Summary
Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van de bloemige geur vluchtige stoffen uit bloeiende bloemen, met behulp van een niet-destructieve bemonsteringsprocedure.
Abstract
Geuren van veel bloemen families zijn bemonsterd en de vluchtige stoffen geanalyseerd. Het kennen van de verbindingen waaruit de geuren bestaan kan een belangrijke stap zijn voor het behoud van bloemen die bedreigd of bedreigd zijn. Omdat florale geur cruciaal is voor het aantrekken van bestuivers, kan deze methode worden gebruikt om de bestuiving beter te begrijpen of zelfs te verbeteren. We presenteren een protocol met behulp van een draagbare houtskool luchtfilter en vacuüm voor het verzamelen van bloemengeur volatiles, die vervolgens worden geanalyseerd door een GC-MS. Door deze methode te gebruiken, kunnen geur volatikels worden bemonsterd met behulp van een niet-destructieve methode met een machine die gemakkelijk kan worden vervoerd. Deze methodologie maakt gebruik van een snelle bemonsteringprocedure, snijden bemonstering tijd omlaag van 2-3 uur tot ongeveer 10 minuten. Met behulp van GC-MS kunnen de geurstoffen individueel worden geïdentificeerd, op basis van authentieke normen. De stappen die worden gebruikt voor het verzamelen van geur-en controlegegevens worden weergegeven, van materiaalinstellingen tot het verzamelen van de gegevensuitvoer.
Introduction
Bloemen produceren meestal een geur die wordt gebruikt om bestuivers aan te trekken. Deze geuren bestaan uit vele chemische verbindingen die allemaal samen fungeren als een bloemige Blend1,2,3. Zonder deze geuren zouden bloemen minder snel hun genetische informatie doorgeven met bestuivers. Florale geur is gedocumenteerd in veel bloeiende plantenfamilies, met Orchidaceae als een van de meest voorkomende families bestudeerd4. Om de rol van florale geur in bestuiving te begrijpen, is het belangrijk om de chemische verbindingen die uit de bloemen op verschillende tijdstippen van de dag worden uitgezonden, niet destructief te verzamelen en te analyseren en gedurende de enkele dagen tot weken zijn de bloemen bloeiers open, omdat geur kan variëren in de tijd5.
Een vroeg protocol voor dit soort monstername werd ontwikkeld door Heath en Manukian6. Het doel van hun bemonsteringsmethoden was om de stress op het preparaat (bijv. planten, insecten) te verminderen. In eerdere papers werd gedocumenteerd dat destructieve procedures voor de plant nodig waren, zoals het verwijderen van bloeiende bloemen om de geur te verzamelen. Meer recente florale geur publicaties van cancino en Damon7,8 gebruikten vergelijkbare methoden. Deze studie zette de bloemen in glazen kamers en gaf gezuiverde lucht over hen; vervolgens werden geurstoffen uit de kamer geabsorbeerd op poreuze polymeer adsorbenten in heldere Pasteur-pipetten. De geuren werden gedurende ten minste twee uur verzameld tijdens deze studie. Sadler et al.9 heeft florale geur studies uitgevoerd op een epifytische orchidee in Zuid-Florida, net als de originele studie10. Nogmaals, deze studie vereist dat de bloemen worden bemonsterd voor meer dan twee uur om de geur vluchtige stof te verzamelen, met geur verzameld op de poreuze polymeer adsorbens. Het papier bevat hier een niet-destructieve methode die een veel snellere bemonstering mogelijk maakt, die slechts 10 minuten duurt. Ook, in plaats van het gebruik van een glazen kamer oven bakken zakken worden gebruikt, die zorgen voor meer flexibele beweging van de kamer en de kans op schade aan de bloemen te verminderen. Deze tassen zijn er in verschillende maten waardoor de optie om de grootte van de zak die gemakkelijk zal passen individuele monsters zonder beschadiging van het monster of het omringende materiaal te selecteren. Het adsorbens gebruikt in deze studie was Tenax poreus polymeer Adsorbens. Dit verschilt van Porapak, omdat het monster thermisch kan worden gedesorverd op de GC-MS-kolom voor analyse, waardoor het gebruik van een chemisch oplosmiddel wordt geëlimineerd.
De methoden in deze studie bieden een manier om snel geuren van geur vluchtige stoffen geproduceerd door bloemen te proeven en kunnen worden gebruikt om vluchtige monsters van andere specimens te proeven, zoals insecten feromonen of champignon-vluchtige stoffen. De kortere bemonsteringstijd betekent dat er minder stress is op het monster en dat er in korte tijd veel monsters kunnen worden verzameld. Bijvoorbeeld, in Sadler et al.9, de bloem was alleen geurige 's nachts, dus slechts twee of drie monsters kunnen worden verzameld elke nacht. Met de methode hier, monsters kunnen worden genomen de hele nacht op 15-20-minuten intervallen van dezelfde bloem. Door het gebruik van zakken in plaats van glazen kamers kan de headspace bovendien gemakkelijker worden gesuspendeerd voor bemonstering in het veld voor in-situ inzameling van bedreigde of bedreigde plantensoorten. Met behulp van de hier gepresenteerde methode, waren we in staat om te proeven van bloemen 1,5 tot 2 meter boven de grond. Deze methoden zijn ongelooflijk nuttig voor het verzamelen van geuren in het laboratorium en het veld, en biedt onderzoekers een bemonsteringstechniek die snel en niet-destructief is voor het monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: parfums of geurende lotions en producten mogen tijdens geen van deze procedures worden gedragen.
1. bloem selectie
Opmerking: bloemen die worden gebruikt, kunnen natuurlijk in het milieu groeien of onder kunstmatige omgevingsomstandigheden worden gehouden. Temperatuur, vochtigheid en lichtniveau tijdens het verzamelen kan variëren afhankelijk van de specifieke bloemsoorten die worden gebruikt, en welk type gegevens worden verzameld. Er zijn bijvoorbeeld gegevens verzameld overdag en 's nachts voor dezelfde bloem om te bepalen of de geur varieert in de tijd van de dag, en verzameld van zowel in situ als broeikas bloemen.
- Selecteer een bloem die in eerste instantie ongeopend is om de tijd voor het verzamelen van monsters te standaardiseren. Deze regeling voor een bloem veranderende geur na verloop van tijd.
- Afhankelijk van de duur van de bloeitijd, indien mogelijk, wacht u ten minste 24 uur na de bloei om het monster te verzamelen, waarbij u een standaardtijd voor alle monsters instelt.
- Als er meerdere bloeiende bloemen op een plant, Markeer degene die zal worden gebruikt met het markeren van tape of iets dergelijks te zorgen voor herhaalde bemonstering van dezelfde bloem.
2. materiaal voorbereiding
- Gebruik oven zakken (ongeveer 40,5 cm × 44,5 cm) en gegolfde PTFE-slang.
- In eerste instantie, kook de oven zakken in water gedurende ~ 30 min om rest kunststof verbindingen te verwijderen. Om te drogen, bakken in een oven bij 175 °C.
- Zodra de zakken zijn gedroogd, voeg een polypropyleen schot Unie toe aan elke hoek van het gesloten uiteinde van de oven zakken. Deze bevestigingen maken aansluiting van buizen mogelijk om houtskool gefilterde lucht in te duwen en de geur uit de headspace te halen.
- Spoel alle tassen en buizen af met 75% ethanol. Laat beide lucht drogen na het spoelen.
- Nadat de oven zakken zijn gedroogd, bakken zakken en buizen in een oven bij laag vuur, ongeveer 74-85 °C gedurende 30 minuten.
3. vluchtige inzameling
Opmerking: steriele neopreen handschoenen moeten tijdens dit proces worden gedragen, omdat het contact met de zak of filter cartridges de monsters kan verontreinigen.
- Bedek de geselecteerde bloem met een gebakken oven tas. Steek de tas strak samen met een plastic ritssluiting onder de bloem om ongewenste luchtstroom in de zak te voorkomen.
- Bevestig een buis van de luchtuitlaat van de inzamel apparatuur en sluit deze aan op een van de schotten op de oven zak.
- Bevestig op de andere schottendek-Unie een glazen filterpatroon met poreus polymeer adsorbens.
- Bevestig een tweede buis aan de inzamel apparatuur op de vacuüm ingang. Sluit het uiteinde van de tweede buis aan op de glasvolatile Collection filter cartridge.
- Schakel zowel de luchtpomp als de vacuüm op dezelfde tijd in op ~ 0,05 L/min. De hoofdruimte rond de bloem vult met lucht, maar wordt niet overopgeblazen. Het systeem trekt lucht uit de zak door het filter, het vangen van de bloemen volatiles.
- Laat de machine 10 minuten draaien en schakel vervolgens zowel de luchtpomp als het vacuüm uit.
Opmerking: bloemsoorten die een kleinere hoeveelheid geur produceren/uitstoten, moeten mogelijk voor een langere periode worden bemonsterd. - Demonteer de buizen en het glas filterpatroon. Plaats het filter in een glazen injectieflacon met een schroefdop. Zodra de dop is ingeschakeld, verzegelen de injectieflacon met PTFE pijp draad tape.
- Bewaar de monsters in een vriezer tot ze worden geanalyseerd met GC-MS.
- Herhaal dit proces met een schone oven zak en glas filter, dit keer met een lege oven zak, om een blanco lucht monster als controle te verzamelen. Dit maakt het mogelijk om eventuele achtergrond vluchtige stoffen verzameld worden geïdentificeerd.
Opmerking: herhalende monsterverzameling moet elke dag op ongeveer hetzelfde tijdstip worden uitgevoerd, omdat sommige bloemen in de loop van een dag wisselende geur niveaus produceren.
4. GC-MS
- Verwijder de glas filter cartridge uit de vriezer en plaats deze in een GC-MS in de injector poort.
- Verlos headspace-vluchtige vloeistof verzameld op poreus polymeer adsorbens van het adsorbens door verwarming in de thermische opvangval (TCT) tot 220 °C gedurende 8 minuten binnen een stroom van helium gas (snelheid: 1,2 mL/min).
- Verzamel desorbedverbindingen in de TCT Cold trap unit bij-130 °C. De temperatuur van de koude trap wordt gereguleerd door het GC-MS-programma.
- Flash Verwarm de TCT Cold trap-eenheid om de verbindingen te injecteren in de capillaire kolom van de gaschromatograaf waaraan de TCT Cold trap-eenheid was aangesloten. De methode voor de TCT begint bij-20 °C en eindigt bij 150 °C.
- Program meer de GC-MS van 40 °C tot 280 °C bij 15 °C/min, met een hold van 5 min bij 40 °C.
5. gegevensanalyse
- Vergelijk voor identificatie de massa spectra van het monster met die van Mass Spectra libraries (NIST en Department of Chemical Ecology, Goteborg University, Zweden11), evenals de retentietijden van de vluchtige stoffen tot tijden van authentieke samengestelde normen12.
- Vergelijk chromatogrammen van verzamelde vluchtige handelingen om gemeenschappelijke terugkerende pieken te identificeren.
- Na het identificeren van de piek volatiliteiten, gebruik Pherobase (online database van semiochemicals en feromonen) om te bepalen of ze eerder zijn beschreven in florale geuren10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve gegevens van de GC-MS worden weergegeven als een chromatogram in Figuur 1. Naast het chromatogram wordt ook een gegevensbestand met resultaten verstrekt (aanvullend bestand 1). Dit gegevensbestand biedt de retentietijd voor elke piek (RT) en een identificatie van welke verbinding die piek is (bibliotheek/ID). Pieken tussen 10:00 en 15:00 minuten zijn bloemen volatiles, als gevolg van het molecuulgewicht van de verbindingen10. De getallen boven de pieken betekenen de retentietijden van de geïdentificeerde verbindingen waarnaar het gegevensbestand van de resultaten wordt verwezen (aanvullend bestand 1). Door het chromatogram en het gegevensbestand voor elk parfum monster te verkrijgen, kunnen de verbindingen worden vergeleken en de stoffen die voor elk bloem monster opnieuw optreden, worden geïdentificeerd. Verzamelingen kunnen worden geïdentificeerd vanuit dit document onder de categorie "monster", vernoemd naar de bloem bemonsterde, en de tijd en datum van de collectie (voorbeeld: UF1 8AM 03/16/15). Pagina 1 van dit document toont ook de identificatie van specifieke verbindingen geïdentificeerd uit het monster (LibraryID), welke piek retentietijd uit Figuur 1 de compound correspondeert met (PK #), en het percentage van de totale geur die elke vluchtige bestaat (gebied%). Alle verzamelde vluchtige stoffen vermeld onder "bibliotheek/id" kan worden verwezen in pherobase om te bepalen of ze eerder hebben beschreven in een florale geur. Bijvoorbeeld, in het aanvullende bestand 1, samengestelde #21, met een retentietijd (RT) van 10,311 is geïdentificeerd als benzaldehyde. In toekomstige monsters, als benzaldehyde aanwezig is, kan worden verwezen op Pherobase om te bepalen of het een waarschijnlijke bloem samengestelde voor de bloem. In Figuur 2werd benzaldehyde gezocht op Pherobase. Zodra een verbinding is geselecteerd, toont de pagina een lijst van alle bloemsoorten, georganiseerd door Plantenfamilie, waaruit die geurstof is geïdentificeerd. Gemarkeerd in de rechterbenedenhoek van Figuur 2 is een kleine subset van de orchideeën soort (Orchidaceae) waaruit benzaldehyde is vastbesloten om aanwezig te zijn in de bloemige geur.
Figuur 1: GC-MS vluchtige piek resultaten. Grafische resultaten die de piek vluchtige stoffen van het bloemige geur monster aantonen. Getallen boven de pieken komen overeen met een lijst van alle verzamelde vluchtige stoffen, waarbij de piek wordt geïdentificeerd aan de specifieke vluchtige. Pieken tussen 10:00 en 15:00 minuten zijn het meest waarschijnlijk vluchtige stoffen van een florale geur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Pherobase voorbeeld resultaten. Een voorbeeld van resultaten van een Pherobase zoektocht naar een geurstof. In dit figuur werd benzaldehyde doorzocht, en de resultaten tonen een lijst van alle bloemsoorten waaruit deze geur is geïdentificeerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1: resultaten gegevens. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel deze techniek ongelooflijk waardevol is voor de Samplingsnelheid en draagbaarheid, gebruikt een beperking het voor epifytische soorten, of die op bomen groeien en niet vanaf de grond. In de originele studie10was een van de gesamplede bloemen epifytisch. Omdat de machine te zwaar is om vrij te hangen, moet een stabiele, verhoogde basis worden gemaakt voor bemonstering. Bovendien kan de machine ofwel worden aangesloten op een stopcontact of op batterijen, dus als er een langdurige veld bemonstering is, moet er een stroombron zijn om de batterijen op te laden wanneer de machine niet in gebruik is.
De methoden hier zorgen voor een in situ niet-destructieve bemonstering, met snelle herhaalde bemonstering en een veel snellere bemonsteringstijd. Terwijl sommige florale geur studies vereisen dat de geur gedurende 2-3 uur wordt verzameld voor één monster, kan de gepresenteerde methode de vluchtige stoffen nauwkeurig verzamelen in ongeveer 10 minuten als gevolg van het Verzamel materiaal (poreus polymeer adsorbens) dat in het glas wordt gebruikt Filter.
Deze inzamelings methodes bieden een manier om de geur van bloemen snel en veilig te proeven, zonder de bloem te vernietigen of te schaden. Met zoveel bloemen, vooral die in de onderfamilie Orchidaceae, die worden gecategoriseerd als bedreigd of bedreigd, is het kritisch om de geuren te analyseren die ze op niet-destructieve wijze produceren, omdat er werk wordt verricht om hun bestuiving biologie te begrijpen. De informatie verkregen uit deze studies kan potentieel worden gebruikt om de bestuiving te stimuleren met behulp van synthetische mengsels op basis van piek chemicaliën gevonden om meer bestuivers aan gebieden met bloeiende orchideeën aan te trekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
USDA-ARS Research Project nummer 6036-22000-028-00D. Het gebruik van handels-, firma-of corporatie namen in deze publicatie is voor de informatie en het gemak van de lezer. Een dergelijk gebruik vormt geen officiële bekrachtiging of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van landbouw of de Landbouwonderzoekdienst van een product of dienst met uitsluiting van andere producten die geschikt kunnen zijn. Daarnaast financierde de Universiteit van Florida biologie Department-Lewis en Varina Vaughn Fellowship in Orchid Biology (2017), en een University of Florida Graduate Research Fellowship (2014-2018) ook financiering. We danken ook Cindy Bennington van Stetson University voor de orchideeën plant die tijdens het filmen van deze video werd gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
