Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

GC-MS Termal Desorpsiyon Örneklemesi için Headspace Uçucu Toplama Tekniği kullanılarak Çiçek Kokusu Volatiles Hızlı Toplama

Published: December 10, 2019 doi: 10.3791/58928
Automatic Translation
1, 2, 1
1Entomology and Nematology Department, University of Florida, 2Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology, Agricultural Research Service U.S. Department of Agriculture

Summary

Burada, çiçek açan çiçeklerden çiçek kokusu uçucuları toplamak için, tahribatsız bir örnekleme prosedürü kullanarak bir protokol salıyoruz.

Abstract

Birçok çiçek ailelerinin kokuları örneklenmiş ve uçucu analiz edilmiştir. Kokuları oluşturan bileşikleri bilmek tehdit altında veya nesli tükenmekte olan çiçeklerin korunması için önemli bir adım olabilir. Çiçek kokusu tozlaştırıcıları çekmek için çok önemli olduğundan, bu yöntem tozlaşmayı daha iyi anlamak ve hatta geliştirmek için kullanılabilir. Biz daha sonra bir GC-MS tarafından analiz edilir çiçek koku uçucu toplamak için taşınabilir kömür hava filtresi ve vakum kullanarak bir protokol salar. Bu yöntem kullanılarak, koku uçucu kolayca taşınan bir makine ile tahribatsız bir yöntem kullanılarak örneklenebilir. Bu metodoloji hızlı örnekleme prosedürü kullanır ve örnekleme süresini 2-3 saatten yaklaşık 10 dakikaya indirer. GC-MS kullanılarak, koku bileşikleri otantik standartlara göre ayrı ayrı tanımlanabilir. Koku ve kontrol verilerini toplamak için kullanılan adımlar, malzeme kurulumundan veri çıktısını toplamaya kadar sunulur.

Introduction

Çiçekler genellikle tozlaştırıcılar çekmek için kullanılan bir koku üretmek. Bu kokular birçok kimyasal bileşikler tüm bir çiçek karışımı1,2,3olarak birlikte hareket oluşur. Bu kokular olmadan, çiçekler tozlaştırıcılar kullanarak genetik bilgi aktarmak için daha az olası olacaktır. Çiçek kokusu birçok çiçekli bitki ailelerde belgelenmiştir, Orchidaceae daha yaygın ailelerden biri olan4okudu . Tozlaşma çiçek kokusu rolünü anlamak için, zararsız toplamak ve günün farklı saatlerinde çiçek yayılan kimyasal bileşikleri analiz etmek önemlidir ve hafta çiçek açık birkaç gün boyunca, koku zaman içinde değişebilir gibi5.

Örnekleme bu tür için erken bir protokol Heath ve Manukian6tarafından geliştirilmiştir. Örnekleme yöntemlerinin amacı, incelenmekte olan numune (örneğin, bitkiler, böcekler) üzerindeki stresi azaltmaktı. Daha önceki kağıtlar bitki için yıkıcı prosedürler gerekli olduğunu belgelenmiş, bu koku toplamak için çiçek açan çiçekleri kaldırma gibi. Cancino ve Damon7tarafından daha yeni çiçek koku yayınları,8 benzer yöntemler kullanılır. Bu çalışma cam odaları na çiçekler koymak ve üzerlerine saflaştırılmış hava geçti; sonra haznedeki koku bileşikleri açık Pasteur pipetlerinde gözenekli polimer adsorbentlere emilir. Kokular bu çalışma sırasında en az iki saat boyunca toplanmıştır. Sadler ve ark.9 güney Florida'da bir epifitik orkide üzerinde çiçek koku çalışmaları yürütülen, çok orijinal çalışma10gibi . Yine, bu çalışma da gözenekli polimer adsorbent üzerine toplanan koku ile, koku uçucu toplamak için iki saatten fazla örneklenmiş çiçekler gerekli. Kağıt burada çok daha hızlı örnekleme için izin veren bir tahribatsız yöntem sunuyor, sadece 10 dakika süren. Ayrıca, yerine bir cam odası fırın pişirme torbaları kullanarak kullanılır, hangi odanın daha esnek hareket sağlar ve çiçeklere zarar olasılığını azaltmak. Bu çantalar, numuneye veya çevredeki malzemeye zarar vermeden tek tek numunelere kolayca uyacak çanta boyutunu seçme seçeneğinin çeşitli boyutlarda olması yla birlikte gelir. Bu çalışmada kullanılan adsorbent Tenax Gözenekli Polimer Adsorbent oldu. Bu Porapak'tan farklıdır, çünkü numune analiz için GC-MS sütununa termal olarak desorbe edilebilir ve kimyasal bir çözücünün kullanımını ortadan kaldırır.

Bu çalışmadaki yöntemler, çiçekler tarafından üretilen koku uçucularını hızlı bir şekilde örneklemenin bir yolunu sağlar ve böcek feromonları veya mantar uçucuları gibi diğer örneklerden de uçucu ları örneklemek için kullanılabilir. Örnekleme için daha az süre, numune üzerinde daha az stres olduğu ve kısa bir süre içinde birçok numune toplama yeteneği anlamına gelir. Örneğin, Sadler ve ark.9,çiçek sadece geceleri kokulu, bu yüzden sadece iki veya üç örnek her gece toplanabilir. Buradaki yöntemle, numuneler tüm gece aynı çiçekten 15-20 dakikalık aralıklarla alınabilir. Ayrıca, cam odaları yerine çanta lar kullanılarak, kafa boşluğu, nesli tükenmekte olan veya tehdit edilen bitki türleri üzerinde yerinde toplama için sahada örnekleme için daha kolay askıya alınabilir. Burada sunulan yöntemi kullanarak yerden 1,5-2 metre yükseklikteki çiçekleri örnekleyebildik. Bu yöntemler laboratuvarda ve alanda koku toplama için son derece yararlıdır ve araştırmacılara numuneye hızlı ve tahribatsız bir örnekleme tekniği sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Parfüm veya kokulu losyonlar ve ürünler bu işlemlerin herhangi birinde giyilmemelidir.

1. Çiçek seçimi

NOT: Kullanılan çiçekler ya çevrede doğal olarak yetişebilir ya da yapay çevre koşullarında tutulabilir. Toplama sırasında sıcaklık, nem ve ışık seviyesi kullanılan özel çiçek türlerine ve ne tür verilerin toplandığına bağlı olarak değişebilir. Örneğin, kokunun günün saatine göre değişip değişmediğini belirlemek için aynı çiçek için gündüz ve gece veri toplanmış ve hem yerinde hem de sera çiçeklerinden toplanmıştır.

  1. Örnek toplama süresini standartlaştırmak için başlangıçta açılmamış bir çiçek seçin. Bu zaman içinde koku değişen bir çiçek için kontrol eder.
  2. Çiçeklenme süresine bağlı olarak, mümkünse, tüm numuneler için standart bir zaman belirleyerek, numuneyi toplamak için çiçeklenmeden sonra en az 24 saat bekleyin.
  3. Bir bitki üzerinde birden fazla çiçek çiçek varsa, aynı çiçek tekrarlanan örnekleme sağlamak için bant veya benzer bir şey işaretleme ile kullanılacak bir işaretleyin.

2. Malzeme hazırlama

  1. Fırın poşetleri (yaklaşık 40,5 cm × 44,5 cm) ve oluklu PTFE tüp kullanın.
  2. Başlangıçta, ~ 30 dk için suda kalan plastik bileşikleri kaldırmak için fırın torbaları kaynatın. Kurutmak için 175 °C'de fırında pişirin.
  3. Torbalar kuruduktan sonra, fırın poşetlerinin kapalı ucunun her köşesine polipropilen böyük birleşim ekleyin. Bu ekler, tüplerin bağlantısının kömür filtrelenmiş havayı içeri itmesine ve kokuyu headspace'ten çıkarmasına olanak sağlar.
  4. Tüm torbaları ve tüpleri %75 etanolile durulayın. Durulama dan sonra her iki hava kurualım.
  5. Fırın poşetleri kuruduktan sonra, kısık ateşte fırında poşet ler ve tüpler, yaklaşık 74-85 °C 30 dk.

3. Uçucu toplama

NOT: Steril neopren eldivenler bu işlem boyunca giyilmelidir, çünkü torba veya filtre kartuşlarıile temas etmek numuneleri kirletebilir.

  1. Seçilen çiçeği fırın poşeti ile kaplayın. Çantaiçine istenmeyen hava akışını önlemek için çiçeğin altında plastik bir zip kravat ile birlikte sıkıca çanta cinch.
  2. Toplama ekipmanının hava çıkışından bir tüp takın ve fırın torbasındaki bölme birliklerinden birine bağlayın.
  3. Diğer bölme birliğinde, gözenekli polimer adsorbent içeren bir cam filtre kartuşu takın.
  4. Vakum girişindeki toplama ekipmanına ikinci bir tüp takın. İkinci tüpün ucunu cam uçucu toplama filtresi kartuşu üzerine bağlayın.
  5. ~0,05 L/dk olarak belirlenen aynı anda hem hava pompasını hem de vakumu açın. Çiçeğin etrafındaki boşluk havayla dolacak, ama aşırı şişirilmeyecek. Sistem, torbadan filtreden hava çekerek çiçek uçucularını hapseder.
  6. Makinenin 10 dakika çalışmasına izin verin ve sonra hem hava pompasını hem de vakumu kapatın.
    NOT: Daha az miktarda koku üreten/yakan çiçek türlerinin daha uzun bir süre için örnekalınması gerekebilir.
  7. Tüpleri ve cam filtre kartuşu sökün. Filtreyi vidalı kapaklı cam bir şişeye yerleştirin. Kapak başladıktan sonra şişeyi PTFE boru ipliği bandıyla kapatın.
  8. Örnekleri GC-MS kullanılarak analiz edilene kadar dondurucuda saklayın.
  9. Temiz bir fırın torbası ve cam filtre ile bu işlemi tekrarlayın, boş bir fırın torbası ile bu kez, bir kontrol olarak boş bir hava örneği toplamak için. Bu, toplanan arka plan uçucularının tanımlanmasını sağlar.
    NOT: Bazı çiçekler gün boyunca değişen koku seviyeleri ürettiğinden, her gün yaklaşık aynı saatte numune toplamanın tekrarlanması gerekir.

4. GC-MS

  1. Cam filtre kartuşu dondurucudan çıkarın ve enjektör bağlantı noktasına gc-MS yerleştirin.
  2. Termal toplama kapanında (TCT) helyum gazı akışı içinde 8 dk için 220 °C'ye kadar ısıtılarak adsorbentten gözenekli polimer adsorbentüzerinde toplanan kafa boşluğu uçucuları serbest bırakın (hız: 1,2 mL/dk).
  3. -130 °C'deki TCT soğuk kapan ünitesinde desorbed bileşikleri toplayın. Soğuk kapan sıcaklığı GC-MS programı tarafından düzenlenir.
  4. TCT soğuk kapan ünitesinin bağlı olduğu gaz kromatografının kılcal sütununa bileşikleri enjekte etmek için TCT soğuk tuzak ünitesini flaş ısıtın. TCT yöntemi -20 °C'de başlar ve 150 °C'de biter.
  5. GC-MS'i 40 °C'den 280 °C'ye 15 °C/dk,40 °C'de 5 dk bekletecek şekilde programlayın.

5. Veri analizi

  1. Tanımlama için, örneğin kütle spektrumları kütüphanelerinden (NIST ve Kimyasal Ekoloji Bölümü, Goteborg Üniversitesi, İsveç11),yanı sıra uçucu maddelerin tutma sürelerini otantik bileşik standartların12kez tutma sürelerini karşılaştırın.
  2. Ortak tekrarlayan zirveleri belirlemek için toplanan uçucu kromatogramları karşılaştırın.
  3. Tepe uçucu tespit ettikten sonra, daha önce çiçek kokuları10açıklanan olup olmadığını belirlemek için Feobaz (semiyochemicals ve feromonlar online veritabanı) kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GC-MS'den elde edilen temsili veriler Şekil 1'dekromatogram olarak gösterilmiştir. Kromatograma ek olarak, sonuçların bir veri dosyası da sağlanır (Ek Dosya 1). Bu veri dosyası, her tepe (RT) için bekletme süresini ve bu tepenin hangi bileşik olduğunun (Kitaplık/Kimlik) tanımlanmasını sağlar. 10:00 ve 15:00 dakika arasındaki zirveler10bileşiklerin moleküler ağırlığı nedeniyle, çiçek uçucu vardır. Zirvelerin üzerindeki sayılar, sonuçların veri dosyasına başvurulan tanımlanan bileşiklerin bekletme sürelerini belirtir (Ek Dosya 1). Her koku örneği için kromatogram ve veri dosyası elde edilerek, bileşikler karşılaştırılabilir ve her çiçek örneği için yinelenen olanlar tespit edilebilir. Koleksiyonlar bu belgede örneklenebilen çiçeği ve koleksiyonun saatini ve tarihini (örnek: UF1 8AM 03/16/15) temsil etmek üzere "Örnek" kategorisi altında tanımlanabilir. Bu belgenin 1. "Library/ID" altında listelenen tüm toplanan uçucular, daha önce bir çiçek kokusuyla açıklanıp tanımlanmadıklarını belirlemek için Pherobase'de başvurulabilir. Örneğin, Ek Dosya 1,bileşik #21, bir saklama süresi (RT) ile 10.311 benzaldehit olarak tanımlanmıştır. Gelecekteki örneklerde, benzaldehit varsa, bu çiçek için olası bir çiçek bileşik olup olmadığını belirlemek için Ferombaz başvurulabilir. Şekil 2'deFeobasüste benzaldehit arandı. Bir bileşik seçildikten sonra, sayfa, bitki ailesi tarafından düzenlenen ve koku bileşiğinin tanımlandığı tüm çiçek türlerinin bir listesini gösterir. Şekil 2'nin sağ alt köşesinde, benzaldehitin çiçek kokusunda bulunduğu belirlenen orkide türlerinin (Orchidaceae) küçük bir alt kümesi vurgulanmıştır.

Figure 1
Şekil 1: GC-MS uçucu tepe sonuçları. Çiçek kokusu örneğinin en yüksek uçucularını gösteren grafiksel sonuçlar. Zirvelerin üzerindeki sayılar, toplanan tüm uçucu bileşiklerin listesine karşılık gelir ve tepeyi belirli uçucu bileşiklere tanımlar. 10:00 ile 15:00 dakika arasındaki zirveler büyük olasılıkla çiçekli bir kokudan kaynaklanan uçucu luklardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Feromatal örnek sonuçlar. Bir koku bileşik için bir Feobase arama sonuçları bir örnek. Bu şekilde Benzaldehit arandı ve sonuçlar bu kokutespit edilmiştir tüm çiçek türlerinin bir listesini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Sonuç Verileri. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu teknik örnekleme hızı ve taşınabilirliği açısından inanılmaz derecede değerli olmasına rağmen, bir sınırlama onu epifitik türler için ya da ağaçlarda yetişenler için kullanıyor, yerden değil. Orijinal çalışmada10, örneklenmiş çiçeklerden biri epifitik oldu. Makine serbestçe asılamayacak kadar ağır olduğundan, örnekleme için kararlı, yüksek bir taban yapılmalıdır. Ayrıca, makine ya bir elektrik prizine takılabilir ya da pille çalışan, bu nedenle uzun alan örneklemesi varsa, makine kullanılmadığında pilleri şarj etmek için bir güç kaynağı olmalıdır.

Buradaki yöntemler, hızlı tekrarlanan örnekleme ve çok daha hızlı örnekleme süresi ile in situ non-yıkıcı örnekleme sağlar. Bazı çiçek koku çalışmaları kokunun bir örnek için 2-3 saat boyunca toplanmasını gerektirirken, sunulan yöntem camda kullanılan toplama malzemesi (gözenekli polimer adsorbent) nedeniyle yaklaşık 10 dk'da uçucu maddeleri doğru bir şekilde toplayabiliyor. Filtre.

Bu toplama yöntemleri, çiçeklertarafından üretilen kokuyu, çiçeği yok etmeden veya zarar vermeden hızlı ve güvenli bir şekilde tatmanın bir yolunu sağlar. Bu kadar çok çiçek ile, özellikle aile Orchidaceaeiçinde , tehdit veya tehlike altında olarak kategorize ediliyor, tahribatsız bir şekilde ürettikleri kokuları analiz onların tozlaşma biyolojianlamak için yapılan çalışma olarak önemlidir. Bu çalışmalardan elde edilen bilgiler potansiyel olarak çiçeklenme orkide ile alanlara daha fazla tozlaştırıcı çekmek için bulunan tepe kimyasallara dayalı sentetik karışımları kullanarak tozlaşma artırmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgments

USDA-ARS Araştırma Projesi numarası 6036-22000-028-00D. Bu yayında ticaret, firma veya şirket adlarının kullanımı okuyucunun bilgi ve kolaylığı içindir. Bu tür kullanım, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı veya Tarım Araştırma Servisi'nin uygun olabilecek diğer ürün veya hizmetin hariç tutulması için resmi bir onay veya onay anlamına gelmez. Ayrıca, Florida Üniversitesi Biyoloji Bölümü-Lewis ve Varina Vaughn Bursu Orkide Biyolojisi (2017) ve Florida Üniversitesi Lisansüstü Araştırma Bursu (2014-2018) de fon sağladı. Biz de bu videonun çekimleri sırasında kullanılan orkide bitki için Stetson Üniversitesi'nden Cindy Bennington teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bulkhead Union Cole-Palmer UX-06390-10
FEP tubing Cole-Palmer UX-06407-60
Gas Chromatography Hewlett Packard 6890
Glass Wool, Silanized Sigma-Aldrich 20411
Inlet liner Agilent 5062-3587
Mass Spectrometer Hewlett Packard 5973
Reynolds oven bag Reynolds Consumer Products Turkey size
Tenax Porous Polymer Adsorbent Sigma-Aldrich 11982

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
  2. Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
  3. Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
  4. Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
  5. Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
  6. Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
  7. Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
  8. Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
  9. Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
  10. Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
  11. National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
  12. The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).

Tags

Biyokimya Sayı 154 kömür filtresi semiyokimyasallar taşınabilir vakum koku çiçek
GC-MS Termal Desorpsiyon Örneklemesi için Headspace Uçucu Toplama Tekniği kullanılarak Çiçek Kokusu Volatiles Hızlı Toplama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ray, H. A., Stuhl, C. J.,… More

Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling. J. Vis. Exp. (154), e58928, doi:10.3791/58928 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter