Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لجمع العطر الازهار متطاير من تزهر الزهور ، وذلك باستخدام اجراء أخذ العينات غير المدمرة.
Abstract
وقد تم أخذ عينات من العطور من العديد من عائلات زهره وتحليل متطاير. معرفه المركبات التي تشكل العطور يمكن ان يكون خطوه هامه للحفاظ علي الزهور المهددة أو المهددة بالانقراض. لان العطر الزهري هو أمر بالغ الاهميه لجذب الملقحات ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لفهم أفضل أو حتى تعزيز التلقيح. نحن نقدم بروتوكول باستخدام فلتر هواء الفحم المحمولة والفراغ لجمع متطاير العطر الازهار ، والتي يتم تحليلها من قبل GC-MS. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن أخذ عينات متطاير العطر باستخدام طريقه غير مدمره مع الجهاز الذي يتم نقله بسهوله. وتستخدم هذه المنهجية اجراء أخذ العينات السريعة ، وخفض وقت أخذ العينات من 2-3 ساعة إلى 10 دقائق تقريبا. باستخدام GC-MS ، يمكن تحديد مركبات العطور بشكل فردي ، استنادا إلى المعايير الاصليه. يتم تقديم الخطوات المستخدمة لجمع الروائح والتحكم في البيانات ، من اعداد المواد لجمع مخرجات البيانات.
Introduction
الزهور تنتج عاده العطر المستخدمة لجذب الملقحات. وتتكون هذه العطور من العديد من المركبات الكيميائية كلها تعمل معا كمزيج الازهار1,2,3. وبدون هذه العطور ، تكون الزهور اقل عرضه لنقل معلوماتها الوراثية باستخدام الملقحات. وقد تم توثيق العطر الازهار في العديد من الأسر النباتية المزهرة ، مع اوردوزيه كونها واحده من الأسر أكثر شيوعا درس4. لفهم دور العطر الازهار في التلقيح ، من المهم لجمع وتحليل غير تدميري المركبات الكيميائية التي تنبعث من الزهور في أوقات مختلفه من اليوم ، وخلال عده أيام إلى أسابيع تزهر زهره مفتوحة ، والعطر يمكن ان تختلف مع مرور الوقت5.
تم تطوير بروتوكول مبكر لهذا النوع من العينات من قبل هيث ومانكيان6. وكان الهدف من أساليب أخذ العينات الخاصة بهم هو الحد من الإجهاد علي العينة (مثل النباتات والحشرات) التي تجري دراستها. وثائق سابقه وثقت ان الإجراءات المدمرة للمصنع كانت مطلوبه ، مثل أزاله تزهر الزهور من أجل جمع العطر. أحدث الزهور العطور المنشورات من قبل cancino ودامون7,8 تستخدم أساليب مماثله. وضعت هذه الدراسة الزهور في الغرف الزجاجية ومرت الهواء النقي عليها ؛ ثم تم امتصاص مركبات العطر من الغرفة علي الممتزات البوليمر المساميه في أنابيب باستور واضحة. تم جمع العطور لمده ساعتين علي الأقل خلال هذه الدراسة. قام سادلر وآخرون9 بدراسات العطور الزهرية علي الاوركيد المعطر في جنوب فلوريدا ، مثل الكثير من الدراسة الاصليه10. مره أخرى ، تطلبت هذه الدراسة ان يتم أخذ عينات من الزهور لأكثر من ساعتين لجمع متطاير العطر ، مع العطر الذي تم جمعه علي الممتزات البوليمر المساميه. وتقدم الورقة هنا طريقه غير مدمره تسمح بأخذ عينات أسرع بكثير ، تدوم 10 دقائق فقط. أيضا ، بدلا من استخدام الفرن غرفه زجاجيه تستخدم أكياس الخبز ، والتي تسمح للحركة أكثر مرونة من الغرفة والحد من فرص الاضرار التي لحقت الزهور. هذه الحقائب تاتي في عده احجام السماح للخيار لتحديد حجم الحقيبة التي من شانها ان تناسب بسهوله العينات الفردية دون الاضرار العينة أو المواد المحيطة بها. وكان الممتزات المستخدمة في هذه الدراسة Tenax المساميه البوليمر الممتزات. هذا يختلف عن porapak ، لان العينة يمكن ان يكون مستوعب حراريا علي العمود GC-MS للتحليل ، والقضاء علي استخدام المذيبات الكيميائية.
الطرق في هذه الدراسة توفر وسيله لعينه بسرعة متطاير العطر التي تنتجها الزهور ، ويمكن استخدامها لعينه من متطاير من عينات أخرى ، وكذلك ، مثل الفيرومونات الحشرات ، أو فطر متطاير. الوقت المخفض لأخذ العينات يعني ان هناك ضغط اقل علي العينة والقدرة علي جمع العديد من العينات في فتره قصيرة من الزمن. علي سبيل المثال ، في Sadler وآخرون9، كانت زهره عبق فقط في الليل ، لذلك فقط اثنين أو ثلاثه عينات يمكن جمعها كل ليله. مع الطريقة هنا ، يمكن ان تؤخذ العينات كل ليله في 15-20 دقائق من نفس الزهرة. بالاضافه إلى ذلك ، باستخدام أكياس بدلا من الغرف الزجاجية ، يمكن تعليق الحيز الراسي أسهل لأخذ العينات في الميدان لجمع في الموقع علي الأنواع النباتية المهددة بالانقراض أو المهددة. باستخدام الطريقة المعروضة هنا ، كنا قادرين علي عينه الزهور 1.5 إلى 2 متر فوق الأرض. هذه الطرق هي مفيده بشكل لا يصدق لجمع العطر في المختبر والميدان ، ويوفر للباحثين مع تقنيه أخذ العينات التي هي سريعة وغير مدمره للعينه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظه: يجب عدم ارتداء العطور أو المستحضرات المعطرة والمنتجات خلال اي من هذه الإجراءات.
1. اختيار زهره
ملاحظه: الزهور المستخدمة يمكن ان تكون اما تنمو بشكل طبيعي في البيئة أو الاحتفاظ بها في ظل الظروف البيئية الاصطناعية. يمكن ان تختلف درجه الحرارة والرطوبة ومستوي الضوء اثناء الجمع استنادا إلى أنواع الزهور المستخدمة المحددة ، وما هو نوع البيانات التي يتم جمعها. علي سبيل المثال ، تم جمع البيانات خلال النهار وفي الليل لنفس الزهرة لتحديد ما إذا كان العطر يختلف علي مر الأيام ، وجمعت من الزهور في الموقع والاحتباس الحراري.
- حدد زهره التي يتم فتحها في البداية ، لتوحيد عينه الوقت جمع. هذه الضوابط لزهره تغيير العطر مع مرور الوقت.
- اعتمادا علي مده الوقت تزهر ، إذا كان ذلك ممكنا ، والانتظار علي الأقل 24 ساعة بعد تزهر لجمع العينة ، ووضع الوقت القياسي لجميع العينات.
- إذا كان هناك الزهور تزهر متعددة علي النبات ، بمناسبه واحد التي سيتم استخدامها مع الشريط الضعيف أو شيء من هذا القبيل لضمان أخذ عينات متكررة من نفس الزهرة.
2-اعداد المواد
- استخدام أكياس الفرن (حوالي 40.5 سم × 44.5 سم) وأنابيب PTFE المموج.
- في البداية ، يغلي أكياس الفرن في الماء ل ~ 30 دقيقه لأزاله المركبات البلاستيكية المتبقية. لتجف ، اخبز في فرن عند 175 درجه مئوية.
- مره واحده وقد جفت أكياس ، أضافه اتحاد البولي بروبيلين الحاجز إلى كل زاوية من نهاية مغلقه من أكياس الفرن. تسمح هذه المرفقات بتوصيل الأنابيب لدفع الهواء المصفي في الفحم وسحب العطر من المساحة الراسية.
- شطف جميع الحقائب والأنابيب مع 75 ٪ الايثانول. دع كلا الهواء يجف بعد الشطف.
- بعد أكياس الفرن والمجففة ، وأكياس خبز وأنابيب في فرن في حرارة منخفضه ، حوالي 74-85 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
3. مجموعه متقلبة
ملاحظه: قفازات النيوبرين العقيمة تحتاج إلى ان ترتديه في جميع انحاء هذه العملية ، كما الاتصال كيس أو خراطيش فلتر يمكن ان تلوث العينات.
- غطي الزهرة المختارة بكيس فرن مخبوز. Cinch الحقيبة معا باحكام مع التعادل البريدي البلاستيكية تحت زهره لمنع تدفق الهواء غير المرغوب فيه في الحقيبة.
- نعلق أنبوب من ماخذ الهواء من معدات جمع وتوصيله إلى واحده من النقابات الحاجز علي كيس الفرن.
- علي الاتحاد الحاجز الأخرى ، نعلق خرطوشه فلتر الزجاج التي تحتوي علي البوليمر المساميه الممتزه.
- ارفق أنبوب ثان لمعدات التجميع علي مدخل الفراغ. الاتصال نهاية الأنبوب الثاني علي خرطوشه فلتر مجموعه متقلبة الزجاج.
- تشغيل كل من مضخة الهواء والفراغ في نفس الوقت تعيين في ~ 0.05 L/min. فان المساحة الراسية حول زهره ملء مع الهواء ، ولكن لا تصبح مبالغ فيها. سيقوم النظام بسحب الهواء من الكيس من خلال الفلتر ، ومحاصره متطاير الازهار.
- السماح للجهاز لتشغيل لمده 10 دقيقه ومن ثم إيقاف كل من مضخة الهواء والفراغ.
ملاحظه: أنواع الزهور التي تنتج/تنبعث منها كميه اقل من العطر قد تحتاج إلى أخذ عينات لفتره أطول من الزمن. - تفكيك الأنابيب وخرطوشه فلتر الزجاج. ضع الفلتر في قارورة زجاجيه بغطاء من المسامير. مره واحده علي الغطاء ، ختم القارورة مع الشريط الموضوع الأنابيب PTFE.
- خزن العينات في الفريزر حتى يتم تحليلها باستخدام GC-MS.
- كرر هذه العملية مع كيس الفرن نظيفه وفلتر الزجاج ، وهذه المرة مع كيس الفرن فارغه ، لجمع عينه الهواء فارغه كعنصر تحكم. ويسمح ذلك بتحديد اي متطاير للخلفية يتم جمعها.
ملاحظه: يجب ان يتم تكرار مجموعه العينات في نفس الوقت تقريبا كل يوم ، حيث تنتج بعض الزهور مستويات مختلفه من العطور علي مدار اليوم.
4. GC-MS
- أزاله خرطوشه فلتر الزجاج من الفريزر ووضعها في GC-MS في منفذ حاقن.
- الإفراج عن متطاير المساحة الراسية التي تم جمعها علي الممتزه البوليمر المساميه من الممتزات عن طريق التسخين في فخ جمع الحرارية (الانتقال) إلى 220 درجه مئوية لمده 8 دقائق داخل تدفق غاز الهيليوم (معدل: 1.2 mL/min).
- جمع المركبات مستوعب في وحده فخ الباردة لانتقال العدوى في-130 درجه مئوية. يتم تنظيم درجه حرارة الفخ الباردة من قبل برنامج GC-MS.
- فلاش تسخين وحده مصيدة البرد لحقن المركبات في العمود الشعرية من الكروماتوغرافي الغاز التي تم توصيل وحده فخ الباردة. تبدا الطريقة لانتقال العدوى عند-20 درجه مئوية وتنتهي عند 150 درجه مئوية.
- برنامج GC-MS للارتفاع من 40 درجه مئوية إلى 280 درجه مئوية في 15 درجه مئوية/دقيقه ، مع عقد 5 دقائق في 40 درجه مئوية.
5-تحليل البيانات
- لتحديد الهوية ، قارن أطياف الكتلة من العينة إلى تلك من مكتبات الأطياف الجماهيرية (NIST وقسم الإيكولوجيا الكيميائية ، جامعه Goteborg ، السويد11) ، فضلا عن أوقات الاستبقاء من متطاير إلى أوقات المعايير المجمعة الاصليه12.
- قارن بين الكروماتوجرام من المتطاير المجمعة للتعرف علي القمم المتكررة الشائعة.
- بعد تحديد متطاير الذروة ، استخدم Pherobase (قاعده بيانات علي الإنترنت من semiochemicals والفيرومونات) لتحديد ما إذا كانت قد وصفت سابقا في عطور الازهار10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر البيانات التمثيلية الواردة من المجموعة المذكورة علي انها كروماتوجرام في الشكل 1. بالاضافه إلى الكروماتوجرام ، يتم أيضا توفير ملف بيانات النتائج (الملف التكميلي 1). يوفر ملف البيانات هذا وقت الاستبقاء لكل ذروه (RT) ، وتعريف ما هو المركب الذي يكون الذروة (مكتبه/معرف). قمم بين 10:00 و 15:00 دقيقه هي متطاير الازهار ، ويرجع ذلك إلى الوزن الجزيئي للمركبات10. وتدل الأرقام الواردة فوق القمم علي أوقات استبقاء المركبات المحددة التي يشار اليها بملف البيانات الخاص بالنتائج (الملف التكميلي 1). عن طريق الحصول علي الكروماتوجرام وملف البيانات لكل عينه العطر ، يمكن مقارنه المركبات وتلك التي تتكرر لكل عينه زهره يمكن التعرف عليها. يمكن التعرف علي المجموعات من هذا المستند تحت فئة "عينه" ، والمسمية لتمثيل الزهرة عينات ، والوقت والتاريخ للمجموعة (مثال: UF1 8AM 03/16/15). وتبين الصفحة 1 من هذا المستند أيضا تعريف المركبات المحددة التي تم تحديدها من العينة (مكتبه الأوراق) ، والتي يبلغ الوقت الأقصى للاحتفاظ بها من الشكل 1 المركب (Pk #) ، والنسبة المئوية من العطر الإجمالي الذي يتالف منه كل متغير (المنطقة%). جميع المتطاير المجمعة المدرجة تحت "مكتبه/معرف" يمكن الرجوع اليها في Pherobase لتحديد ما إذا كانت قد وصفت سابقا في عطر الازهار. علي سبيل المثال ، في الملف التكميلي 1، #21 مركب ، مع وقت استبقاء (RT) من 10.311 تم التعرف علي انه benzaldehyde. في عينات المستقبل ، إذا كان بنزيلديهايد موجودا ، فانه يمكن الرجوع اليها علي pherobase لتحديد ما إذا كان مجمع الزهور المرجح للزهور. في الشكل 2، تم تفتيش بنزلديهايد علي Pherobase. وبمجرد اختيار المجمع ، تظهر الصفحة قائمه بجميع أنواع الزهور ، التي تنظمها العائلة النباتية ، والتي تم التعرف من خلالها علي مجمع العطور. ويسلط الضوء في الزاوية اليمني السفلي من الشكل 2 مجموعه فرعيه صغيره من الأنواع الاوركيد (اوردوزيه) التي تم تحديد بنزيلديهايد ان تكون موجودة في العطر الازهار.
الشكل 1: نتائج الذروة المتقلبة GC-MS. نتائج رسوميه تبين ذروه متطاير عينه العطر الزهري. وتتطابق الأرقام الواردة فوق القمم مع قائمه بجميع المركبات المتطايرة التي تم جمعها ، مما يحدد الذروة إلى التقلبات المحددة. القمم بين 10:00 و 15:00 دقيقه هي الأكثر احتمالا ان متطاير من عطر الازهار. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نتائج المثال Pherobase. مثال علي النتائج من البحث Pherobase لمركب العطر. وفي هذا الشكل ، تم تفتيش بنزلديهايد ، وتظهر النتائج قائمه بجميع أنواع الزهور التي تم التعرف علي هذا العطر منها. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: بيانات النتائج. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
علي الرغم من ان هذه التقنية هي قيمه بشكل لا يصدق لسرعه أخذ العينات وقابليتها ، وهو قيد واحد يستخدم للأنواع الابيائيه ، أو تلك التي تنمو علي الأشجار وليس من الأرض. في الدراسة الاصليه10، واحده من الزهور عينات كانت ابيهيتيك. لان الجهاز ثقيل جدا لشنق بحريه ، يجب ان تكون مستقره ، قاعده مرتفعه لأخذ العينات. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن توصيل الجهاز اما إلى ماخذ كهربائي أو بطارية تعمل بالطاقة ، لذلك إذا كان هناك أخذ عينات ميدانيه لفترات طويلة ، يجب ان يكون هناك مصدر طاقة لشحن البطاريات عندما لا يكون الجهاز قيد الاستخدام.
وتسمح الأساليب هنا بأخذ عينات غير مدمره في الموقع ، مع أخذ عينات سريعة ومتكررة ووقت أخذ العينات بسرعة أكبر بكثير. في حين ان بعض الدراسات العطر الازهار تتطلب العطر ليتم جمعها لمده 2-3 ساعة لعينه واحده ، يمكن للطريقة المعروضة بدقه جمع متطاير في حوالي 10 دقيقه بسبب جمع المواد (مساميه البوليمر الممتزه) المستخدمة في الزجاج تصفيه.
هذه الطرق جمع توفر وسيله لتذوق بسرعة وأمان العطر التي تنتجها الزهور ، دون تدمير أو إلحاق الضرر زهره. مع الكثير من الزهور ، وخاصه تلك الموجودة في الاسره اوردوزيه، ويجري تصنيفها علي انها مهدده أو مهدده بالانقراض ، وتحليل العطور التي تنتج بطريقه غير مدمره أمر بالغ الاهميه كما يتم العمل علي فهم بيولوجيا التلقيح. ويمكن استخدام المعلومات المكتسبة من هذه الدراسات لتعزيز التلقيح باستخدام يمزج الاصطناعية علي أساس المواد الكيميائية الذروة وجدت لجذب المزيد من الملقحات إلى المناطق مع بساتين الفاكهة تزهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
[وزاره الزراعة]-[أرس] بحث رقم [6036-22000-028-د]. استخدام أسماء التجارة أو الشركات أو الشركات في هذا المنشور هو لمعلومات وراحة القارئ. ولا يشكل هذا الاستخدام تاييدا رسميا أو موافقه من وزاره الزراعة في الولايات المتحدة أو دائره البحوث الزراعية علي اي منتج أو خدمه باستثناء الآخرين الذين قد يكونون مناسبين. بالاضافه إلى ذلك ، قدمت جامعه فلوريدا قسم البيولوجيا-لويس وفيرينا فون زمالة في علم الاحياء الاوركيد (2017) ، وجامعه فلوريدا زمالة بحوث الدراسات العليا (2014-2018) التمويل أيضا. كما نشكر سيندي بينينجتون من جامعه ستانسون لمصنع الاوركيد المستخدم اثناء تصوير هذا الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
