Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att samla in blommiga doft flyktiga ämnen från blommande blommor, med hjälp av en icke-förstörande provtagning förfarande.
Abstract
Dofter av många blomma familjer har provtagits och flyktiga ämnen analyseras. Att känna till de föreningar som utgör dofter kan vara ett viktigt steg till bevarandet av blommor som hotas eller äventyras. Eftersom blommig doft är avgörande för att locka pollinatörer, denna metod kan användas för att bättre förstå eller till och med förbättra pollinering. Vi presenterar ett protokoll med hjälp av en bärbar kol luftfilter och vakuum för att samla blommig doft flyktiga ämnen, som sedan analyseras av en GC-MS. Genom att använda denna metod kan doft flyktiga ämnen samplas med en icke-förstörande metod med en maskin som är lätt transporteras. Denna metod använder en snabb provtagning förfarande, skära provtagning tid ner från 2-3 timmar till cirka 10 minuter. Med GC-MS kan doft föreningarna identifieras individuellt, baserat på autentiska standarder. De steg som används för att samla in doft-och kontrolldata presenteras, från material inställning till insamling av data utdata.
Introduction
Blommor producerar vanligtvis en doft som används för att locka pollinatörer. Dessa dofter består av många kemiska föreningar alla agerar tillsammans som en blommig blandning1,2,3. Utan dessa dofter, skulle blommor vara mindre benägna att vidarebefordra sin genetiska information med hjälp av pollinatörer. Blommig doft har dokumenterats i många blommande växtfamiljer, med Orchidaceae är en av de vanligare familjerna studerade4. För att förstå den roll som blommig doft i pollinering, är det viktigt att nondestruktivt samla in och analysera de kemiska föreningar som släpps ut från blommorna vid olika tidpunkter på dagen och under de flera dagar till veckor Blom blomningarna är öppna, som doft kan variera över tid5.
Ett tidigt protokoll för denna typ av provtagning utvecklades av Heath och Manukian6. Målet med deras provtagningsmetoder var att minska påfrestning på preparatet (t. ex. växter, insekter) som studerades. Tidigare uppsatser dokumenterade att destruktiva procedurer till anläggningen krävdes, såsom att ta bort blommande blommor för att samla in doften. Nyare blommiga dofter publikationer av Cancino och Damon7,8 används liknande metoder. Denna studie satte blommorna i glas kammare och passerade renad luft över dem; sedan absorberades doft föreningarna från kammaren på porösa polymeradsorbenter i klara Pasteur-pipetter. Dofterna samlades in i minst två timmar under denna studie. Sadler et al.9 genomförde blommiga doft studier på en epifytisk orkidé i södra Florida, likt den ursprungliga studien10. Återigen, denna studie krävde blommorna som ska provtas i över två timmar för att samla in doften flyktiga, med doft samlas på den porösa polymer adsorbent. Papperet här presenterar en oförstörande metod som möjliggör mycket snabbare provtagning, som varar bara 10 minuter. Också, istället för att använda en glas kammare ugn bakning påsar används, vilket möjliggör mer flexibel förflyttning av kammaren och minska risken för skador på blommorna. Dessa påsar finns i flera storlekar som gör det möjligt att välja storleken på påsen som lätt kan passa enskilda prover utan att skada provet eller det omgivande materialet. Den adsorbent som används i denna studie var tenax porösa polymer adsorbent. Detta skiljer sig från Porapak, eftersom provet kan termiskt desorberats på GC-MS kolumn för analys, vilket eliminerar användningen av ett kemiskt lösningsmedel.
Metoderna i denna studie ger ett sätt att snabbt prov doft flyktiga ämnen som produceras av blommor och kan användas för att prova flyktiga ämnen från andra prover samt, såsom insekt feromoner, eller svamp flyktiga ämnen. Reducerad tid för provtagning innebär mindre stress på provet och förmågan att samla många prover på kort tid. Till exempel, i Sadler et al.9, blomman var bara doftande på natten, så bara två eller tre prover kunde samlas varje natt. Med metoden här, prover kan tas hela natten på 15-20-minuters mellanrum från samma blomma. Dessutom, genom att använda påsar i stället för glas kammare, kan headspace skjutas upp lättare för provtagning i fältet för in situ insamling på utrotningshotade eller hotade växtarter. Med hjälp av den metod som presenteras här, kunde vi prova blommor 1,5 till 2 meter ovan jord. Dessa metoder är oerhört användbara för doft insamling i laboratoriet och fältet, och ger forskarna en provtagningsteknik som är snabb och icke-förstörande till provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: parfymer eller parfymerade lotion och produkter får inte bäras under något av dessa procedurer.
1. blomma urval
Obs: blommor som används kan antingen naturligt växer i miljön eller hålls under konstgjorda miljöförhållanden. Temperatur, fuktighet och ljus nivå under insamlingen kan variera beroende på de specifika blomarter som används och vilken typ av data som samlas in. Till exempel har data samlats in under dagen och på natten för samma blomma för att avgöra om doften varierar över tid på dagen, och samlas in från både in situ och växthus blommor.
- Välj en blomma som inledningsvis är oöppnad, för att standardisera prov insamlingstiden. Detta reglage för en blomma som förändrar doften över tid.
- Beroende på varaktigheten av blommande tid, om möjligt, vänta minst 24 timmar efter blomning för att samla in provet, ange en standardtid för alla prover.
- Om det finns flera blommande blommor på en anläggning, markera den som kommer att användas med flaggning tejp eller något liknande för att säkerställa upprepad provtagning av samma blomma.
2. material beredning
- Använd ugns påsar (ca 40,5 cm × 44,5 cm) och korrugerad PTFE-slang.
- Initialt, koka ugns påsar i vatten för ~ 30 min för att ta bort kvarvarande plast föreningar. För att torka, grädda i en ugn vid 175 ° c.
- När säckarna har torkat, tillsätt en polypropylenskott unionen till varje hörn av den stängda änden av ugns säckarna. Dessa bilagor tillåter anslutning av rör för att driva kol filtrerad luft in och dra doften ur headspace.
- Skölj alla påsar och tuber med 75% etanol. Låt båda lufttorka efter sköljningen.
- Efter ugns säckarna har torkat, baka påsar och rör i en ugn vid låg värme, ca 74-85 ° c i 30 min.
3. flyktig uppsamling
Obs: sterila neopren handskar måste bäras under hela denna process, som att kontakta påsen eller filterpatroner kan förorta proverna.
- Täck den valda blomman med en bakad ugns påse. Cinch påsen tillsammans tätt med en plast blixtlås slips under blomman för att förhindra oönskade luftflöde i påsen.
- Fäst ett rör från uppsamlings utrustningens luftutlopp och Anslut det till ett av skott facken på ugns påsen.
- På andra skott facket, bifoga en glas filterpatron som innehåller porösa polymer adsorbent.
- Anslut ett andra rör till insamlings utrustningen på vakuum ingången. Anslut änden av det andra röret till glaset flyktiga uppsamlings filterpatronen.
- Slå på både luftpump och vakuum på samma gång inställd på ~ 0,05 L/min. Headspace runt blomman kommer att fyllas med luft, men inte bli Överblåsta. Systemet kommer att dra luft från påsen genom filtret, fånga de blommiga volatiles.
- Låt maskinen köra i 10 min och sedan stänga av både luftpump och vakuum.
Observera: blomarter som producerar/avger en mindre mängd doft kan behöva provtas under en längre tid. - Demontera rören och glas filterpatronen. Placera filtret i en injektionsflaska av glas med skruvkork. När locket är på, försegla injektionsflaskan med PTFE pipe gängtejp.
- Förvara proverna i en frys tills de analyseras med GC-MS.
- Upprepa denna process med en ren ugns påse och glas filter, denna gång med en tom ugns påse, för att samla ett tomt luftprov som en kontroll. Detta gör att eventuella bakgrunds flyktiga ämnen som samlats in för att identifieras.
Anmärkning: upprepande provinsamling måste göras vid ungefär samma tid varje dag, eftersom vissa blommor producerar varierande doft nivåer under loppet av en dag.
4. GC-MS
- Ta bort glas filterpatronen från frysen och placera den i en GC-MS i insprutnings porten.
- Frigör headspace flyktiga ämnen som samlats på porösa polymer adsorbent från adsorbent genom upphettning i Thermal Collection Trap (TCT) till 220 ° c för 8 min inom ett flöde av helium gas (Rate: 1,2 mL/min).
- Samla desorberade föreningar i TCT-kalltrap-enheten vid-130 ° c. Den kalla fällan temperatur regleras av GC-MS-programmet.
- Blixten värmer TCT: s kall fälla enhet för att injicera föreningarna i den kapillärkolonn av gaskromatografen som TCT-kalltrap enheten var ansluten till. Metoden för TCT börjar vid-20 ° c och slutar vid 150 ° c.
- Program mera GC-MS att stiga från 40 ° c till 280 ° c vid 15 ° c/min, med en 5 min håll vid 40 ° c.
5. analys av data
- För identifikation, jämför massspektra av provet med de från Mass Spectra-biblioteken (NIST och Institutionen för kemisk ekologi, Göteborgs universitet, Sverige11), samt retentionstider för flyktiga ämnen till tider av autentiska sammansatta standarder12.
- Jämför kromatogram av insamlade flyktiga ämnen för att identifiera vanliga återkommande toppar.
- Efter att identifiera den maximala volatiles, använda pherobase (online databas av semiokemikalier och feromoner) för att avgöra om de tidigare har beskrivits i Floral dofter10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa data från GC-MS visas som ett kromatogram i figur 1. Förutom kromatogrammet tillhandahålls även en datafil med resultat (kompletterande fil 1). Den här datafilen innehåller kvarhållningstid för varje topp (RT) och en identifiering av vilken sammansättning som Peak är (bibliotek/ID). Toppar mellan 10:00 och 15:00 minuter är blommiga volatiles, på grund av molekylvikt av föreningarna10. Siffrorna ovanför topparna betecknar retentionstiderna för de identifierade föreningarna som refereras till datafilen av resultaten (kompletterande fil 1). Genom att erhålla kromatogrammet och datafilen för varje doftprov kan föreningarna jämföras och de som återkommer för varje Blom prov kan identifieras. Samlingar kan identifieras från detta dokument under kategorin "Sample", namngiven för att representera blomman urvalet, och tid och datum för insamling (exempel: UF1 8AM 03/16/15). Sidan 1 i detta dokument visar också identifiering av specifika föreningar som identifierats från provet (LibraryID), som topp retentionstiden från figur 1 föreningen motsvarar (PK #), och andelen av den totala doften att varje flyktiga omfattar (område%). Alla insamlade flyktiga ämnen som anges under "Library/ID" kan refereras i Pherobase att avgöra om de tidigare har beskrivits i en blommig doft. Till exempel i tilläggsfilen 1, sammansatta #21, med en retentionstid (RT) för 10,311 har identifierats som bensaldehyd. I framtida prover, om bensaldehyd är närvarande, det kan refereras på Pherobase att avgöra om det är en sannolik blommig förening för blomman. I figur 2, bensaldehyd sökte på Pherobase. När en förening har valts, visar sidan en lista över alla blomster arter, organiserade av växtfamilj, från vilken denna doft förening har identifierats. Markerad i det nedre högra hörnet av figur 2 är en liten delmängd av orkidén arter (Orchidaceae) från vilken bensaldehyd har fastställts att vara närvarande i den blommiga doften.
Figur 1: flyktiga toppresultat i GC-MS. Grafiska resultat som visar den maximala flyktiga ämnen av blom doft provet. Siffrorna ovanför topparna motsvarar en förteckning över alla insamlade flyktiga föreningar, identifiera toppen till den specifika flyktiga. Toppar mellan 10:00 och 15:00 minuter är mest sannolikt att vara flyktiga ämnen från en blommig doft. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på Ferobase-resultat. Ett exempel på resultat från en Pherobase söka efter en doft förening. I denna siffra söktes bensaldehyd, och resultaten visar en lista över alla blomster arter från vilka denna doft har identifierats. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: resultat data. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om denna teknik är oerhört värdefullt för dess provtagning hastighet och bärbarhet, en begränsning använder den för epifytiska arter, eller de som växer på träd och inte från marken. I den ursprungliga studien10var en av de utvalda blommorna epifytisk. Eftersom maskinen är för tung för att hänga fritt, måste en stabil, förhöjd bas göras för provtagning. Dessutom kan maskinen antingen anslutas till ett eluttag eller batteridriven, så om det finns förlängd fältsampling måste det finnas en strömkälla för att ladda batterierna när maskinen inte används.
Metoderna här medger en in situ oförstörande provtagning, med snabb upprepad provtagning och en mycket snabbare provtagningstid. Medan vissa blommiga doft studier kräver att doften samlas in för 2-3 timmar för ett prov, kan den presenterade metoden exakt samla in flyktiga ämnen i cirka 10 min på grund av insamling material (porösa polymer adsorbent) som används i glaset Filter.
Dessa insamlingsmetoder ger ett sätt att snabbt och säkert prova doften som produceras av blommor, utan att förstöra eller skada blomman. Med så många blommor, särskilt de i familjen Orchidaceae, kategoriseras som hotade eller utrotningshotade, analysera dofter de producerar på ett icke-destruktivt sätt är kritisk eftersom arbetet bedrivs för att förstå deras pollinering biologi. Den information som erhållits från dessa studier kan potentiellt användas för att öka pollinering med hjälp av syntetiska blandningar baserade på topp kemikalier som finns för att locka fler pollinatörer till områden med blommande orkidéer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
USDA-ARS forskningsprojekt nummer 6036-22000-028-00D. Användningen av handels-, firma-eller företagsnamn i denna publikation är för information och bekvämlighet för läsaren. Sådan användning utgör inte ett officiellt stöd eller godkännande från Förenta staternas jordbruksdepartement eller jordbruks forsknings tjänsten av någon produkt eller tjänst, utan att utesluta andra som kan vara lämpliga. Dessutom, University of Florida biologi Department-Lewis och Varina Vaughn Fellowship i Orchid Biology (2017), och en University of Florida Graduate Research Fellowship (2014-2018) gav finansiering också. Vi tackar också Cindy Bennington från Stetson University för orkidén anläggningen som används under inspelningen av denna video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
