Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

I Vitro differentiering Model af menneskets normale hukommelse B celler til langlivede plasmaceller

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58929
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1IGH, CNRS, Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology, CHU Montpellier, 3UFR de Médecine, Univ Montpellier

Summary

Brug Multi-trins kultur systemer, rapportere vi en in vitro-B-celle til plasma celle differentiering model.

Abstract

Plasma celler (pc'er) udskiller store mængder af antistoffer og udvikle fra B-celler, der er blevet aktiveret. Pc'er er sjældne celler i knoglemarven eller slimhinde og sikre humorale immunitet. På grund af deres lave hyppighed og placering, studiet af pc'er er vanskeligt i human. Vi rapporterede en B til PC in vitro-differentiering model ved hjælp af udvalgte kombinationer af cytokiner og aktivering molekyler, der gør det muligt for at gengive sekventielle Celledifferentiering sker in vivo. I denne in vitro model, hukommelse B-celler (MBCs) vil differentiere i pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), tidligt pc'er og endelig til langlivede tæt pc'er, med en fænotype med deres modstykker i raske personer. Vi har også bygget en åben adgang bioinformatik værktøjer til at analysere de mest fremtrædende oplysninger fra GEP data relateret til PC differentiering. Disse ressourcer kan bruges til at studere menneskelige B til PC differentiering og i den aktuelle undersøgelse, vi undersøgte udtryk genregulering af epigenetiske faktorer under menneskelige B til PC differentiering.

Introduction

Differentiering af B-celler til plasma celler (pc'er) er afgørende for humorale immunitet og beskytte værten mod infektioner1. B at differentiering af PC er forbundet med større ændringer i transskription kapacitet og stofskifte til at rumme at antistof sekretion. Transkriptionsfaktorer, der styrer B til PC differentiering er blevet grundigt undersøgt og afsløret eksklusive netværk herunder B - og PC-specifikke transskription faktorer (TFs)2. I B-celler er PAX5, BCL6 og BACH2 TFs vogtere af B-celle identitet2,3. Induktion af IRF4, PRDM1 BLIMP1 og XBP1 PC TF-kodning vil slukke B celle gener og fremkalde en koordineret antistof-secernerende celle transcriptional program3,4,5. Disse koordineret transcriptional ændringer er forbundet med Ig gener transskription aktivering sammen med et skift fra formen membran-bundet til formularen udskilles af immunoglobulin tunge kæde2,3, 4. B til PC differentiering er forbundet med induktion af gener involveret i endoplasmatiske reticulum og Golgi apparatet fungerer samtidig med udfoldet protein svar (UPR) aktivering kendt for at spille en nøglerolle i PC af imødekommende syntesen af udskilles immunoglobuliner6,7. TF XBP1 spiller en stor rolle i denne cellulære tilpasning8,9,10.

B-celler og pc'er er centrale aktører i humorale immunitet. Forstå biologiske processer, der styrer produktionen og overlevelse af normale plasma celler er kritisk i terapeutiske indgreb, som skal sikre effektiv immunrespons og forhindre autoimmunitet eller immundefekt. PC er sjældne celler med differentiering vorden finder sted i anatomiske steder, der hæmmer fuld biologiske karakterisering, især i human. Brug Multi-trins kultur systemer, har vi rapporteret en in vitro-B til PC differentiering model. Denne model gengiver den sekventielle Celledifferentiering og modning forekommer i de forskellige organer i vivo11,12,13,. I et første skridt, hukommelse B-celler er først aktiveret for fire dage af CD40 ligand, oligodeoxynucleotides og cytokin kombination og differentiere i preplasmablasts (PrePBs). I et andet trin, er preplasmablasts tilskyndet til at differentiere i plasmablasts (PBs) ved at fjerne CD40L og oligodeoxynucleotides stimulation og ændre cytokin kombination. I en tredje trin, er plasmablasts tilskyndet til at differentiere i tidlige pc'er ved at ændre cytokin kombination11,12. En fjerde trin blev indført for at få fuldt modne pc'er ved dyrkning af disse tidlige pc'er med knoglemarv stromale celler aircondition medium eller valgt vækstfaktorer13. Disse ældre pc'er kunne overleve flere måneder in vitro- og udskiller store mængder af immunglobulin (figur 1). Interessant, sammenfatter vores in vitro-modellen de koordinerede transcriptional ændringer og fænotype af forskellige B til PC faser, der kan blive opdaget i vivo11,12,13,14 ,15. Pc'er er sjældne celler og vores in vitro-differentiering model giver mulighed for at studere menneskelige B til PC differentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen følger retningslinjer i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og aftale af Montpellier Universitet Hospital Centre for biologiske ressourcer.

1. i Vitro Normal Plasma celle differentiering Model

Bemærk: Pc'er der genereres gennem en fire-trins kultur11,12,13.

  1. B-celle forstærkning og differentiering
    1. Bruge perifere blod celler fra raske frivillige for hukommelse B-celle rensning.
    2. Fortynd 7,5 mL blodprøve med 24,5 mL af RPMI 1640 medium.
    3. 12,5 mL stuetemperatur tæthed farveforløb (f.eks. Ficoll) tilsættes til en steril 50 mL konisk slange. Forsigtigt overlay tæthed farveforløb med 32 mL fortyndet blod. Minimere blanding af de to faser.
    4. Der centrifugeres 20 min på 500 x g med bremsen. Indsamle PBMC fra den fortyndede plasma/tæthed gradient grænseflade og placere celler i en steril 50 mL tube og fuldføre til 45 mL med Hanks afbalanceret saltopløsning.
    5. Der centrifugeres celler i 5 min på 500 x g. Omhyggeligt fjernes supernatanten og holde pelleten.
    6. Tilføje 45 mL af RPMI1640/10% føtalt kalveserum (FCS), og der centrifugeres 5 min på 500 x g. Omhyggeligt fjernes supernatanten og holde pelleten. Der tilsættes 30 mL PBS/2% FCS.
    7. Fjerne CD2 + celler ved hjælp af anti-CD2 magnetiske perler. Tilføj 4 perler for én målcellen. Inkubér 30 min. ved 4 ° C.
      1. Separat perle-bundet celler fra ubundne celler ved hjælp af en magnet for celle adskillelse ansøgning. Indsamle ubundne celler og Inkuber celle pellet med anti CD19 APC og anti CD27 PE antistoffer i 15 minutter ved 4 ° C (2 µL antistof til 106 celler).
      2. Vaskes to gange i PBS/10% ged serum.
      3. Fjerne forurenende begivenheder på både FSC og SSC parceller. Plot slåbrokker på FSC-A vs FSC-Hansen og SSC-A vs SSC-H grunde til at fjerne snavs og for at vælge den samlede leukocyt befolkning. Vælg hukommelse B celler på CD19/CD27 og CD19+CD27+.
      4. Rense MBCs ved hjælp af en celle sorteringsanlæg med 95% renhed.
    8. Udfør alle kultur trin ved hjælp af IMDM og 10% FCS, suppleret med 50 mg/mL menneskelige transferrin og 5 mg/mL humant insulin.
    9. Plade renset MBCs i seks-og kultur plader (1.5 x 105 MBCs/mL i 5 mL/hul), 4 dage, med IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), og IL-15 (10 ng/mL).
      1. Tilføj Phosphorothioate CpG ODN 2006, histidin-mærket rekombinant humant opløselige CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) og anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) for MBCs aktivering (figur 1). Aktivering af sCD40L eller ODN kun med de samme cytokin cocktail udbytter til lavere forstærkning12. Kombinationen af aktivering signaler beskrevet her blyholdig til det maksimale antal aktiverede B-celler og PrePBs11,12 (figur 1).
      2. Til gen expression profilering, rense CD38-/CD20- PrePBs, på dag 4, ved hjælp af en celle sidesorteringen (figur 2).
  2. Plasmablastic celle generation
    1. På dag 4, tælle cellerne.
    2. Plade celler i 12-og kultur plader på 2,5 x 105/mL i 2 mL/godt.
    3. Inducere differentiering af fjernelse af CpG oligonukleotider og sCD40L og tilføjelsen af en ny kultur medium med en ny cytokin cocktail, herunder IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) og IL-15 (10 ng/mL) (figur 1). Kultur celler i 3 dage (fra dag 4 til dag 7) ved 37 ° C.
    4. Til gen expression profilering, rense CD38+/CD20- PBs, på dag 7, ved hjælp af en celle sidesorteringen (figur 2).
  3. Tidlig plasma celle generation
    1. På dag 7, tælle cellerne.
    2. Plade celler i 12-og kultur plader på 5 x 105/mL i 2 mL/godt.
    3. Differentiere PB i tidlige pc'er ved hjælp af friske næringssubstratet med IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) og IFN-α (500 U/mL) i 3 dage ved 37 ° C. Til gen expression profilering, rense CD20-/CD38+/CD138+ tidlige pc'er, på dagen 10, ved hjælp af en celle sidesorteringen (figur 2).
  4. Langlivede plasma celle generation
    1. Differentiere tidlige pc'er i langlivet pc'er ved at ændre dyrkningsbetingelserne.
    2. Kultur celler i 12-og kultur plader på 5 x 105/mL i 2 mL/godt eller i 24-og kultur plader i 1 mL/godt ved 37 ° C, ved hjælp af IL-6 og stromale celle aircondition medium og APRIL (200 ng/mL).
    3. Få stromale celler-aircondition medium ved dyrkning stromale celler i 5 dage med næringssubstratet. Filtrer stromale cellekultur supernatanten (0,2 µm) og fryse.
    4. Tilføje 50% af stromale celler-aircondition medier til PC kulturer med fornyelse hver uge. Genererede langlivede pc'er kunne opretholdes for måneder13. Langsigtede overlevelse af pc'er kan fås med IL-6 og APRIL kun som rapporteret13.
    5. Foranstaltning Ig sekretion fra flowcytometri sorteret pc'er.
    6. Kultur pc'er på 106 celler/mL i 24 timer og høste cellekultur supernatant. Måle IgG og IgA ved hjælp af menneskelige enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) kits11,12,13. Den mediane IgG sekretion varierede fra 10 pg/celle/dag på dag 10 til 17 pg/celle/dag på dag 6013.

2. molekylære Atlas af B til PC differentiering

Bemærk: Vi byggede en bekvem og åben adgang bioinformatik værktøjer til at udtrække og visualisere de mest fremtrædende oplysninger fra Affymetrix GEP data relateret til PC differentiering (GenomicScape)15. GEP er offentligt tilgængelige fra ArrayExpress database (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) herunder renset MBCs, PrePBs, PBs og EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 og E-MEXP-3034 og BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape er et frit tilgængeligt webtool.

  1. Markering af B til PC datasæt
    1. Vælg B til PC datasæt i menuen Gennemse Data i GenomicScape åbne bioinformatic værktøj (http://www.genomicscape.com) kaldet menneskelige B celler til plasmaceller. Visualisering af gen expression profil af unikke gen eller en liste over gener er tilgængelige ved hjælp af værktøjet Udtryk-Coexpression rapport i Analyseværktøjer tilgængelige på hjemmesiden.
  2. Overvåget analyse og principal komponent analyse (PCA)
    1. Vælg analyseværktøjer | webSAM at indlæse SAM-værktøj.
    2. Vælg det menneskelige B celler til plasmaceller datasæt og grupper af prøver at sammenligne.
    3. Bruge forskellige filtre der kan anvendes de filtreringsindstillinger af interesse.
    4. Hvis du vil sammenligne gen expression profiler med SAM-værktøj, ændre filtreringsindstillingerne herunder Fold ændring, antallet af permutationer, falsk opdagelse sats og typen sammenligning. GenomicScape vil beregne analysen og give gener varierende udtrykt mellem de udvalgte grupper.
    5. Køre principal komponent analyse ved at vælge Principal komponent analyse i Analyseværktøjer menu.
    6. Vælg det menneskelige B celler til plasmaceller datasæt og grupper af interesse.
    7. Indsætte en liste over gener af interesse eller Vælg gener efter afvigelsen. Indsætte en liste over gener, skal du vælge for at analysere en liste over gener/klarlægning, klik her... Genomicscape vil beregne PCA, der kunne visualiseres og downloadet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den generelle procedure af in vitro-normal PC differentiering er repræsenteret i figur 1. Ved hjælp af protokollen præsenteres her, kan vi generere tilstrækkelig mængde af celler, der ikke kunne opnås med ex vivo menneskelige prøver. Selv om rollen, de komplekse netværk af transskriptionsfaktorer involveret i PC differentiering er blevet undersøgt, forbliver de mekanismer, der regulerer nøgle PC differentiering transskription netværk dårligt kendt. Celledifferentiering er for det meste drevet af epigenetiske og transcriptional ændringer. Brug vores in vitro-model og B til PC GEP atlas, undersøgte vi udtryk ændringer i de epigenetiske faktorer i normal plasma Celledifferentiering.

Epigenetiske faktor udtryk i normal plasma Celledifferentiering
Vi defineret som epigenetiske faktorer der tilhører følgende familier: DNA methyltransferases (DNMT), methyl-CpG-bindende domæne (MBD) proteiner, Histon acetyltransferases (HAT), Histon deacetyltransferase (HDAC), Histon methyltransferases (HMT) og Histon demethylases (HDM) som tidligere beskrevet for kræft celler16 (tillægstabel 1). Vi undersøgte den epigenetiske faktorer varierende udtrykt under PC differentiering ved hjælp af vores in vitro-model, renset modne knoglemarv pc'er (BMPCs) og "B til PC atlas" tilgængelige ved hjælp af GenomicScape webtool (figur 2). Med multi klasse SAM analyse fandt 71 gener væsentligt varierende mellem MBCs, PrePBs, PBs, tidlig pc'er og BMPCs med en falsk opdagelse sats < 5% (fig. 3A&3B og tillægstabel 2). MBC fase er kendetegnet ved overekspression af 23 epigenetiske spiller gener herunder 39.13% af Histon acetyltransferases (hatte), 30,43% af Histon methyltransferases (HMTs), 21.74% af Histon demethylases (HDMTs), 4,35% af methyl-bindende proteiner og 4,35% af HDAC'er (figur 4). 14 epigenetiske spillere var overexpressed specielt i den PrePBs fase herunder 50% af HMTs, 14.28% af DNMTs, 21.43% af HDAC'er, 7,14% af HDMTs og 7,14% af hatte (figur 3). PBs fase er kendetegnet ved overekspression af 5 epigenetiske spillere med 2 HDMTS, 2 HMTs og 1 DNMT. 4 epigenetiske spillere er overexpressed i tidlige pc'er (1 HDAC, 1 HAT, 1 HMT og 1 methyl bindende protein). I BMPCs var 10 epigenetiske faktorer specifikt overexpressed, herunder 50% af HMT (tillægstabel 2).

De vigtigste ændringer i epigenetiske faktor udtryk opstår under MBCs at PrePBs overgangen med en downregulation af 23 MBCs gener og opregulering af 14 PrePBs epigenetiske gener (figur 4). MBCs overexpressed betydeligt hatte involveret i posttranslationelle modifikationer af histoner. Histon acetylation påvirker kromatin struktur medførende decondensation af kromatin og øget transkription af gener, der er epigenetically til tavshed af kromatin jordpakning. MBCs til PrePBs overgang er også forbundet med en betydelig downregulation af hatte, et stort skift i HMTs udtryk og berigelse i HDAC'er og DNMTs genekspression. Det er interessant, er PrePB etape også karakteriseret ved overekspression af MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 er et sæt domæne indeholdende Histon lysin methyltransferase, der kan di- og trimethylate Histon H3 på lysin 36. MMSET er involveret i den gensidige t(4;14)(p16;q32) omplantning i en undergruppe af myelomatose, der er forbundet med dårlig prognose. Det blev rapporteret, at MMSET er involveret i DNA reparation regulering induktion af H4K20 methylering på histonerne omkring DNA dobbeltstrenget pauser, som til gengæld letter 53BP1 rekruttering17. PrePBs yderst prolifererende sammenlignet med MBCs med 50% af celler i S fase11 , PrePBs fase kunne være forbundet med en høj replicative stress. Overekspression af MMSET kunne deltage i forebyggelsen af replikering stress-induceret DNA skader i PrePBs.

PB og tidlige pc'er præsenteret lignende epigenetiske faktor udtryk profiler (figur 2). BMPCs er karakteriseret ved en bestemt overekspression af HMT og HDAC, der er relateret til Ig sekretion stress tilpasning herunder EHMT2 og HDAC6. Modne BMPCs har karakteristiske til synthetize og udskiller store mængder af antistoffer. Denne høje syntese af immunoglobuliner er forbundet med en fejlfoldede protein-induceret stress og udvikling af endoplasmatiske reticulum (ER) svar til at rumme denne produktion. Vores resultater viser store gen udtryk ændringer af epigenetiske faktorer, der kan spille en vigtig rolle under B til PC differentiering gennem epigenetiske-medieret omprogrammering begivenheder.

Figure 1
Figur 1 : In vitro plasma celle differentiering model. PC differentiering model sammenfatter de forskellige skridt i menneskelige PC generation. I et første skridt, hukommelse B-celler er først aktiveret for fire dage af CD40 ligand, oligodeoxynucleotides og cytokin kombination og differentiere i preplasmablasts. I et andet trin, er preplasmablasts tilskyndet til at differentiere i plasmablasts ved at fjerne CD40L og oligodeoxynucleotides stimulation og ændre cytokin kombination. I en tredje trin, er plasmablasts tilskyndet til at differentiere i tidlige plasma celler ved at ændre cytokin kombination11,12. En fjerde trin blev indført for at få fuldt modne plasmaceller ved dyrkning af disse tidlige plasmaceller med knoglemarv stromale celler eller SC aircondition medium og APRIL for to måneder13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Menneskelige PC differentiering model fremhæve CD20, CD38 og CD138 udtryk i pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) og plasma celler (pc'er), tillade rensning ved hjælp af celle sorteringsanlæg og Affymetrix gen expression profilering. GenomicScape webtool giver mulighed for at visualisere udtryk profil af en eller flere gener af interesse i B til PC differentiering datasæt og analysere varierende udtrykte gener mellem celle delpopulationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Multi klasse SAM analyse. Signaler af de 71 epigenetiske faktorer betydeligt varierende udtrykt under B til PC differentiering (SAM analyse; FDR < 0,05) i hukommelse B celler (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), tidlige plasmaceller (tidlig pc'er, n = 5) og normal knoglemarv plasmaceller (BMPCs, n = 5) vises fra lav (deep blue) til høj (dyb rød) udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 : Procentdel af epigenetiske gener, der tilhører DNMTs, methyl-CpG-bindende domæne (MethylBP) proteiner, Histon acetyltransferases (HAT), Histon deacetyltransferase (HDAC), Histon methyltransferases (HMT) og Histon demethylases kategorier betydeligt overexpressed i MBCs eller PrePBBs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I human, PC er sjældne celler med differentiering stadier finder sted i anatomiske steder, der hæmmer fuld biologiske karakterisering. Vi har udviklet en in vitro-B til PC differentiering model ved hjælp af flertrins kultur systemer hvor forskellige kombinationer af aktivering molekyler og cytokiner anvendes efterfølgende for at gengive sekventielle celle differentieringen forekommer i den forskellige organer/væv i vivo11,12,13.

Andre effektive in vitro-B til pc'er differentiering modeller blev rapporteret18,19. Modellen udviklet af Le Gallou et al. udforskede T-celle afhængige B til PC differentiering med en to-trins kultur metode med udgangspunkt i CD19+/CD27- naive B celler. Cocco et al. rapporterede en in vitro-model til at generere langlivede pc'er fra samlede B celler19. Vores strategi efterligner aktivering og differentiering sker i germinal center med CD40 og Toll-lignende receptor aktivering efterligne T-celle hjælp og antigen aktivering bruges i kombination med cytokiner produceret af dendritiske celler, makrofager og T hjælper . Aktivering med sCD40L og CpG ODN udbytter til generation af PrePBs, der er blevet identificeret i lymfeknuder, tonsiller og knoglemarv i menneskelige11,20. Denne overgangsfase er karakteriseret ved fravær af CD20, CD38 og CD138 markører og coexpression i B og PC TFs, men på et lavere niveau sammenlignet med B-celler, PBs, eller PC11. Denne overgangsfase er af særlig interesse, da det er forbundet til proteasom hæmmer modstand i myelomatose patienter20,21. Selv hvis pc'er kan oprettes uden IL-1518,19, IL-15 desuden fastsat, i vores hænder, optimeret resultater i generation af CD20-CD38++ celler på dag 411,12. Tilsætning af IL-21 ville være af særlig interesse for IL-21 fremmer PC differentiering gennem BLIMP induktion medieret af STAT3 aktivering som tidligere rapporteret19,22. Som rapporteret af Cocco et al. komplekse betingelser kultur indeholdende IL-21, IFN-α, IL6 og stromale celler-aircondition medium støtte generation af langlivede pc'er. Vi rapporterede, at langsigtede overlevelse af pc'er kunne støttes, in vitro-, ved hjælp af IL-6, APRIL og stromale celler-aircondition medium eller de to vækstfaktorer kun. Stromale celler producerer store PC vækstfaktorer, især IL-6 og galectin13,19,23,24,25 og opretholde interaktioner mellem hæmatopoietisk celler og pc'er26. APRIL er desuden en af de store vækst faktorer involveret i pc'er overlevelse, produceret af hæmatopoietisk celler27,28. For at undgå uensartethed relateret til forskellige kilder af stromale celler, blev Resto-6 stromale celler, udviklet og leveret af Karin Tarte lab, brugt mellem passager 8 og 1513,29. Resto-6 celler express CD90, CD73 og CD105 stromale celle-markører og støtte effektivt væksten i normal, og ondartet B celler29.

Imidlertid kunne en moderat heterogenitet observeres i andelen af aktiverede B-celler, PrePBs, PBs og pc'er afhængigt af sunde donorens blod anvendes til hukommelse B-celle rensning11,12,13. Den genererede langlivede pc'er ikke-cykling pc'er, overleve og producere immunoglobuliner for mere end tre måneder in vitro, som deres in vivo modstykke13. Langlivede pc'er udtrykke meget CD138 og gen expression profiler relateret til in vivo stk13. Desuden karakteriseret en højere ratio af splejset til unspliced XBP1 sammen med højere udtryk af IRF4 og PRDM1 pc'er transkriptionsfaktorer de langlivede pc'er fremstillet in vitro- i forhold til tidlige pc'er fås ved Dag 1013.

Det menes epigenetiske og transcriptional ændringer kontrollere cellulære overgange under udvikling. Men B-lymfocytter terminal differentiering til plasmaceller er en unik proces hvis epigenetiske ændringer forbliver stort set ukendt. Forhold til det, vi for nylig analyseret miRnome af normal PC differentiering og identificeret roman centrale miRNAs regulerer netværk af betydning for normale PC differentiering14. Vi viste, at flere miRNAs også kunne deltage i reguleringen af udtrykket af centrale transkriptionsfaktorer under PCD, herunder IRF4, PRDM1, ELL2 og ARID3A14. Forhold til det udvidet vi her karakterisering af epigenetiske relaterede gen profiler under B til PC differentiering ved hjælp af GenomicScape åbne platform. Denne tilgang tilladt os at identificere kromatin ændre enzym gener specifikt kommer til udtryk i de forskellige faser af PC differentiering. MBCs overexpressed betydeligt hatte kendt for at forårsage nuleosomal remodeling der udsætter transskription bindingssteder. Histon post-transcriptional ændringer, herunder Histon acetylation er blevet rapporteret i promotor-regionen i store B-celle TFs herunder PAX5, CIITA, SPIB og BCL630,31. Derudover proteom analyse viste, at CREBBP og EP300 (overexpressed i MBCs) interagere med BCL6 og kunne spille en rolle i det transkriptionel regulering af BCL632. PAX5, viste sig også at regulere target genekspression ved at rekruttere kromatin remodellering og Histon ændre proteiner33. Pax5 blev vist sig at fremkalde H3K4 methylering og H3K9 acetylation på initiativtagere deres aktiveret target gener33.

Store epigenetiske faktor GEP ændringer blev identificeret under MBCs at PrePBs overgangen med en større downregulation af hatte sammen med en forøgelse af HMTs udtryk og berigelse af HDAC'er og DNMTs genekspression. PrePB overgangsfase er en yderst prolifererende celle befolkning11. Efter at flere epigenetiske faktorer kendt for at være involveret i celle spredning kontrol herunder DNMT134, EZH235,36,37,38 og MMSET39,40 er blevet identificeret og kan være involveret i celle aktivering og spredning induktion i PrePB fase.

I slutstadiet af B til PC differentiering overexpressed BMPCs epigenetiske faktorer, herunder EHMT2 og HDAC6, kendt for at være involveret i ER stressrespons. ER og Golgi apparatet spiller en stor rolle i PC til at rumme syntesen af udskilles Ig. I blære kræftceller, EHMT2 hæmning stimulerer ER stress og inducerer apoptose41. HDAC6 hører til klasse 2b familie af HDAC-enzymerne. Det er kendt for at spille en rolle i protein homøostase og de ultraperifere regioners42,43 og HDAC6 hæmmere er testet i kliniske forsøg for at målrette maligne pc'er i myelomatose. Vores data understregning at epigenetiske faktorer kan spille en rolle i homøostase af langlivede Ig secernerende pc'er.

Bruger lentiviral vektorer og/eller specifikke hæmmere, kunne det være interessant at undersøge disse biologiske veje og kromatin ændre enzymer i kromatin remodeling, PC differentiering og funktioner som tidligere beskrevet af vores gruppe rolle 44.

Den viden, der er afledt af denne forskning kunne informere og instruere på diagnostiske og terapeutiske strategier for PC lidelser, som i tilfælde af myelomatose, en kræft uden en definitiv kur som bedre prognose og forbedret terapeutiske strategier er kritisk nødvendige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at videregive

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra franske INCA (Institut National du kræft) Institute (PLBIO15-256), ANR (slips-spring) og ITMO kræft (MM & TT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
  3. Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
  4. Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
  5. Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
  6. Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
  7. Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
  8. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  9. Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
  10. Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
  11. Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
  12. Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
  13. Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
  14. Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
  15. Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
  16. Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
  17. Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
  18. Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
  19. Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
  20. Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
  21. Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
  22. Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
  23. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
  24. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
  25. Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
  26. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
  27. Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
  28. Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
  29. Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
  30. Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
  31. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
  32. Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
  33. McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
  34. Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
  35. Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
  36. Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
  37. Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
  38. Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
  39. Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
  40. Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
  41. Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
  42. Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
  43. Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
  44. Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).

Tags

Immunologi og infektion udstede 143,
I Vitro differentiering Model af menneskets normale hukommelse B celler til langlivede plasmaceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jourdan, M., de Boussac, H.,… More

Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter