Summary
Aquí, presentamos un protocolo para recoger los volátiles de fragancia sorpresal de flores en flor, utilizando un procedimiento de muestreo no destructivo.
Abstract
Se han muestreado fragancias de muchas familias de flores y se han analizado los volátiles. Conocer los compuestos que componen las fragancias puede ser un paso importante para la conservación de las flores que están amenazadas o en peligro de extinción. Debido a que la fragancia floral es fundamental para atraer polinizadores, este método podría utilizarse para comprender mejor o incluso mejorar la polinización. Presentamos un protocolo que utiliza un filtro de aire de carbón portátil y vacío para recoger volátiles de fragancias florales, que luego son analizados por un GC-MS. Mediante el uso de este método, los volátiles de fragancia se pueden muestrear utilizando un método no destructivo con una máquina que se transporta fácilmente. Esta metodología utiliza un procedimiento de muestreo rápido, reduciendo el tiempo de muestreo de 2-3 horas a aproximadamente 10 minutos. Usando GC-MS, los compuestos de fragancia se pueden identificar individualmente, sobre la base de estándares auténticos. Se presentan los pasos utilizados para recopilar datos de fragancia y control, desde la configuración del material hasta la recopilación de la salida de datos.
Introduction
Las flores suelen producir una fragancia utilizada para atraer a los polinizadores. Estas fragancias se componen de muchos compuestos químicos que actúan juntos como una mezcla floral1,2,3. Sin estas fragancias, las flores serían menos propensas a transmitir su información genética usando polinizadores. La fragancia floral se ha documentado en muchas familias de plantas con flores, siendo Orchidaceae una de las familias más comunes estudiadas4. Para entender el papel de la fragancia floral en la polinización, es importante recoger y analizar de forma no destructiva los compuestos químicos emitidos por las flores en diferentes momentos del día y durante los días a semanas las flores florecen están abiertas, ya que la fragancia puede variar con el tiempo5.
Un protocolo temprano para este tipo de muestreo fue desarrollado por Heath y Manukian6. El objetivo de sus métodos de muestreo era reducir el estrés en el espécimen (por ejemplo, plantas, insectos) que se estaba estudiando. Documentos anteriores documentaron que se requerían procedimientos destructivos para la planta, como la eliminación de flores en flor para recoger la fragancia. Publicaciones más recientes de fragancias florales de Cancino y Damon7,8 utilizaron métodos similares. Este estudio puso las flores en cámaras de vidrio y pasó el aire purificado sobre ellas; luego, los compuestos de fragancia de la cámara se absorbieron sobre los adsorbentes de polímeros porosos en pipetas Pasteur claras. Las fragancias se recogieron durante al menos dos horas durante este estudio. 9 llevaron a cabo estudios florales de fragancias sobre una orquídea epífita en el sur de Florida, al igual que el estudio original10. Una vez más, este estudio requirió que las flores fueran muestreadas durante más de dos horas para recoger los volátiles de la fragancia, con fragancia recogida en el polímero poroso adsorbente. El documento aquí presenta un método no destructivo que permite un muestreo mucho más rápido, con una duración de solo 10 minutos. Además, en lugar de utilizar una cámara de vidrio se utilizan bolsas de horno para hornear, que permiten un movimiento más flexible de la cámara y reducir las posibilidades de daño a las flores. Estas bolsas vienen en varios tamaños, lo que permite la opción de seleccionar el tamaño de la bolsa que se ajustará fácilmente a muestras individuales sin dañar la muestra o el material circundante. El adsorbente utilizado en este estudio fue Tenax Porous Polymer Adsorbent. Esto difiere de Porapak, ya que la muestra se puede desorbiar térmicamente sobre la columna GC-MS para su análisis, eliminando el uso de un disolvente químico.
Los métodos de este estudio proporcionan una manera de muestrear rápidamente volátiles de fragancia producidos por flores y podrían utilizarse para muestrear volátiles de otros especímenes, como las feromonas de insectos, o los volátiles de setas. El tiempo reducido para el muestreo significa que hay menos estrés en la muestra y la capacidad de recoger muchas muestras en un corto período de tiempo. Por ejemplo, en Sadler et al.9, la flor sólo era fragante por la noche, por lo que sólo dos o tres muestras se podían recoger cada noche. Con el método aquí, las muestras se pueden tomar toda la noche a intervalos de 15-20 minutos de la misma flor. Además, mediante el uso de bolsas en lugar de cámaras de vidrio, el espacio de la cabeza se puede suspender más fácilmente para el muestreo en el campo para la recolección in situ en especies de plantas amenazadas o en peligro de extinción. Usando el método presentado aquí, pudimos probar flores de 1,5 a 2 metros sobre el suelo. Estos métodos son increíblemente útiles para la recolección de fragancias en el laboratorio y el campo, y proporciona a los investigadores una técnica de muestreo que es rápida y no destructiva para la muestra.
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Protocol
NOTA: Los perfumes o lociones y productos perfumados no deben usarse durante ninguno de estos procedimientos.
1. Selección de flores
NOTA: Las flores utilizadas pueden ser de crecimiento natural en el medio ambiente o mantenerse bajo condiciones ambientales artificiales. La temperatura, la humedad y el nivel de luz durante la recolección pueden variar en función de las especies de flores específicas utilizadas y del tipo de datos que se recopilan. Por ejemplo, se han recopilado datos durante el día y por la noche de la misma flor para determinar si la fragancia varía a lo largo del día, y se han recopilado tanto de flores in situ como de invernadero.
- Seleccione una flor que esté inicialmente sin abrir para estandarizar el tiempo de recolección de muestras. Esto controla una fragancia que cambia de flor con el tiempo.
- Dependiendo de la duración del tiempo de floración, si es posible, espere al menos 24 horas después de la floración para recoger la muestra, estableciendo un tiempo estándar para todas las muestras.
- Si hay varias flores en flor en una planta, marque la que se utilizará con cinta adhesiva o algo similar para asegurar el muestreo repetido de la misma flor.
2. Preparación de materiales
- Utilice bolsas de horno (aproximadamente 40,5 cm x 44,5 cm) y tubos de PTFE corrugados.
- Inicialmente, hierva las bolsas de horno en agua durante 30 minutos para eliminar los compuestos plásticos residuales. Para secar, hornee en un horno a 175 oC.
- Una vez que las bolsas se hayan secado, agregue un mamparo de polipropileno a cada esquina del extremo cerrado de las bolsas de horno. Estos accesorios permiten la conexión de tubos para empujar el aire filtrado de carbón y extraer la fragancia del espacio de la cabeza.
- Enjuague todas las bolsas y tubos con 75% de etanol. Deje que ambos se sequen al aire después de enjuiciar.
- Después de que las bolsas de horno se hayan secado, hornear bolsas y tubos en un horno a fuego lento, aproximadamente 74-85 oC durante 30 min.
3. Colección volátil
NOTA: Los guantes de neopreno estériles deben usarse durante todo este proceso, ya que el contacto con la bolsa o los cartuchos de filtro puede contaminar las muestras.
- Cubra la flor seleccionada con una bolsa de horno al horno. Aprieta la bolsa firmemente con una cremallera de plástico debajo de la flor para evitar el flujo de aire no deseado en la bolsa.
- Coloque un tubo de la salida de aire del equipo de recogida y conéctelo a una de las uniones de mamparo sellos en la bolsa del horno.
- En la otra unión de mamparo, coloque un cartucho de filtro de vidrio que contenga un polímero poroso adsorbente.
- Conecte un segundo tubo al equipo de recogida en la entrada de vacío. Conecte el extremo del segundo tubo al cartucho de filtro de recolección volátil de vidrio.
- Encienda tanto la bomba de aire como el vacío al mismo tiempo ajustado s0,05 L/min. El espacio en la cabeza alrededor de la flor se llenará de aire, pero no se inflará demasiado. El sistema tirará del aire de la bolsa a través del filtro, atrapando a los volátiles florales.
- Deje que la máquina funcione durante 10 minutos y luego apague tanto la bomba de aire como el vacío.
NOTA: Las especies de flores que producen/emiten una cantidad menor de fragancia pueden necesitar ser muestreadas durante un período de tiempo más largo. - Desmontar los tubos y el cartucho del filtro de vidrio. Coloque el filtro en un vial de vidrio con una tapa atornillada. Una vez que la tapa esté encendida, selle el vial con cinta de rosca de tubo de PTFE.
- Almacene las muestras en un congelador hasta que se analicen con GC-MS.
- Repita este proceso con una bolsa de horno limpia y un filtro de vidrio, esta vez con una bolsa de horno vacía, para recoger una muestra de aire en blanco como control. Esto permite identificar cualquier volátil de fondo recopilado.
NOTA: La repetición de la recolección de muestras debe hacerse aproximadamente a la misma hora cada día, ya que algunas flores producen diferentes niveles de fragancia en el transcurso de un día.
4. GC-MS
- Retire el cartucho del filtro de vidrio del congelador y colóquelo en un GC-MS en el puerto del inyector.
- Liberar volátiles del espacio de la cabeza recogidos en polímeros porosos adsorbentes del adsorbente calentando en la trampa de recogida térmica (TCT) a 220 oC durante 8 minutos dentro de un flujo de gas de helio (tasa: 1,2 ml/min).
- Recoger los compuestos desorbiados en la unidad de trampa fría TCT a -130 oC. La temperatura de la trampa fría está regulada por el programa GC-MS.
- Empular la unidad de trampa fría TCT para inyectar los compuestos en la columna capilar del cromatógrafo de gases al que estaba conectada la unidad de trampa fría TCT. El método para el TCT comienza a -20 oC y termina a 150 oC.
- Programe el GC-MS para que aumente de 40 oC a 280 oC a 15 oC/min, con una retención de 5 minutos a 40 oC.
5. Análisis de datos
- Para la identificación, compare los espectros de masas de la muestra con los de las bibliotecas de espectros de masas (NIST y Departamento de Ecología Química, Universidad de Goteborg, Suecia11),así como los tiempos de retención de los volátiles con los tiempos de las normas compuestas auténticas12.
- Compare los cromatogramas de los volátiles recogidos para identificar picos recurrentes comunes.
- Después de identificar los volátiles pico, utilice Pherobase (base de datos en línea de semioquímicos y feromonas) para determinar si han sido descritos previamente en fragancias florales10.
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Representative Results
Los datos representativos del GC-MS se muestran como un cromatograma en la Figura 1. Además del cromatograma, también se proporciona un archivo de datos de resultados(Archivo suplementario 1). Este archivo de datos proporciona el tiempo de retención para cada pico (RT) y una identificación de qué compuesto es ese pico (Biblioteca/ID). Los picos entre las 10:00 y las 15:00 minutos son volátiles florales, debido al peso molecular de los compuestos10. Los números por encima de los picos significan los tiempos de retención de los compuestos identificados a los que se hace referencia al archivo de datos de los resultados (Archivo suplementario 1). Al obtener el cromatografía y el archivo de datos para cada muestra de fragancia, se pueden comparar los compuestos y se pueden identificar los que son recurrentes para cada muestra de flor. Las colecciones se pueden identificar a partir de este documento bajo la categoría "Muestra", nombrada para representar la flor muestreada, y la hora y fecha de la colección (ejemplo: UF1 8AM 03/16/15). La página 1 de este documento también muestra la identificación de compuestos específicos identificados a partir de la muestra (LibraryID), que el tiempo máximo de retención de la Figura 1 corresponde al compuesto (Pk), y el porcentaje de la fragancia total que cada volátil comprende (%). Todos los volátiles recogidos enumerados en "Biblioteca/ID" se pueden hacer referencia en Pherobase para determinar si han descrito previamente en una fragancia floral. Por ejemplo, en el archivo suplementario 1, el #21 compuesto, con un tiempo de retención (RT) de 10.311 se ha identificado como benzaldehído. En muestras futuras, si el benzaldehído está presente, se puede hacer referencia en la pherobase para determinar si es un compuesto floral probable para la flor. En la Figura 2,se buscó benzaldehído en Pherobase. Una vez seleccionado un compuesto, la página muestra una lista de todas las especies de flores, organizadas por familia de plantas, a partir de las cuales se ha identificado ese compuesto de fragancia. Destacado en la esquina inferior derecha de la Figura 2 es un pequeño subconjunto de las especies de orquídeas (Orchidaceae) de la que se ha determinado que el benzaldehído está presente en la fragancia floral.
Figura 1: Resultados del pico volátil GC-MS. Resultados gráficos que muestran los picos volátiles de la muestra de fragancia floral. Los números por encima de los picos corresponden a una lista de todos los compuestos volátiles recogidos, identificando el pico al volátil específico. Los picos entre las 10:00 y las 15:00 minutos son más propensos a ser volátiles de una fragancia floral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados del ejemplo de la ferobase. Un ejemplo de resultados de una búsqueda de Pherobase para un compuesto de fragancia. En esta figura se buscó Benzaldehyde, y los resultados muestran una lista de todas las especies de flores de las que se ha identificado esta fragancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo Suplementario 1: Datos de resultados. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Aunque esta técnica es increíblemente valiosa por su velocidad de muestreo y portabilidad, una limitación es su uso para especies epífitas, o aquellos que crecen en los árboles y no desde el suelo. En el estudio original10,una de las flores muestreadas fue epífita. Debido a que la máquina es demasiado pesada para colgarlibremente, se debe hacer una base estable y elevada para el muestreo. Además, la máquina se puede conectar a una toma de corriente o alimentada por batería, por lo que si hay un muestreo de campo prolongado, debe haber una fuente de alimentación para cargar las baterías cuando la máquina no está en uso.
Los métodos aquí permiten un muestreo in situ no destructivo, con muestreo repetido rápido y un tiempo de muestreo mucho más rápido. Mientras que algunos estudios de fragancias florales requieren que la fragancia se recoja durante 2-3 horas para una muestra, el método presentado puede recoger con precisión los volátiles en aproximadamente 10 minutos debido al material de recolección (polímero poroso adsorbendote) utilizado en el vidrio Filtro.
Estos métodos de recolección proporcionan una manera de probar rápida y segura la fragancia producida por las flores, sin destruir o dañar la flor. Con tantas flores, especialmente las de la familia Orchidaceae,siendo categorizadas como amenazadas o en peligro de extinción, analizar las fragancias que están produciendo de una manera no destructiva es fundamental ya que el trabajo se lleva a cabo para entender su biología de la polinización. La información obtenida de estos estudios podría utilizarse potencialmente para aumentar la polinización utilizando mezclas sintéticas basadas en productos químicos pico encontrados para atraer más polinizadores a áreas con orquídeas en flor.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
USDA-ARS Proyecto de Investigación número 6036-22000-028-00D. El uso de nombres comerciales, de empresas o corporaciones en esta publicación es para la información y conveniencia del lector. Dicho uso no constituye un respaldo o aprobación oficial por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos o del Servicio de Investigación Agrícola de ningún producto o servicio, con exclusión de otros que puedan ser adecuados. Además, el Departamento de Biología de la Universidad de Florida-Lewis y Varina Vaughn Fellowship en Orchid Biology (2017), y una Beca de Investigación de Posgrado de la Universidad de Florida (2014-2018) también proporcionaron fondos. También agradecemos a Cindy Bennington de la Universidad de Stetson por la planta de orquídeas utilizada durante el rodaje de este video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| FEP tubing | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Gas Chromatography | Hewlett Packard | 6890 | |
| Glass Wool, Silanized | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Inlet liner | Agilent | 5062-3587 | |
| Mass Spectrometer | Hewlett Packard | 5973 | |
| Reynolds oven bag | Reynolds Consumer Products | Turkey size | |
| Tenax Porous Polymer Adsorbent | Sigma-Aldrich | 11982 |
References
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