Coleção rápida de voláteis florais da fragrância usando uma técnica da coleção do volatile do Headspace para a amostragem térmica da desorção de GC-MS

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para coletar os voláteis de fragrâncias florais de flores florescendo, usando um procedimento de amostragem não destrutivo.

Abstract

As fragrâncias de muitas famílias da flor foram amostradas e os temporários analisados. Conhecer os compostos que compõem as fragrâncias pode ser um passo importante para a conservação de flores que estão ameaçadas ou ameaçadas de extinção. Porque a fragrância floral é crítica para atrair polinizadores, este método poderia ser usado para compreender melhor ou realçar a polinização. Apresentamos um protocolo usando um filtro portátil de ar a carvão e vácuo para coletar voláteis de fragrâncias florais, que são então analisados por um GC-MS. Usando este método, os voláteis da fragrância podem ser amostrados usando um método não destrutivo com uma máquina que seja transportada facilmente. Esta metodologia utiliza um procedimento de amostragem rápida, reduzindo o tempo de amostragem de 2-3 horas para aproximadamente 10 minutos. Usando GC-MS, os compostos de fragrância saem podem ser identificados individualmente, com base em padrões autênticos. As etapas utilizadas para a coleta de dados de fragrâncias e controle são apresentadas, desde a configuração de material até a coleta da saída de dados.

Introduction

As flores produzem tipicamente uma fragrância usada para atrair polinizadores. Estas fragrâncias são compostas de muitos compostos químicos todos agindo juntos como uma mistura floral^1,2,3. Sem estas fragrâncias, as flores seriam menos prováveis passar sobre sua informação genética usando polinizadores. A fragrância floral foi documentada em muitas famílias de plantas com flores, com orchidaceae sendo uma das famílias mais comuns estudadas^4. Para compreender o papel da fragrância floral na polinização, é importante coletar e analisar nondestructively os compostos químicos que estão sendo emitidos das flores em horas diferentes do dia e durante os diversos dias às semanas as flores da flor estão abertas, porque a fragrância pode variar sobre o tempo^5.

Um protocolo inicial para este tipo de amostragem foi desenvolvido por Heath e Manukian⁶. O objetivo de seus métodos de amostragem era reduzir o estresse no espécime (por exemplo, plantas, insetos) sendo estudados. Papéis anteriores documentaram que eram necessários procedimentos destrutivos para a planta, como a remoção de flores florescendo, a fim de coletar a fragrância. Mais recentes publicações de fragrâncias florais por Cancino e Damon^7,8 usaram métodos semelhantes. Este estudo colocou as flores em câmaras de vidro e passou o ar purificado sobre eles; em seguida, compostos de fragrâncias da câmara foram absorvidos em adsorventes de polímero porosos em pipettes Pasteur claras. As fragrâncias foram coletadas por pelo menos duas horas durante este estudo. Sadler et al.⁹ realizado estudos de fragrâncias florais sobre uma orquídea epifífila no sul da Flórida, bem como o estudo original¹⁰. Mais uma vez, este estudo exigiu que as flores fossem amostradas por mais de duas horas para coletar os voláteis da fragrância, com fragrância coletada no adsorbent de polímero poroso. O artigo aqui apresenta um método não destrutivo que permite uma amostragem muito mais rápida, com duração de apenas 10 minutos. Também, em vez de usar sacos de cozimento do forno de câmara de vidro são usados, que permitem um movimento mais flexível da câmara e reduzem as possibilidades de dano às flores. Estes sacos vêm em diversos tamanhos permitindo a opção selecionar o tamanho do saco que caberá facilmente amostras individuais sem danificar a amostra ou o material circunvizinho. O adsorventusado neste estudo foi Tenax Porous Polymer Adsorbent. Isso difere de Porapak, porque a amostra pode ser desorcada termicamente na coluna GC-MS para análise, eliminando o uso de um solvente químico.

Os métodos deste estudo fornecem uma maneira de amostra ràpida dos volatiles da fragrância produzidos por flores e poderiam ser usados para provar volatiles de outros espécimes também, tais como pheromones do inseto, ou volatiles do cogumelo. O tempo reduzido para amostragem significa que há menos estresse na amostra e a capacidade de coletar muitas amostras em um curto período de tempo. Por exemplo, em Sadler et al.⁹, a flor só era perfumada à noite, então apenas duas ou três amostras podiam ser coletadas a cada noite. Com o método aqui, as amostras poderiam ser tomadas toda a noite em intervalos de 15-20 minutos da mesma flor. Além disso, usando sacos em vez de câmaras de vidro, o headspace pode ser suspenso mais fácil para amostragem no campo para a coleta in situ em espécies de plantas ameaçadas ou ameaçadas. Usando o método apresentado aqui, pudemos provar flores 1,5 a 2 metros acima do solo. Estes métodos são incrivelmente úteis para a recolha de fragrâncias em laboratório e no campo, e proporciona aos investigadores uma técnica de amostragem que é rápida e não destrutiva para a amostra.

Protocol

NOTA: Perfumes ou loções perfumadas e produtos não devem ser usados durante qualquer um desses procedimentos.

1. Seleção de flores

NOTA: As flores usadas podem naturalmente crescer no ambiente ou mantidas condições ambientais artificiais. Temperatura, umidade e nível de luz durante a coleta podem variar com base nas espécies de flores específicas usadas e que tipo de dados está sendo coletado. Por exemplo, os dados foram coletados durante o dia e à noite para a mesma flor para determinar se a fragrância varia ao longo da hora do dia, e coletados a partir de flores in situ e estufa.

1. Selecione uma flor que é inicialmente fechada, para padronizar o tempo de coleta de amostras. Isto controla para uma fragrância em mudança da flor sobre o tempo.
2. Dependendo da duração do tempo de floração, se possível, espere pelo menos 24 horas após a floração para coletar a amostra, estabelecendo um horário padrão para todas as amostras.
3. Se há umas flores de flores de flores de florescência múltiplas em uma planta, marque essa que será usada com fita de sinalização ou algo similar para assegurar a amostragem repetida da mesma flor.

2. Preparação de material

1. Use sacos de forno (aproximadamente 40,5 cm × 44,5 cm) e tubos de PTFE ondulados.
2. Inicialmente, ferva sacos de forno em água por ~ 30 min para remover compostos plásticos residuais. Para secar, leve ao forno a 175 °C.
3. Uma vez que os sacos secaram, adicione uma união do antetentino do polipropileno a cada canto da extremidade fechado dos sacos do forno. Estes acessórios permitem a conexão dos tubos empurrar o ar filtrado carvão vegetal dentro e puxar a fragrância fora do headspace.
4. Lave todos os sacos e tubos com 75% de etanol. Deixe o ar seco após a lavagem.
5. Depois que os sacos do forno secarem, coza sacos e tubos em um forno no calor baixo, aproximadamente 74-85 °C para 30 min.

3. Coleta volátil

NOTA: Luvas de neoprene estéreis precisam ser usadas durante todo este processo, pois entrar em contato com o saco ou cartuchos de filtro pode contaminar as amostras.

1. Cubra a flor selecionada com um saco de forno cozido. Cinch o saco junto firmemente com um laço plástico do zip abaixo da flor para impedir o fluxo de ar não desejado no saco.
2. Anexar um tubo da saída de ar do equipamento de coleta e conectá-lo a um dos sindicatos antepara no saco do forno.
3. Na outra união do antepara, una um cartucho de filtro de vidro que contem o adsorbent porous do polímero.
4. Anexe um segundo tubo para o equipamento de coleta na entrada de vácuo. Conecte a extremidade do segundo tubo no cartucho de filtro de coleta volátil de vidro.
5. Ligue tanto a bomba de ar e vácuo ao mesmo tempo definido em ~ 0,05 L / min. O headspace em torno da flor encher-se-á com ar, mas não se tornará overinflated. O sistema puxará o ar do saco através do filtro, prendendo os temporários florais.
6. Permita que a máquina funcione por 10 min e desligue então a bomba de ar e o vácuo.
   NOTA: Espécies de flores que produzem/emitem uma quantidade menor de fragrância podem precisar ser amostradas por um longo período de tempo.
7. Desmontar os tubos e o cartucho de filtro de vidro. Coloque o filtro em um frasco de vidro com uma tampa de parafuso. Uma vez que a tampa está sobre, selar o frasco com fita da linha da tubulação de PTFE.
8. Guarde amostras em um freezer até ser analisada usando GC-MS.
9. Repita este processo com um saco de forno limpo e filtro de vidro, desta vez com um saco de forno vazio, para coletar uma amostra de ar em branco como um controle. Isso permite que quaisquer voláteis de fundo coletados sejam identificados.
   NOTA: Repetir a coleta de amostras precisa ser feita aproximadamente ao mesmo tempo todos os dias, já que algumas flores produzem níveis variados de fragrânciaao longo de um dia.

4. GC-MS 4. GC-MS

1. Retire o cartucho de filtro de vidro do congelador e coloque em um GC-MS na porta injetor.
2. Libere os voláteis headspace coletados em adsorbent de polímero poroso do adsorvente pelo aquecimento na armadilha de coleta térmica (TCT) a 220 °C por 8 min dentro de um fluxo de gás hélio (taxa: 1,2 mL/min).
3. Coletar compostos desorbed na unidade de armadilha fria TCT em -130 °C. A temperatura da armadilha fria é regulada pelo programa GC-MS.
4. Calor flash da unidade de armadilha fria TCT para injetar os compostos na coluna capilar do cromatógrafo gasoso ao qual a unidade de armadilha fria TCT estava conectada. O método para o TCT começa em -20 °C e termina em 150 °C.
5. Programe o GC-MS a subir de 40 °C para 280 °C a 15 °C/min, com uma retenção de 5 min a 40 °C.

5. Análise de dados

1. Para identificação, compare os espectros de massa da amostra com os de bibliotecas de espectros de massa (NIST e Departamento de Ecologia Química, Universidade de Goteborg, Suécia^11),bem como tempos de retenção dos voláteis com os tempos de padrões compostos autênticos¹².
2. Compare cromatogramas de voláteis coletados para identificar picos recorrentes comuns.
3. Depois de identificar os voláteis de pico, use Pherobase (banco de dados on-line de semioquímicos e feromônios) para determinar se eles foram descritos anteriormente em fragrâncias florais¹⁰.

Representative Results

Os dados representativos do GC-MS são mostrados como um cromatograma na Figura 1. Além do cromatograma, também é fornecido um arquivo de dados de resultados(Arquivo Suplementar 1). Este arquivo de dados fornece o tempo de retenção para cada pico (RT), e uma identificação do composto que é composto (Biblioteca / ID). Picos entre 10:00 e 15:00 minutos são voláteis florais, devido ao peso molecular dos compostos¹⁰. Os números acima dos picos significam os tempos de retenção dos compostos identificados que são referenciados o arquivo de dados dos resultados(Arquivo Suplementar 1). Ao obter o cromatograma e o arquivo de dados para cada amostra de fragrância, os compostos podem ser comparados e aqueles que estão ocorrendo novamente para cada amostra de flor podem ser identificados. As coleções podem ser identificadas a partir deste documento na categoria "Amostra", nomeada para representar a flor amostrada, e a hora e a data da coleção (exemplo: UF1 8AM 03/16/15). A página 1 deste documento também mostra a identificação de compostos específicos identificados a partir da amostra (LibraryID), que o tempo de pico de retenção da Figura 1 do composto corresponde a (Pk#), e a porcentagem da fragrância total que cada volátil compreende (Área %). Todos os voláteis coletados listados em "Biblioteca/IDENTIFICAÇão" podem ser referenciados em Pherobase para determinar se eles já descreveram em uma fragrância floral. Por exemplo, no Arquivo Suplementar 1, composto #21, com tempo de retenção (RT) de 10.311 foi identificado como benzaldeído. Em amostras futuras, se o benzaldeído está presente, ele pode ser referenciado em Pherobase para determinar se é um composto floral provável para a flor. Na Figura 2,o benzaldeído foi revistado na Pherobase. Uma vez que um composto foi selecionado, a página mostra uma lista de todas as espécies de flores, organizadas pela família vegetal, a partir da qual esse composto de fragrância foi identificado. Destaque no canto inferior direito da Figura 2 é um pequeno subconjunto da espécie de orquídea (Orchidaceae) a partir do qual o benzaldeído foi determinado a estar presente na fragrância floral.

Figura 1: GC-MS volátil resultados de pico. Resultados gráficos mostrando o pico volátil da amostra de fragrância floral. Os números acima dos picos correspondem a uma lista de todos os compostos voláteis coletados, identificando o pico para o volátil específico. Picos entre 10:00 e 15:00 minutos são mais propensos a ser voláteis de uma fragrância floral. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Resultados do exemplo pherobase. Um exemplo dos resultados de uma busca pherobase para um composto de fragrância. Nesta figura Benzaldeído foi pesquisado, e os resultados mostram uma lista de todas as espécies de flores a partir do qual esta fragrância foi identificada. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Arquivo suplementar 1: Dados de resultados. Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).

Discussion

Embora esta técnica seja incrivelmente valiosa para sua velocidade de amostragem e portabilidade, uma limitação é usá-la para espécies epifíticas, ou aquelas que crescem em árvores e não do solo. No estudo original^10,uma das flores amostradas foi epifífita. Porque a máquina é demasiado pesada pendurar livremente, uma base estável, elevada deve ser feita para a amostragem. Além disso, a máquina pode ser conectada a uma tomada elétrica ou a bateria, por isso, se houver amostragem de campo prolongada, deve haver uma fonte de energia para carregar as baterias quando a máquina não estiver em uso.

Os métodos aqui permitem uma amostragem in situ não destrutiva, com amostragem repetida rápida e um tempo de amostragem muito mais rápido. Enquanto alguns estudos de fragrâncias florais exigem que a fragrância seja coletada por 2-3 horas para uma amostra, o método apresentado pode coletar com precisão os voláteis em aproximadamente 10 min devido ao material de coleta (adsorbent de polímero poroso) usado no vidro Filtro.

Estes métodos da coleção fornecem uma maneira de provar rapidamente e com segurança a fragrância produzida por flores, sem destruir ou prejudicar a flor. Com tantas flores, especialmente aquelas da família Orchidaceae,sendo categorizadas como ameaçadas ou ameaçadas de extinção, analisar as fragrâncias que estão produzindo de forma não destrutiva é fundamental, pois o trabalho é realizado para entender sua biologia de polinização. As informações obtidas a partir desses estudos poderiam potencialmente ser usadas para aumentar a polinização usando misturas sintéticas com base em produtos químicos de pico encontrados para atrair mais polinizadores para áreas com orquídeas florescentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bulkhead Union	Cole-Palmer	UX-06390-10
FEP tubing	Cole-Palmer	UX-06407-60
Gas Chromatography	Hewlett Packard	6890
Glass Wool, Silanized	Sigma-Aldrich	20411
Inlet liner	Agilent	5062-3587
Mass Spectrometer	Hewlett Packard	5973
Reynolds oven bag	Reynolds Consumer Products	Turkey size
Tenax Porous Polymer Adsorbent	Sigma-Aldrich	11982