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Immunology and Infection

इन विट्रो में लंबे समय तक रहने वाले प्लाज्मा कोशिकाओं को मानव सामान्य स्मृति बी कोशिकाओं के भेदभाव मॉडल

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58929
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1IGH, CNRS, Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology, CHU Montpellier, 3UFR de Médecine, Univ Montpellier

Summary

बहु कदम संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करना, हम इन विट्रो बी सेल प्लाज्मा सेल भेदभाव मॉडल के लिए एक रिपोर्ट ।

Abstract

प्लाज्मा कोशिकाओं (पीसीएस) एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा में स्रावित और बी कोशिकाओं है कि सक्रिय किया गया है से विकसित । पीसी दुर्लभ अस्थि मज्जा या म्यूकोसा में स्थित कोशिकाओं और विनोदी उन्मुक्ति सुनिश्चित कर रहे हैं । उनके कम आवृत्ति और स्थान के कारण, पीसी का अध्ययन मानव में मुश्किल है । हम इन विट्रो भेदभाव मॉडल में पीसी के लिए एक बी की रिपोर्ट साइटोकिंस और सक्रियकरण अणुओं के चयनित संयोजनों कि vivo में होने वाली क्रमिक कोशिका भेदभाव पुन: पेश करने की अनुमति का उपयोग कर । इस में इन विट्रो मॉडल, स्मृति बी कोशिकाओं (MBCs) में अंतर होगा पूर्व plasmablasts (prePBs), plasmablasts (पंजाब), जल्दी पीसी और अंत में, लंबे समय में पीसी रहते थे, एक phenotype के साथ स्वस्थ व्यक्तियों में अपने समकक्षों के करीब। हम भी पीसी भेदभाव से संबंधित GEP डेटा से सबसे प्रमुख जानकारी का विश्लेषण करने के लिए एक खुला पहुँच bioinformatics उपकरण का निर्माण किया. इन संसाधनों के लिए मानव बी अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पीसी भेदभाव और वर्तमान अध्ययन में, हम मानव बी के दौरान epigenetic कारकों के जीन अभिव्यक्ति विनियमन पीसी भेदभाव के लिए जांच की ।

Introduction

प्लाज्मा कोशिकाओं (पीसीएस) के लिए बी कोशिकाओं के भेदभाव विनोदी उन्मुक्ति के लिए आवश्यक है और1संक्रमण के खिलाफ मेजबान की रक्षा करना । बी करने के लिए पीसी भेदभाव प्रतिलेखन क्षमता और चयापचय में बड़े बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है करने के लिए एंटीबॉडी स्राव को समायोजित । प्रतिलेखन कारकों है कि नियंत्रण बी पीसी भेदभाव करने के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और बी सहित विशेष नेटवर्क से पता चला और पीसी विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों (TFs)2। बी कोशिकाओं में, PAX5, BCL6 और BACH2 TFs बी सेल पहचान2,3के रखवालों हैं । IRF4की प्रेरण, PRDM1 एंकोडिंग BLIMP1 और XBP1 पीसी TF बी सेल जीन बुझाने और एक समंवित एंटीबॉडी-स्रावी सेल transcriptional कार्यक्रम3,4,5प्रेरित करेगा । इन समंवित transcriptional परिवर्तन ़ जीन प्रतिलेखन सक्रियकरण के साथ जुड़े रहे है झिल्ली से एक स्विच के साथ immunoglobulin भारी श्रृंखला2,3के गुप्त रूप में फार्म का एक साथ, 4. B करने के लिए पीसी भेदभाव endoplasmic जालिका में शामिल जीन की प्रेरण के साथ जुड़ा हुआ है और Golgi उपकरण के संश्लेषण को समायोजित करने से पीसी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है कि सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया (UPR) सक्रियण के साथ सहवर्ती कार्यों स्रावित इम्युनोग्लोबुलिन6,7. TF XBP1 इस सेलुलर अनुकूलन8,9,10में एक प्रमुख भूमिका निभाता है ।

बी कोशिकाओं और पीसी विनोदी उन्मुक्ति के प्रमुख खिलाड़ी हैं । जैविक प्रक्रियाओं है कि उत्पादन नियंत्रण और सामांय प्लाज्मा कोशिकाओं के अस्तित्व को समझना चिकित्सीय हस्तक्षेप है कि कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सुनिश्चित करने और प्रतिरक्षा या प्रतिरक्षा की कमी को रोकने की जरूरत में महत्वपूर्ण है । पीसी जल्दी अंतर शारीरिक स्थानों में जगह ले रही है कि पूर्ण जैविक लक्षण वर्णन, विशेष रूप से मानव में होने के चरणों के साथ दुर्लभ कोशिकाओं रहे हैं । बहु कदम संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करना, हम एक में सूचना दी है इन विट्रो बी पीसी विभेद मॉडल के लिए । यह मॉडल क्रमिक सेल भेदभाव और vivo11,12,13में विभिन्न अंगों में होने वाली परिपक्वता reproduces. पहले चरण में, स्मृति बी कोशिकाओं को पहले चार दिनों के लिए सक्रिय कर रहे हैं CD40 ligand, oligodeoxynucleotides और cytokine संयोजन और preplasmablasts (PrePBs) में अंतर. एक दूसरे चरण में, preplasmablasts CD40L और oligodeoxynucleotides उत्तेजना को हटाने और cytokine संयोजन को बदलने के द्वारा plasmablasts (पंजाब) में अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं । एक तीसरे चरण में, plasmablasts cytokine संयोजन11,12बदलकर जल्दी पीसी में अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं । एक चौथा कदम अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं वातानुकूलित मध्यम या चयनित विकास कारकों13के साथ इन जल्दी पीसी संवर्धन द्वारा पूरी तरह से परिपक्व पीसी पाने के लिए पेश किया गया था । ये परिपक्व पीसी इन विट्रो में कई महीनों जीवित रह सकता है और immunoglobulin (चित्रा 1) की उच्च मात्रा स्रावित । मजे की बात है, हमारे इन विट्रो मॉडल recapitulates समंवित transcriptional परिवर्तन और अलग बी के लिए पीसी चरणों कि vivo11,12,13,14 में पता लगाया जा सकता है की phenotype ,15. पीसी दुर्लभ कोशिकाओं रहे है और हमारे इन विट्रो भेदभाव मॉडल के लिए मानव बी अध्ययन करने की अनुमति देता है पीसी भेदभाव ।

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Protocol

प्रोटोकॉल हेलसिंकी और जैविक संसाधनों के लिए मोंटेपेल्लियर विश्वविद्यालय अस्पताल केंद्र के समझौते की घोषणा के अनुसार दिशा निर्देशों का पालन ।

1. इन विट्रो में सामान्य प्लाज्मा सेल विभेद मॉडल

नोट: पीसी एक चार कदम संस्कृति11,12,13के माध्यम से उत्पंन कर रहे हैं ।

  1. बी सेल प्रवर्धन और विभेद
    1. स्मृति बी सेल शुद्धि के लिए स्वस्थ स्वयंसेवकों से परिधीय रक्त कोशिकाओं का प्रयोग करें ।
    2. RPMI १६४० मध्यम के २४.५ मिलीलीटर के साथ रक्त की ७.५ मिलीलीटर पतला ।
    3. एक बाँझ ५० एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए कमरे के तापमान घनत्व ढाल (जैसे, Ficoll) की १२.५ मिलीलीटर जोड़ें । धीरे पतला रक्त की ३२ मिलीलीटर के साथ घनत्व ढाल ओवरले । दो चरणों के मिश्रण को कम करें ।
    4. ५०० एक्स जी में 20 मिनट के ब्रेक के साथ बंद केंद्रापसारक । पतला प्लाज्मा/घनत्व ढाल अंतरफलक से PBMCs लीजिए और एक बाँझ ५० मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं और जगह है हांक संतुलित नमक समाधान के साथ ४५ मिलीलीटर के लिए पूरा करें ।
    5. 5 मिनट के लिए ५०० x gपर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ध्यान से supernatant निकालें और गोली रखो ।
    6. RPMI1640/10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के ४५ मिलीलीटर जोड़ें और ५०० एक्स जीमें 5 मिनट के केंद्रापसारक ध्यान से supernatant निकालें और गोली रखो । //2% FCS के 30 मिलीलीटर जोड़ें ।
    7. विरोधी CD2 चुंबकीय मोतियों का उपयोग CD2 + कोशिकाओं को दूर. एक लक्ष्य कक्ष के लिए 4 मोती जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की मशीन ।
      1. सेल जुदाई आवेदन के लिए एक चुंबक का उपयोग कर असीम कोशिकाओं से अलग मनका-बाध्य कोशिकाओं । असीमित कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 15 मिनट के लिए विरोधी CD19 APC और विरोधी CD27 पीई एंटीबॉडी के साथ सेल गोली की मशीन 4 डिग्री सेल्सियस पर (एंटीबॉडी के 2 µ एल 106 कोशिकाओं के लिए) ।
      2. पंजाब/10% बकरी सीरम में दो बार धो लें ।
      3. FSC और एसएससी दोनों भूखंडों पर दूषित घटनाओं को दूर करें । मलबे को हटाने और कुल ल्युकोसैट जनसंख्या का चयन करने के लिए FSC-ए vs FSC-एच और ssc-a vs ssc-h भूखंड पर प्लाट singlets । CD19/CD27 और CD19+CD27+पर स्मृति B कक्षों का चयन करें ।
      4. शुद्ध MBCs एक ९५% शुद्धता के साथ एक सेल सॉर्टर का उपयोग कर ।
    8. IMDM और 10% FCS, ५० मिलीग्राम/एमएल मानव कैल्सीटोनिन और 5 मिलीग्राम/एमएल मानव इंसुलिन के साथ पूरक का उपयोग कर सभी संस्कृति चरणों का पालन करें ।
    9. प्लेट शुद्ध छह में MBCs अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट्स (१.५ x 105 MBCs/एमएल में 5 मिलीलीटर/4 दिनों के लिए, il-2 (20 U/एमएल), il-10 (५० एनजी/एमएल), और आईएल-15 (10 एनजी/एमएल) के साथ ।
      1. रिकॉमबिनेंट सक्रियण (चित्रा 1) के लिए Phosphorothioate CpG ODN २००६, histidine-tagged CD40L मानव घुलनशील sCD40L (polyhistidine; ५० एनजी/एमएल) और एंटी-मॉब MBCs (5 mg/ sCD40L या ODN द्वारा सक्रियण केवल एक ही cytokine कॉकटेल पैदावार के साथ कम प्रवर्धन करने के लिए12। सक्रियण संकेतों का संयोजन यहां वर्णित सक्रिय बी कोशिकाओं और PrePBs11,12 (चित्रा 1) की अधिकतम संख्या के लिए नेतृत्व किया ।
      2. जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए, CD38-/CD20- PrePBs, 4 दिन में शुद्ध, एक सेल सॉर्टर (चित्रा 2) का उपयोग कर ।
  2. Plasmablastic सेल जनरेशन
    1. 4 दिन में, कोशिकाओं गिनती ।
    2. प्लेट कोशिकाओं में 12-well कल्चर प्लेट्स में २.५ x 105/mL में 2 मिलीलीटर/
    3. CpG oligonucleotides और sCD40L और आईएल-2 (20 यू/एमएल) सहित एक नया cytokine कॉकटेल के साथ एक नई संस्कृति माध्यम के अलावा के हटाने से विभेद प्रेरित, il-6 (५० एनजी/एमएल), आईएल-10 (५० एनजी/एमएल) और आईएल-15 (10 एनजी/एमएल) (चित्रा 1) । 3 दिन के लिए संस्कृति कोशिकाओं (4 दिन से 7 दिन के लिए) ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    4. जीन की अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए, CD38+/CD20- पंजाबियों, 7 दिन में, एक सेल सॉर्टर (चित्रा 2) का उपयोग कर शुद्ध ।
  3. जल्दी प्लाज्मा सेल पीढ़ी
    1. 7 दिन में, कोशिकाओं गिनती ।
    2. प्लेट कोशिकाओं में 12-well कल्चर प्लेट्स में 5 x 105/mL में 2 मिलीलीटर/
    3. जल्दी पीसी में पंजाब अंतर il-6 (५० एनजी/एमएल), आईएल-15 (10 एनजी/एमएल) और IFN-α (५०० यू/एमएल) के साथ ताजा संस्कृति माध्यम का उपयोग ३७ ° c पर 3 दिनों के लिए । जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए, CD20-/CD38+/CD138+ जल्दी पीसी, 10 दिन में, एक सेल सॉर्टर (चित्रा 2) का उपयोग कर शुद्ध ।
  4. लंबे समय तक रहते थे प्लाज्मा सेल जनरेशन
    1. जल्दी पीसी में अंतर लंबे समय पीसी संस्कृति की स्थिति को बदलकर रहते थे ।
    2. कल्चर 12-वेल कल्चरल प्लेट्स में 5 x 105/mL में 2 मिलीलीटर/अच्छी तरह से या में 24-well कल्चर प्लेट्स में 1 मिलीलीटर/अच्छी तरह से ३७ ° c में, IL-6 और stromal सेल वातानुकूलित मध्यम और अप्रैल (२०० एनजी/
    3. संस्कृति माध्यम के साथ 5 दिनों के लिए stromal कोशिकाओं संवर्धन द्वारा stromal सेल वातानुकूलित माध्यम प्राप्त करें । फ़िल्टर stromal सेल कल्चर supernatant (०.२ µm) और फ़्रीज़ करें ।
    4. प्रत्येक सप्ताह नवीनीकरण के साथ PC संस्कृतियों के लिए stromal कक्ष-वातानुकूलित मीडिया का ५०% जोड़ें । जनरेट किया गया लंबे समय तक रहने वाले पीसी13महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है । पीसी के दीर्घकालिक अस्तित्व IL-6 और अप्रैल के साथ ही प्राप्त किया जा सकता है के रूप में13की सूचना दी ।
    5. माप ़ प्रवाह cytometry हल पीसी से स्राव ।
    6. संस्कृति पीसी पर 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए 24 एच और हार्वेस्ट कल्चर supernatant । माप आईजीजी और IgA मानव एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) किट11,12,13का उपयोग कर । माध्य आईजीजी स्राव से 10 स्नातकोत्तर/दिन में 10 से 17 स्नातकोत्तर/दिन ६०13पर सेल/प्रतिदिन ।

2. बी के आणविक एटलस करने के लिए पीसी भेदभाव

नोट: हम एक सुविधाजनक और खुला उपयोग bioinformatics उपकरण का निर्माण करने के लिए निकालने और Affymetrix GEP पीसी भेदभाव (GenomicScape) से संबंधित डेटा से सबसे प्रमुख जानकारी कल्पना15। GEP शुद्ध MBCs, PrePBs, पंजाबियों और ईपीसी सहित ArrayExpress डाटाबेस (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) से सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं: ई-MTAB-१७७१, ई-MEXP-२३६० और ई-MEXP-३०३४ और BMPC ई-MEXP-२३६०14,15. Genomicscape एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध webtool है ।

  1. PC dataset करने के लिए B का चयन
    1. GenomicScape ओपन एक्सेस bioinformatic उपकरण (http://www.genomicscape.com) मानव बी कोशिकाओं प्लाज्मा कोशिकाओं कोबुलाया में ब्राउज़ डेटा मेनू में पीसी dataset करने के लिए बी का चयन करें । अद्वितीय जीन या जीन की एक सूची के जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के दृश्य उपलब्ध विश्लेषण होम पेज में उपलब्ध उपकरण में अभिव्यक्ति-Coexpression रिपोर्ट उपकरण का उपयोग कर रहा है ।
  2. पर्यवेक्षण विश्लेषण और प्रिंसिपल घटक विश्लेषण (पीसीए)
    1. विश्लेषण उपकरण का चयन करें । webSAM SAM उपकरण लोड करने के लिए ।
    2. प्लाज्मा कोशिकाओं डेटासेट के लिए मानव बी कोशिकाओं का चयन और तुलना करने के लिए नमूनों के समूहों का चयन करें.
    3. रुचि के फ़िल्टरिंग विकल्प लागू करने के लिए उपलब्ध विभिन्न फ़िल्टर्स का उपयोग करें.
    4. सैम उपकरण के साथ जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की तुलना करने के लिए, मोड़ बदलने, परिवर्तन की संख्या, झूठी खोज दर और तुलना के प्रकार सहित फ़िल्टरिंग विकल्पों को संशोधित करें । GenomicScape विश्लेषण की गणना और जीन प्रदान करेगा विभेदक चयनित समूहों के बीच व्यक्त की ।
    5. विश्लेषण उपकरण मेनू में मुख्य घटक विश्लेषण का चयन करके मुख्य घटक विश्लेषण चलाएं ।
    6. प्लाज्मा कोशिकाओं डेटासेट के लिए मानव बी कोशिकाओं का चयन और ब्याज के समूहों का चयन करें ।
    7. रुचि के जीन की सूची चिपकाएं या विचरण के अनुसार जीन का चयन करें । जीन की एक सूची चिपकाने के लिए, जीन की सूची का विश्लेषण करने के लिए चुनें/ncRNAs, यहां क्लिक करें.... Genomicscape पीसीए की गणना करेगा कि visualized और डाउनलोड किया जा सकता है ।

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Representative Results

इन विट्रो में की समग्र प्रक्रिया सामान्य पीसी भेदभाव चित्रा 1में प्रतिनिधित्व किया है. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम कोशिकाओं है कि पूर्व vivo मानव नमूनों के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है की पर्याप्त मात्रा उत्पंन कर सकता है । हालांकि प्रतिलेखन पीसी भेदभाव में शामिल कारकों के जटिल नेटवर्क की भूमिका की जांच की गई है, प्रमुख पीसी भेदभाव प्रतिलेखन नेटवर्क विनियमन तंत्र खराब ज्ञात रहते हैं । सेलुलर भेदभाव ज्यादातर epigenetic और transcriptional परिवर्तन से प्रेरित है । हमारे इन विट्रो मॉडल का उपयोग करना और बी पीसी GEP एटलस के लिए, हम सामान्य प्लाज्मा सेल भेदभाव में epigenetic कारकों की अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच की ।

सामांय प्लाज्मा सेल भेदभाव में Epigenetic फैक्टर अभिव्यक्ति
हम निंनलिखित परिवारों से संबंधित epigenetic कारकों के रूप में परिभाषित: डीएनए methyltransferases (DNMT), मिथाइल-CpG-बाध्यकारी डोमेन (MBD) प्रोटीन, हिस्टोन acetyltransferases (HAT), हिस्टोन deacetylases (HDAC), हिस्टोन methyltransferases (एचएमटी) और हिस्टोन demethylases (HDM) के रूप में पहले कैंसर कोशिकाओं16 (अनुपूरकतालिका 1) के लिए वर्णित है । हम epigenetic कारकों विभेदक पीसी भेदभाव के दौरान व्यक्त की जांच हमारे इन विट्रो मॉडल का उपयोग कर, शुद्ध परिपक्व अस्थि मज्जा पीसी (BMPCs) और "बी करने के लिए पीसी एटलस" GenomicScape webtool (चित्रा 2) का उपयोग कर उपलब्ध है । बहु वर्ग सैम विश्लेषण का प्रयोग, हमने पाया ७१ जीन काफी अंतर MBCs, PrePBs, पंजाबियों, जल्दी पीसी और BMPCs के बीच एक झूठी डिस्कवरी दर के साथ 5% < (चित्रा 3एक& ३बी और अनुपूरकतालिका 2) । अति पिछड़े वर्ग चरण 23 epigenetic खिलाड़ी जीन के ३९.१३% हिस्टोन acetyltransferases (टोपी), हिस्टोन methyltransferases (HMTs), २१.७४% हिस्टोन demethylases (HDMTs), मिथाइल बाध्यकारी प्रोटीन के ४.३५% के ३०.४३% सहित के व्यक्त की विशेषता है और HDACs का ४.३५% (चित्रा 4) । 14 epigenetic खिलाड़ियों PrePBs चरण में विशेष रूप से HMTs के ५०%, DNMTs के १४.२८%, HDACs, HDMTs के ७.१४% और टोपी के ७.१४% (3 चित्रा) के २१.४३% सहित व्यक्त किया गया । पंजाबियों मंच 2 HDMTS, 2 HMTs और 1 DNMT के साथ 5 epigenetic खिलाड़ियों के एक्सप्रेस द्वारा प्रतिष्ठित है । 4 epigenetic खिलाड़ी जल्दी पीसी में (1 HDAC, 1 टोपी, 1 एचएमटी और 1 मिथाइल बाध्यकारी प्रोटीन) को अभिव्यक्त कर रहे हैं । BMPCs में 10 epigenetic कारक विशेष रूप से एचएमटी (अनुपूरकतालिका 2) के ५०% सहित व्यक्त किए गए थे ।

epigenetic फैक्टर अभिव्यक्ति में सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तन MBCs के दौरान 23 MBCs जीन और 14 PrePBs epigenetic जीन (चित्रा 4) के विनियमन के एक downregulation के साथ PrePBs संक्रमण के दौरान होते हैं । MBCs काफी histones के posttranslational संशोधनों में शामिल टोपी व्यक्त की है । हिस्टोन acetylation क्रोमेटिन क्रोमेटिन और जीन है कि epigenetically संकुचन द्वारा मौन क्रोमेटिन है की प्रतिलिपि बढ़ाने के परिणामस्वरूप संरचना को प्रभावित करता है । PrePBs संक्रमण के लिए MBCs भी टोपी की एक महत्वपूर्ण downregulation, HMTs अभिव्यक्ति और HDACs और DNMTs जीन अभिव्यक्ति में संवर्धन में एक प्रमुख बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है । दिलचस्प बात यह है कि PrePB स्टेज भी MMSET एचएमटी के एक् सप्रेस की विशेषता है । MMSET/WHSC1/NSD2 एक सेट डोमेन है जिसमें हिस्टोन lysine methyltransferase है जो trimethylate ३६ पर डि-और हिस्टोन H3 lysine कर सकता है । MMSET में शामिल है पारस्परिक टी (4; 14) (p16; q32) translocation में एकाधिक मायलोमा के एक उपसमूह है कि गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है । यह बताया गया कि MMSET डीएनए की मरंमत में शामिल है डीएनए डबल किनारा टूटता है, जो, बारी में, 53BP117भर्ती की सुविधा के आसपास histones पर H4K20 मिथाइल की प्रेरण विनियमन । PrePBs एस चरण11 में कोशिकाओं के ५०% के साथ MBCs की तुलना में अत्यधिक proliferating है सुझाव है कि PrePBs मंच एक उच्च प्रतिकृति तनाव के साथ जुड़ा हो सकता है । MMSET के PrePBs में पुनरावृत्ति तनाव प्रेरित डीएनए क्षति की रोकथाम में भाग ले सकता है ।

पंजाब और जल्दी पीसी समान epigenetic फैक्टर अभिव्यक्ति प्रोफाइल (चित्रा 2) प्रस्तुत किया । BMPCs एचएमटी और HDAC है कि EHMT2 और HDAC6सहित आइजी स्राव तनाव अनुकूलन से संबंधित है की एक विशेष एक्सप्रेस की विशेषता है । परिपक्व BMPCs synthetize और एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा में स्रावित करने के लिए विशेषता है । इम्युनोग्लोबुलिन के इस उच्च संश्लेषण एक प्रोटीन प्रेरित तनाव और endoplasmic जालिका (एर) के विकास के लिए इस उत्पादन को समायोजित प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है । हमारे परिणाम epigenetic कारकों के प्रमुख जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन है कि बी के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है प्रदर्शन epigenetic के माध्यम से पीसी भेदभाव-मध्यस्थता reprogramminging की घटनाओं ।

Figure 1
चित्रा 1 : इन विट्रो प्लाज्मा सेल भेदभाव मॉडल । पीसी भेदभाव मॉडल मानव पीसी पीढ़ी के विभिंन चरणों recapitulates । पहले चरण में, स्मृति बी कोशिकाओं को पहले चार दिनों के लिए सक्रिय कर रहे हैं CD40 ligand, oligodeoxynucleotides और cytokine संयोजन और preplasmablasts में अंतर. एक दूसरे चरण में, preplasmablasts CD40L और oligodeoxynucleotides उत्तेजना को दूर करने और cytokine संयोजन को बदलने के द्वारा plasmablasts में अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं । एक तीसरे चरण में, plasmablasts cytokine संयोजन11,12बदलकर जल्दी प्लाज्मा कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं । एक चौथा कदम अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं या अनुसूचित जाति वातानुकूलित मध्यम और दो महीने13के लिए अप्रैल के साथ इन जल्दी प्लाज्मा कोशिकाओं संवर्धन द्वारा पूरी तरह से परिपक्व प्लाज्मा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पेश किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : मानव पीसी भेदभाव मॉडल पर प्रकाश डाला CD20, CD38 और पूर्व में CD138 अभिव्यक्ति plasmablasts (prePBs), plasmablasts (पंजाब) और प्लाज्मा कोशिकाओं (पीसीएस) कि सेल सॉर्टर और Affymetrix जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा का उपयोग कर शुद्धि की अनुमति देते हैं । GenomicScape webtool को बी में एक या एक से अधिक ब्याज की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पीसी भेदभाव डेटा सेट करने के लिए कल्पना करने के लिए अनुमति देता है और अंतर कोशिका उपआबादी के बीच जीन व्यक्त की विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : बहु वर्ग सैम विश्लेषण । ७१ epigenetic कारकों के संकेतों काफी अंतर पीसी विभेदन के लिए बी के दौरान व्यक्त (सैम विश्लेषण; एफडीआर < ०.०५) स्मृति बी कोशिकाओं में (MBCs, एन = 5), preplasmablasts (PrePBs, एन = 5), plasmablasts (पंजाब, एन = 5), जल्दी प्लाज्मा कोशिकाओं (जल्दी पीसी, n = 5) और सामान्य अस्थि मज्जा प्लाज्मा कोशिकाओं (BMPCs, एन = 5) कम (गहरे नीले) से उच्च (गहरे लाल) अभिव्यक्ति प्रदर्शित कर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 : DNMTs, मिथाइल-CpG-बाइंडिंग डोमेन (MethylBP) प्रोटीन, हिस्टोन acetyltransferases (HAT), हिस्टोन deacetylases (HDAC), हिस्टोन methyltransferases (एचएमटी) और हिस्टोन demethylases श्रेणियों से संबंधित epigenetic जीन का प्रतिशत काफी MBCs या PrePBBs में व्यक्त । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक तालिका 1: कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक तालिका 2: कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

मानव में, पीसी भेदभाव शारीरिक स्थानों में जगह ले रही है कि पूर्ण जैविक लक्षण वर्णन में बाधा चरणों के साथ दुर्लभ कोशिकाओं रहे हैं । हम एक में विकसित किया है इन विट्रो बी करने के लिए पीसी विभेद मॉडल बहु का उपयोग-कदम संस्कृति प्रणालियों जहां सक्रियकरण अणुओं और साइटोकिंस के विभिंन संयोजनों के बाद क्रमिक कोशिका में उत्पंन अंतर को पुन: पेश करने के लिए लागू कर रहे है vivo11,12,13में विभिन्न अंगों/

अन्य इन विट्रो बी पीसीएस विभेद मॉडल के लिए18,19सूचना दी गई । Le Gallou एट अल द्वारा विकसित मॉडल एक दो कदम संस्कृति पद्धति CD19 से शुरू+/CD27- भोली बी कोशिकाओं के साथ पीसी भेदभाव करने के लिए टी-सेल निर्भर बी का पता लगाया । Cocco एट अल. रिपोर्ट एक इन विट्रो मॉडल में लंबे समय तक रहने वाले पीसी कुल बी कोशिकाओं से शुरू19उत्पंन करने के लिए । हमारी रणनीति सक्रियण और CD40 और टोल की तरह रिसेप्टर सक्रियण नकल उतार टी सेल मदद और प्रतिजन सक्रियण वृक्ष कोशिकाओं, मैक्रोफेज और टी हेल्पर द्वारा उत्पादित साइटोकिंस के साथ संयोजन में इस्तेमाल के साथ कीटाणु केंद्र में होने वाली अंतर नकल . sCD40L और CpG ODN पैदावार के साथ सक्रियकरण PrePBs है कि लिम्फ नोड्स, tonsil और मानव11,20में अस्थि मज्जा में पहचान की गई है की पीढ़ी के लिए । इस संक्रमणकालीन चरण CD20, CD38, और CD138 मार्करों और बी और पीसी TFs के coexpression के अभाव की विशेषता है, लेकिन बी कोशिकाओं, पंजाबियों, या पीसी11के साथ तुलना में एक कम स्तर पर । यह संक्रमणकालीन चरण विशेष ब्याज की है क्योंकि यह एकाधिक मायलोमा रोगियों में proteasome अवरोधक प्रतिरोध करने के लिए जुड़ा हुआ है20,21. भले ही पीसी आईएल के बिना उत्पंन किया जा सकता है 1518,19, il-15 इसके अलावा प्रदान की, हमारे हाथ में, CD20 की पीढ़ी में परिणामों को अनुकूलित-CD38+ + कोशिकाओं को दिन में 411,12। il-21 के अलावा विशेष ब्याज की होगी के बाद से il-21 ब्लींप प्रेरण STAT3 सक्रियण द्वारा मध्यस्थता के माध्यम से पीसी भेदभाव को बढ़ावा के रूप में पहले19,22की सूचना दी । के रूप में Cocco एट अल द्वारा की सूचना दी. IL-21, IFN-α, IL6 और stromal सेल से युक्त जटिल संस्कृति शर्तों-मध्यम लंबे समय तक रहने वाले पीसी की पीढ़ी का समर्थन । हमने बताया कि लंबे समय तक पीसी के अस्तित्व का समर्थन किया जा सकता है, इन विट्रो में, IL-6, अप्रैल और stromal सेल वातानुकूलित माध्यम या दो केवल वृद्धि कारकों का उपयोग कर । Stromal कोशिकाओं प्रमुख पीसी विकास कारकों का उत्पादन, विशेष रूप से IL-6 और galectin13,19,23,24,25 और टेम के बीच बातचीत को बनाए रखने कोशिकाओं और पीसीएस26। इसके अलावा, अप्रैल टेम कोशिकाओं27,28द्वारा उत्पादित, पीसी अस्तित्व में शामिल प्रमुख विकास कारकों में से एक है । stromal कोशिकाओं के विभिंन स्रोतों से संबंधित विविधता से बचने के लिए, Resto-6 stromal कोशिकाओं, विकसित और करीन है ठरते लैब द्वारा प्रदान की, मार्ग 8 और 1513,29के बीच इस्तेमाल किया गया । Resto-6 कोशिकाओं एक्सप्रेस CD90, CD73 और CD105 stromal सेल मार्करों और समर्थन कुशलतापूर्वक सामांय और घातक बी कोशिकाओं के विकास29।

हालांकि, एक उदारवादी विविधता सक्रिय बी कोशिकाओं के प्रतिशत में देखा जा सकता है, PrePBs, पंजाबियों और पीसी स्वस्थ दाता है रक्त स्मृति बी सेल शुद्धि के लिए इस्तेमाल के आधार पर11,12,13। उत्पंन लंबे समय तक रहते थे पीसी गैर सायक्लिंग पीसी, जीवित और इम्युनोग्लोबुलिन में अधिक से अधिक तीन महीनों के लिए निर्माण कर रहे है इन विट्रो, के रूप में उनके vivo समकक्ष13में । लंबे समय तक रहते थे पीसी उच्च CD138 और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में vivo पीसी13से संबंधित एक्सप्रेस । इसके अलावा, IRF4 और PRDM1 पीसी प्रतिलेखन कारकों की उच्च अभिव्यक्ति के साथ एक साथ ब्याह XBP1 को ब्याह के एक उच्च अनुपात लंबे समय से प्राप्त पीसी जल्दी पीसी की तुलना में इन विट्रो में प्राप्त की विशेषता दिन 1013.

यह सोचा है epigenetic और transcriptional परिवर्तन नियंत्रण सेलुलर संक्रमण विकास के दौरान । हालांकि, प्लाज्मा कोशिकाओं में बी लिम्फोसाइटों के टर्मिनल भेदभाव एक अनोखी प्रक्रिया है जिसका epigenetic संशोधनों को मोटे तौर पर अज्ञात रहते हैं । उस के अनुसार, हम हाल ही में सामांय पीसी भेदभाव के miRnome विश्लेषण और उपंयास कुंजी miRNAs सामांय पीसी भेदभाव14के लिए महत्व के नेटवर्क विनियमन की पहचान की । हमें पता चला कि कई miRNAs भी PCD के दौरान प्रमुख प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति के विनियमन में भाग लेने, IRF4, PRDM1, ELL2 और ARID3A14सहित सकता है । उस के अनुसार, हम यहां बी के दौरान epigenetic संबंधित जीन प्रोफाइल के लक्षण GenomicScape ओपन एक्सेस मंच का उपयोग कर पीसी भेदभाव करने के लिए विस्तारित । इस दृष्टिकोण हमें क्रोमेटिन संशोधित एंजाइम जीन विशेष रूप से पीसी भेदभाव के विभिंन चरणों में व्यक्त की पहचान करने के लिए अनुमति दी । MBCs काफी nuleosomal remodeling है कि प्रतिलेखन बंधन साइटों को उजागर कारण जाना टोपी व्यक्त की है । हिस्टोन पोस्ट-transcriptional संशोधन, जिनमें हिस्टोन acetylation प्रमुख बी सेल TFs के प्रवर्तक क्षेत्र में सूचित किया गया है जिसमें PAX5, CIITA, SPIB और BCL630,31शामिल हैं । इसके अलावा, proteomic विश्लेषण प्रदर्शन किया है कि CREBBP और EP300 (MBCs में व्यक्त) BCL6 के साथ बातचीत और transcriptional३२के BCL6 विनियमन में एक भूमिका निभा सकता है । PAX5, भी क्रोमेटिन remodeling और हिस्टोन संशोधित प्रोटीन३३भर्ती द्वारा लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को विनियमित दिखाया गया था । Pax5 को उनके सक्रिय लक्ष्य३३जीन के प्रवर्तकों पर H3K4 मिथाइल और H3K9 acetylation के लिए प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था ।

प्रमुख epigenetic फैक्टर GEP परिवर्तन MBCs के दौरान downregulation अभिव्यक्ति और HMTs और HDACs जीन अभिव्यक्ति की समृद्धता में वृद्धि के साथ टोपी की एक प्रमुख DNMTs के साथ PrePBs संक्रमण की पहचान की गई । संक्रमणकालीन PrePB अवस्था एक अत्यधिक proliferating सेल जनसंख्या11है । उसके अनुसार, कई epigenetic कारकों ज्ञात DNMT1३४, EZH2३५,३६,३७,३८ और MMSET३९,४० सहित सेल प्रसार नियंत्रण में शामिल करने के लिए की पहचान की गई है और PrePB चरण के दौरान सेल सक्रियण और प्रसार प्रेरण में शामिल किया जा सकता है ।

पीसी भेदभाव करने के लिए बी के अंत चरण में, BMPCs EHMT2 और HDAC6, एर तनाव प्रतिक्रिया में शामिल होने के लिए जाना जाता सहित epigenetic कारकों को व्यक्त किया । ईआर और Golgi तंत्र पीसी में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए गुप्त आइजी के संश्लेषण को समायोजित । मूत्राशय कैंसर की कोशिकाओं में, EHMT2 निषेध एर तनाव को उत्तेजित करता है और apoptosis४१लाती है । HDAC6 HDACs के वर्ग बी के परिवार के अंतर्गत आता है । यह प्रोटीन homeostasis में एक भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है और UPR४२,४३ और HDAC6 अवरोधकों कई मायलोमा में घातक पीसी को लक्षित करने के लिए नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण कर रहे हैं । हमारे डेटा रेखांकित करते है कि epigenetic कारकों लंबे समय तक रहने वाले ़ गुप्त पीसी के homeostasis में एक भूमिका निभा सकता है ।

lentiviral वैक्टर और/या विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग करना, यह इन जैविक रास्ते की भूमिका की जांच करने के लिए दिलचस्प हो सकता है और पहले हमारे समूह द्वारा वर्णित के रूप में क्रोमेटिन remodeling, पीसी भेदभाव और कार्यों में एंजाइमों को संशोधित क्रोमेटिन ४४.

इस शोध से व्युत्पंन ज्ञान को सूचित और पीसी विकारों के लिए नैदानिक और चिकित्सीय रणनीतियों पर निर्देश सकता है, ऐसे कई मायलोमा के मामले में, एक निश्चित इलाज के बिना एक कैंसर के लिए जो बेहतर पूर्वानुमान और सुधार चिकित्सकीय रणनीतियों के रूप में क्रिटिकल की जरूरत होती है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

इस काम के लिए फ्रेंच इंका (Institut नेशनल ड्यूल कैंसर) इंस्टीट्यूट (PLBIO15-256), ANR (टाई-स्किप) और ITMO कैंसर (एमएम & टीटी) से अनुदान का समर्थन किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३,
इन विट्रो में लंबे समय तक रहने वाले प्लाज्मा कोशिकाओं को मानव सामान्य स्मृति बी कोशिकाओं के भेदभाव मॉडल
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Jourdan, M., de Boussac, H.,… More

Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).

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