Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Sammeln der blumigen Duftflüchtige aus blühenden Blüten, mit einem zerstörungsfreien Probenahmeverfahren.
Abstract
Düfte vieler Blumenfamilien wurden beprobt und die Flüchtigen analysiert. Das Wissen um die Verbindungen, aus denen die Düfte bestehen, kann ein wichtiger Schritt zur Erhaltung bedrohter oder gefährdeter Blüten sein. Da Blumenduft ist entscheidend für die Anziehung von Bestäubern, Diese Methode könnte verwendet werden, um besser zu verstehen oder sogar die Bestäubung zu verbessern. Wir präsentieren ein Protokoll mit einem tragbaren Kohleluftfilter und Vakuum, um florale Duftflüchtige zu sammeln, die dann von einem GC-MS analysiert werden. Mit dieser Methode können Duftflüchtige mit einer zerstörungsfreien Methode mit einer Maschine, die leicht transportiert werden kann, beprobt werden. Diese Methode verwendet ein schnelles Probenahmeverfahren, bei dem die Probenahmezeit von 2-3 Stunden auf etwa 10 Minuten verkürzt wird. Mit GC-MS können die Duftstoffe individuell identifiziert werden, basierend auf authentischen Standards. Die Schritte zum Sammeln von Duft- und Steuerdaten werden dargestellt, vom Materialaufbau bis zum Sammeln der Datenausgabe.
Introduction
Blumen produzieren in der Regel einen Duft verwendet, um Bestäuber anzuziehen. Diese Düfte bestehen aus vielen chemischen Verbindungen, die alle zusammen als florale Mischung1,2,3. Ohne diese Düfte würden Blumen ihre genetischen Informationen seltener mit Bestäubern weitergeben. Floral Duft wurde in vielen blühenden Pflanzenfamilien dokumentiert, mit Orchidaceae ist eine der häufigsten Familien untersucht4. Um die Rolle des Blumendufts bei der Bestäubung zu verstehen, ist es wichtig, die chemischen Verbindungen, die von den Blüten zu verschiedenen Tageszeiten emittiert werden, und während der verschiedenen Tage bis Wochen die Blüten geöffnet sind, da der Duft im Laufe der Zeit variieren kann5.
Ein frühes Protokoll für diese Art der Probenahme wurde von Heath und Manukian6entwickelt. Ziel ihrer Probenahmemethoden war es, die Belastung der untersuchten Probe (z. B. Pflanzen, Insekten) zu verringern. Frühere Papiere dokumentierten, dass zerstörerische Verfahren an der Pflanze erforderlich waren, wie das Entfernen blühender Blumen, um den Duft zu sammeln. Neuere Blumenduft-Publikationen von Cancino und Damon7,8 verwendeten ähnliche Methoden. Diese Studie legte die Blumen in Glaskammern und übergab gereinigte Luft über sie; dann wurden Duftstoffe aus der Kammer auf poröse Polymeradsorbentien in klaren Pasteurpipetten absorbiert. Die Düfte wurden während dieser Studie für mindestens zwei Stunden gesammelt. Sadler et al.9 führten blumenflorale Duftstudien an einer epiphytischen Orchidee in Südflorida durch, ähnlich wie die ursprüngliche Studie10. Auch in dieser Studie mussten die Blüten über zwei Stunden lang beprobt werden, um den Duft flüchtig zu sammeln, wobei der Duft auf dem porösen Polymeradsorbent gesammelt wurde. Das Papier hier präsentiert eine zerstörungsfreie Methode, die eine viel schnellere Probenahme ermöglicht, die nur 10 Minuten dauert. Anstelle eines Glaskammerofens werden Auch Backbeutel verwendet, die eine flexiblere Bewegung der Kammer ermöglichen und die Wahrscheinlichkeit von Schäden an den Blüten verringern. Diese Beutel sind in verschiedenen Größen erhältlich, so dass die Option, die Größe des Beutels zu wählen, die leicht einzelne Proben passen, ohne die Probe oder das umgebende Material zu beschädigen. Das in dieser Studie verwendete Adsorbentwart war Tenax Porous Polymer Adsorbent. Dies unterscheidet sich von Porapak, da die Probe zur Analyse thermisch auf die GC-MS-Säule eingespeist werden kann, wodurch die Verwendung eines chemischen Lösungsmittels vermieden wird.
Die Methoden in dieser Studie bieten eine Möglichkeit, schnell Duftflüchtige, die von Blumen produziert werden, zu proben und könnten auch zur Probe von Flüchtigen von anderen Proben wie Insektenpheromone oder Pilzflüchtigen verwendet werden. Die verkürzte Probenahmezeit bedeutet, dass die Probe weniger belastet wird und viele Proben in kurzer Zeit entnommen werden können. Zum Beispiel, in Sadler et al.9, die Blume war nur duftend in der Nacht, so dass nur zwei oder drei Proben pro Nacht gesammelt werden konnte. Mit der Methode hier konnten die ganze Nacht proben in 15-20-Minuten-Intervallen von der gleichen Blume genommen werden. Darüber hinaus kann durch die Verwendung von Säcken anstelle von Glaskammern der Kopfraum leichter für die Probenahme im Feld für die In-situ-Sammlung an gefährdeten oder bedrohten Pflanzenarten aufgehängt werden. Mit der hier vorgestellten Methode konnten wir 1,5 bis 2 Meter über dem Boden Blühen proben. Diese Methoden sind unglaublich nützlich für die Duftsammlung im Labor und auf dem Feld und bieten Forschern eine Probenahmetechnik, die schnell und zerstörungsfrei für die Probe ist.
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Protocol
HINWEIS: Parfüms oder duftende Lotionen und Produkte dürfen während eines dieser Verfahren nicht getragen werden.
1. Blumenauswahl
HINWEIS: Die verwendeten Blumen können entweder natürlich in der Umwelt angebaut oder unter künstlichen Umweltbedingungen gehalten werden. Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lichtpegel während der Sammlung können je nach verwendeter Blumenart und welcher Art von Daten gesammelt werden können. Zum Beispiel wurden Daten während des Tages und in der Nacht für die gleiche Blume gesammelt, um festzustellen, ob der Duft im Laufe der Tageszeit variiert, und sowohl von In-situ- als auch von Gewächshausblumen gesammelt wurden.
- Wählen Sie eine Blume aus, die zunächst ungeöffnet ist, um die Probenentnahmezeit zu standardisieren. Dies steuert für einen Blumenwechsel Duft im Laufe der Zeit.
- Je nach Dauer der Blütezeit, wenn möglich, warten Sie mindestens 24 Stunden nach der Blüte, um die Probe zu sammeln, und legen Sie eine Standardzeit für alle Proben fest.
- Wenn es mehrere blühende Blüten auf einer Pflanze gibt, markieren Sie die, die mit Flagging Tape oder etwas ähnliches verwendet wird, um eine wiederholte Probenahme der gleichen Blume zu gewährleisten.
2. Materialaufbereitung
- Verwenden Sie Ofenbeutel (ca. 40,5 cm x 44,5 cm) und gewellte PTFE-Schläuche.
- Zunächst kochen Ofenbeutel in Wasser für 30 min, um Reste von Kunststoffverbindungen zu entfernen. Zum Trocknen im Ofen bei 175 °C backen.
- Sobald die Säcke getrocknet sind, fügen Sie eine Polypropylen-Schott-Union zu jeder Ecke des geschlossenen Endes der Ofenbeutel hinzu. Diese Befestigungen ermöglichen den Anschluss von Rohren, um holzkohlegefilterte Luft einzustoßen und Duft aus dem Kopfraum zu ziehen.
- Spülen Sie alle Beutel und Schläuche mit 75% Ethanol. Lassen Sie beide Luft nach dem Spülen trocknen.
- Nachdem die Ofenbeutel getrocknet sind, Backen Sie Säcke und Schläuche im Ofen bei geringer Hitze, ca. 74-85 °C für 30 min.
3. Flüchtige Sammlung
HINWEIS: Sterile Neoprenhandschuhe müssen während dieses Vorgangs getragen werden, da die Berührung mit der Tasche oder Filterpatronen die Proben verunreinigen kann.
- Bedecken Sie die ausgewählte Blume mit einem Backbacksack. Cinch die Tasche zusammen mit einem Kunststoff-Reißverschluss Krawatte unter der Blume, um unerwünschteLuftstrom in die Tasche zu verhindern.
- Befestigen Sie ein Rohr aus dem Luftauslass des Entnahmegeräts und schließen Sie es an eine der Schottverbände auf dem Ofenbeutel an.
- Befestigen Sie auf der anderen Schott-Union eine Glasfilterpatrone, die poröses Polymeradsorbieren enthält.
- Befestigen Sie ein zweites Rohr an der Sammeleinrichtung am Vakuumeingang. Schließen Sie das Ende des zweiten Rohres an die glasflüchtige Sammelfilterpatrone an.
- Schalten Sie sowohl die Luftpumpe als auch das Vakuum gleichzeitig auf 0,05 l/min. Der Kopfraum um die Blume wird mit Luft füllen, aber nicht überhöht werden. Das System zieht Luft aus dem Beutel durch den Filter und fängt die floralen Flüchtigen ein.
- Lassen Sie die Maschine 10 min laufen und schalten Sie dann sowohl die Luftpumpe als auch das Vakuum aus.
HINWEIS: Blumenarten, die eine geringere Menge an Duft erzeugen/emittieren, müssen möglicherweise über einen längeren Zeitraum beprobt werden. - Zerlegen Sie die Rohre und die Glasfilterpatrone. Den Filter in eine Glasflasche mit einer Schraubkappe legen. Sobald die Kappe eingeschaltet ist, versiegeln Sie die Durchstechflasche mit PTFE-Rohrgewindeband.
- Speichern Sie Proben in einem Gefrierschrank, bis sie mit GC-MS analysiert werden.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem sauberen Ofenbeutel und Glasfilter, diesmal mit einem leeren Ofenbeutel, um eine leere Luftprobe als Kontrolle zu sammeln. Auf diese Weise können alle gesammelten Hintergrundflüchtige identifiziert werden.
HINWEIS: Die wiederholte Probenentnahme muss jeden Tag ungefähr zur gleichen Zeit erfolgen, da einige Blumen im Laufe eines Tages unterschiedliche Duftwerte erzeugen.
4. GC-MS
- Entfernen Sie die Glasfilterpatrone aus dem Gefrierschrank und legen Sie sie in einen GC-MS im Injektoranschluss.
- Freisetzung von Headspace-Flüchtigen, die auf porösem Polymeradsorbentien aus dem Adsorbens durch Erhitzen in der thermischen Sammelfalle (TCT) auf 220 °C für 8 min in einem Heliumgasstrom gesammelt werden (Geschwindigkeit: 1,2 ml/min).
- Sammeln Sie desorbed Verbindungen in der TCT-Kältefalle bei -130 °C. Die Kaltfallentemperatur wird durch das GC-MS-Programm reguliert.
- Blitzerwärmen Sie die TCT-Kältefalle, um die Verbindungen in die Kapillarsäule des Gaschromatographen zu injizieren, an den die TCT-Kältefalle angeschlossen war. Das Verfahren für den TCT beginnt bei -20 °C und endet bei 150 °C.
- Programmieren Sie den GC-MS von 40 °C auf 280 °C bei 15 °C/min, mit einem Haltegriff von 5 min bei 40 °C.
5. Datenanalyse
- Zur Identifizierung vergleichen Sie die Massenspektren der Probe mit denen aus Massenspektrenbibliotheken (NIST und Abteilung für Chemische Ökologie, Universität Göteborg, Schweden11), sowie Retentionszeiten der flüchtigen Stoffe mit Zeiten authentischer Zusammengesetzter Standards12.
- Vergleichen Sie Chromatogramme gesammelter Flüchtiger, um häufig wiederkehrende Spitzen zu identifizieren.
- Nach der Identifizierung der Spitzenflüchtige, verwenden Sie Pherobase (Online-Datenbank von Semiochemikalien und Pheromone), um festzustellen, ob sie zuvor in floralen Düften beschrieben wurden10.
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Representative Results
Repräsentative Daten aus dem GC-MS werden in Abbildung 1als Chromatogramm dargestellt. Neben dem Chromatogramm wird auch eine Datendatei mit Ergebnissen zur Verfügung gestellt (Zusatzdatei 1). Diese Datendatei bietet die Aufbewahrungszeit für jeden Peak (RT) und eine Identifizierung der Verbindung, die dieser Peak ist (Bibliothek/ID). Spitzen zwischen 10:00 und 15:00 Minuten sind florale flüchtige Stoffe, aufgrund des Molekulargewichts der Verbindungen10. Die Zahlen über den Spitzen stellen die Retentionszeiten der identifizierten Verbindungen dar, auf die die Datendatei der Ergebnisse verweist (Ergänzende Datei 1). Durch die Beschaffung des Chromatogramms und der Datendatei für jede Duftprobe können die Verbindungen verglichen und diejenigen identifiziert werden, die für jede Blütenprobe wiederkehren. Sammlungen können aus diesem Dokument unter der Kategorie "Beispiel" identifiziert werden, die benannt ist, um die gesampelte Blume darzustellen, sowie die Uhrzeit und das Datum der Sammlung (Beispiel: UF1 8AM 03/16/15). Seite 1 dieses Dokuments zeigt auch die Identifizierung spezifischer Verbindungen, die aus der Probe (LibraryID) identifiziert wurden, deren Maximale Retentionszeit aus Abbildung 1 der Verbindung entspricht (Pka), und den Prozentsatz des Gesamtdufts, den jeder flüchtige Stoff umfasst (Fläche %). Alle gesammelten flüchtigen Stoffe, die unter "Bibliothek/ID" aufgeführt sind, können in Pherobase referenziert werden, um festzustellen, ob sie zuvor in einem floralen Duft beschrieben wurden. In der Zusatzdatei 1wurde z. B. eine zusammengesetzte #21 mit einer Retentionszeit (RT) von 10.311 als Benzaldehyd identifiziert. In zukünftigen Proben, wenn Benzaldehyd vorhanden ist, kann es auf Pherobase referenziert werden, um festzustellen, ob es eine wahrscheinliche florale Verbindung für die Blume ist. In Abbildung 2wurde Benzaldehyd auf Pherobase durchsucht. Sobald eine Verbindung ausgewählt wurde, zeigt die Seite eine Liste aller Blumenarten, organisiert nach Pflanzenfamilie, aus der diese Duftverbindung identifiziert wurde. Hervorgehoben in der unteren rechten Ecke von Abbildung 2 ist eine kleine Teilmenge der Orchideenart (Orchidaceae), von der Benzaldehyd bestimmt wurde, um im floralen Duft vorhanden zu sein.
Abbildung 1: GC-MS flüchtige Spitzenergebnisse. Grafische Ergebnisse, die die Spitzenflüchtigen der floralen Duftprobe zeigen. Zahlen über den Spitzen entsprechen einer Liste aller gesammelten flüchtigen Verbindungen, die den Peak zum spezifischen flüchtigen identifiziert. Spitzen zwischen 10:00 und 15:00 Minuten sind am ehesten flüchtige Stoffe aus einem blumigen Duft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Pherobase-Beispielergebnisse. Ein Beispiel für Ergebnisse einer Pherobase-Suche nach einer Duftverbindung. In dieser Abbildung wurde Benzaldehyd durchsucht, und die Ergebnisse zeigen eine Liste aller Blütenarten, aus denen dieser Duft identifiziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1: Ergebnisdaten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
Obwohl diese Technik unglaublich wertvoll für seine Probenahmegeschwindigkeit und Portabilität ist, ist eine Einschränkung, es für epiphytische Arten zu verwenden, oder diejenigen, die auf Bäumen und nicht vom Boden wachsen. In der ursprünglichen Studie10war eine der beprobten Blüten epiphytisch. Da die Maschine zu schwer ist, um frei zu hängen, muss eine stabile, erhöhte Basis für die Probenahme gemacht werden. Darüber hinaus kann die Maschine entweder an eine Steckdose angeschlossen oder mit Batterie betrieben werden, so dass bei längerer Feldentnahme eine Stromquelle vorhanden sein muss, um die Batterien aufzuladen, wenn das Gerät nicht in Betrieb ist.
Die hier angewandten Methoden ermöglichen eine in situ zerstörungsfreie Probenahme mit schneller wiederholter Probenahme und einer wesentlich schnelleren Probenahmezeit. Während einige florale Duftstudien verlangen, dass der Duft für 2-3 Stunden für eine Probe gesammelt werden, kann die vorgestellte Methode die flüchtigen Stoffe in ca. 10 min genau sammeln, da das im Glas verwendete Sammelmaterial (poröses Polymeradsorbens) Filter.
Diese Sammelmethoden bieten eine Möglichkeit, den von Blumen erzeugten Duft schnell und sicher zu beproben, ohne die Blume zu zerstören oder zu schädigen. Bei so vielen Blumen, vor allem in der Familie Orchidaceae, als bedroht oder gefährdet kategorisiert, die Analyse der Düfte, die sie auf zerstörungsfreie Weise produzieren, ist entscheidend, da die Arbeit durchgeführt wird, um ihre Bestäubungsbiologie zu verstehen. Die Informationen aus diesen Studien gewonnen könnte potenziell verwendet werden, um Bestäubung mit synthetischen Mischungen auf der Grundlage von Spitzenchemikalien gefunden, um mehr Bestäuber zu gewinnen, um Bereiche mit blühenden Orchideen zu steigern.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
USDA-ARS Forschungsprojekt Nummer 6036-22000-028-00D. Die Verwendung von Handels-, Firmen- oder Unternehmensnamen in dieser Publikation dient der Information und Bequemlichkeit des Lesers. Eine solche Verwendung stellt keine offizielle Billigung oder Genehmigung eines Produkts oder einer Dienstleistung durch das Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten oder den Agriculture Research Service dar, mit Ausnahme anderer, die geeignet sein könnten. Darüber hinaus stellten das University of Florida Biology Department-Lewis und Varina Vaughn Fellowship in Orchid Biology (2017) sowie ein University of Florida Graduate Research Fellowship (2014-2018) ebenfalls Fördermittel zur Verfügung. Wir danken auch Cindy Bennington von der Stetson University für die Orchideenpflanze, die während der Dreharbeiten zu diesem Video verwendet wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
