsamling kan variere basert på de spesifikke blomster artene som brukes, og hvilken type data som samles inn. For eksempel har data blitt samlet inn i løpet av dagen og om natten for den samme blomsten for å avgjøre om duften varierer over tid på dagen, og hentes fra både in situ og drivhus blomster.
- Velg en blomst som i utgangspunktet er uåpnet, for å standardisere prøve samlings tid. Dette kontroller for en blomst skiftende duft over tid.
- Avhengig av varigheten av blomstringen tid, hvis mulig, vent minst 24 timer etter blomstringen til å samle prøven, sette en standard tid for alle prøvene.
- Hvis det er flere blomstrende blomster på en plante, Merk den som skal brukes med merking tape eller noe lignende for å sikre gjentatt prøvetaking av samme blomst.
2. materiale forberedelse
- Bruk ovnen poser (ca 40,5 cm × 44,5 cm) og korrugerte PTFE slange.
- I utgangspunktet koke ovnen poser i vann i ~ 30 min for å fjerne rester av plast forbindelser. For å tørke, stek i en ovn ved 175 ° c.
- Når posene har tørket, legge til en polypropylen skott Union til hvert hjørne av den lukkede enden av ovnen poser. Disse vedleggene tillater tilkobling av rør for å presse trekull filtrert luft inn og trekke duft ut av Headspace.
- Skyll alle poser og slanger med 75% etanol. La både lufttørke etter skylling.
- Etter at ovnen posene har tørket, bake poser og rør i en ovn ved lav varme, ca 74-85 ° c i 30 min.
3. flyktig samling
Merk: sterile hansker i neopren må bæres gjennom hele denne prosessen, da det å kontakte posen eller filterpatronene kan forurense prøvene.
- Dekk den valgte blomsten med en bakt ovn bag. Cinch posen sammen tett med en plast zip tie under blomsten for å hindre uønsket luftstrøm inn i posen.
- Fest et rør fra luftuttaket på innsamlings utstyret og koble det til en av skott fagforeningene på ovns posen.
- På den andre skott Union, fest en glassfilter patron som inneholder porøse polymer adsorbent.
- Fest et ekstra rør til innsamlings utstyret på vakuum inntaket. Koble enden av det andre røret på glass flyktig oppsamlings filterpatron.
- Slå på både luft pumpen og vakuum samtidig satt til ~ 0,05 L/min. Den Headspace rundt blomsten vil fylle med luft, men ikke bli nytt. Systemet vil trekke luft fra posen gjennom filteret, fangst av floral flyktige.
- La maskinen kjøre i 10 minutter og slå av både luft pumpen og vakuum.
Merk: blomster arter som produserer/avgir en mindre mengde duft kan trenge å bli samplet for en lengre periode. - Demonter rørene og glassfilter patronen. Plasser filteret i et hetteglass med en skrue på lokket. Når hetten er på, forsegle hetteglasset med PTFE rør tråd tape.
- Oppbevar prøvene i fryseren til de analyseres ved hjelp av GC-MS.
- Gjenta denne prosessen med en ren ovn bag og glassfilter, denne gangen med en tom ovn bag, for å samle en blank luft prøve som en kontroll. Dette gjør at enhver bakgrunn flyktige samlet for å bli identifisert.
Merk: gjentatt prøvetaking samling må gjøres på omtrent samme tid hver dag, som noen blomster produserer varierende duft nivåer i løpet av en dag.
4. GC-MULTIPLE SCLEROSIS
- Ta glassfilter patronen ut av fryseren og sett den inn i en GC-MS i injeksjons porten.
- Release Headspace flyktige samlet på porøs polymer adsorbent fra adsorbent ved oppvarming i termisk samling fellen (TCT) til 220 ° c i 8 minutter innenfor en flyt av helium gass (rate: 1,2 mL/min).
- Samle desorbed forbindelser i TCT kald felle enhet ved-130 ° c. Den kalde felle temperaturen reguleres av GC-MS-programmet.
- Flash varme TCT kaldt felle enhet for å injisere forbindelsene inn i kapillær Kol onnen på gassen kromatografisk som TCT kald felle enheten var koblet til. Metoden for TCT begynner ved-20 ° c og slutter ved 150 ° c.
- Programmere GC-MS til å stige fra 40 ° c til 280 ° c ved 15 ° c/min, med en 5 min. Hold ved 40 ° c.
5. data analyse
- For identifisering, sammenligne massen Spectra av prøven til de fra massen Spectra bibliotekene (NIST og Department of Chemical Ecology, Goteborg University, Sverige11), samt oppbevaring ganger av flyktige til tider av autentiske sammensatte standarder12.
- Sammenlign kromatogrammene av innsamlede flyktige for å identifisere vanlige, frem vendende topper.
- Etter å identifisere peak flyktige, bruk Pherobase (online database med semiochemicals og feromoner) for å finne ut om de har vært tidligere beskrevet i floral dufter10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative data fra GC-MS vises som en kromatogram i figur 1. I tillegg til kromatogram finnes det også en datafil med resultater (tilleggsfil 1). Denne datafilen gir Oppbevaringstiden for hver topp (RT) og en identifikasjon av det sammensatte som er (bibliotek/ID). Topper mellom 10:00 og 15:00 minutter er floral flyktige, på grunn av den molekylære vekten av forbindelsene10. Tallene over toppene betegne oppbevaring ganger av identifiserte forbindelser som er referert til datafilen av resultatene (supplerende fil 1). Ved å skaffe kromatogram og datafilen for hver duft prøve, kan forbindelsene sammenlignes og de som er igjen for hver blomst prøve kan identifiseres. Samlinger kan identifiseres fra dette dokumentet under kategorien "sample", navngitt for å representere blomsten samplet, og dato og klokkeslett for innsamling (eksempel: UF1 8AM 03/16/15). Side 1 av dette dokumentet viser også identifikasjonen av spesifikke forbindelser identifisert fra prøven (biblioteks), som peak oppbevaring tid fra figur 1 sammensatt tilsvarer (pk #), og prosentandelen av den totale duften som hver volatile omfatter (areal%). Alle innsamlede flyktige oppført under "Library/ID" kan refereres i Pherobase å avgjøre om de tidligere har beskrevet i en Floral duft. I tilleggsfilen 1er for eksempel sammensatte #21, med en oppbevaringstid (RT) på 10,311 identifisert som benzaldehyde. I fremtidige prøver, hvis benzaldehyde er til stede, kan det refereres på Pherobase å avgjøre om det er en sannsynlig floral sammensatte for blomsten. I figur 2ble benzaldehyde søkt på Pherobase. Når en sammensatt er valgt, viser siden en liste over alle blomster arter, organisert av plantefamilie, som at duften sammensatte har blitt identifisert. Uthevet i nedre høyre hjørne av figur 2 er en liten undergruppe av orkidé arter (Orchidaceae) som benzaldehyde har vært fast bestemt på å være til stede i Floral duft.
Figur 1: flyktige topp resultater for GC-MS. Grafiske resultater som viser toppen flyktige av Floral duft prøven. Tall over toppene tilsvarer en liste over alle innsamlede flyktige forbindelser, identifisere toppen til den spesifikke volatile. Topper mellom 10:00 og 15:00 minutter er mest sannsynlig å bli flyktige fra en Floral duft. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Pherobase eksempel resultater. Et eksempel på resultater fra en Pherobase Søk etter en duft sammensatte. I denne figuren Benzaldehyde ble søkt, og resultatene viser en liste over alle blomster arter som denne duften har blitt identifisert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: resultat data. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om denne teknikken er utrolig verdifullt for sin sampling hastighet og portabilitet, er en begrensning bruker det for epifyttiske arter, eller de som vokser på trær og ikke fra bakken. I den opprinnelige studien10, en av blomstene samplet var epifyttiske. Fordi maskinen er for tung til å henge fritt, må en stabil, forhøyet base gjøres for prøvetaking. I tillegg kan maskinen enten være koblet til en stikkontakt eller batteridrevet, så hvis det er forlenget felt prøvetaking, må det være en strømkilde for å lade batteriene når maskinen ikke er i bruk.
Metodene her gir mulighet for en in situ ikke-destruktiv prøvetaking, med rask gjentatt prøvetaking og en mye raskere sampling tid. Mens noen Floral duft studier krever duften skal samles i 2-3 timer for en prøve, den presenterte metoden kan nøyaktig samle flyktige i ca 10 min på grunn av samlingen materiale (porøs polymer adsorbent) som brukes i glasset Filter.
Disse samling metoder gir en måte å raskt og sikkert prøve duften produsert av blomster, uten å ødelegge eller skade blomsten. Med så mange blomster, spesielt de i familien Orchidaceae, blir kategorisert som truet eller truet, analysere dufter de produserer i en ikke-destruktiv måte er kritisk som arbeidet er gjennomført for å forstå deres pollinering biologi. Informasjonen fra disse studiene kan potensielt brukes til å øke pollinering ved hjelp av syntetiske blandinger basert på peak kjemikalier funnet å tiltrekke seg mer pollinatorer til områder med blomstrende orkideer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
USDA-ARS forskningsprosjekt nummer 6036-22000-028-00D. Bruken av handel, firma, eller aksjeselskap navn i denne publikasjonen er for informasjon og bekvemmelighet av leseren. Slik bruk utgjør ikke en offisiell godkjenning eller godkjennelse fra det amerikanske Landbruksdepartementet eller landbruks forsknings tjenesten til noe produkt eller tjeneste for utelukkelse av andre som kan være egnet. I tillegg, University of Florida Biology Department-Lewis og Varina Vaughn Fellowship i Orchid Biology (2017), og en University of Florida Graduate Research Fellowship (2014-2018) forutsatt finansiering også. Vi takker også Cindy Bennington fra Stetson University for orkidé anlegget brukes under filmingen av denne videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
