Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58929

Summary

С помощью системы многоступенчатого культуры, мы доклад в vitro клетки B модели дифференцировки клеток плазмы.

Abstract

Клетки плазмы (шт) выделяют большое количество антител и развиваются из клеток B, которые были активированы. Компьютеры являются редкие клеток, расположенных в костный мозг или слизистую оболочку и обеспечить гуморального иммунитета. Из-за их низкой частоты и местоположение, трудно изучение ПК в человека. Мы сообщили B для ПК модель в пробирке дифференциации, с использованием выбранных комбинаций цитокинов и активация молекул, которые позволяют воспроизводить последовательный клеточная дифференцировка, происходящих в естественных условиях. В этой модели в пробирке, памяти, клетки B (MBCs) будет дифференцироваться в предварительно plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), рано ПК и наконец, в долгоживущих ПК, с фенотипом близко к их коллег в здоровых индивидуалах. Мы также построили открытый доступ Биоинформатика инструменты для анализа наиболее известных информации от GEP данные, относящиеся к ПК дифференциации. Эти ресурсы могут использоваться для изучения человека B ПК дифференциации и в текущем исследовании, мы исследовали регулирование выражение гена эпигенетических факторов во время человека B PC дифференциации.

Introduction

Дифференцировки лимфоцитов в плазматические клетки (шт) имеет важное значение для гуморального иммунитета и защиты узла против инфекций1. B для PC дифференциация ассоциируется с значительные изменения в транскрипции потенциала и метаболизм для размещения до антитела секрецию. Факторы транскрипции, которые контролируют Б PC дифференциации широко изучены и выявлены эксклюзивные сетей, в том числе B - и PC-определенного транскрипции факторы (TFs)2. В B-клеток PAX5, BCL6 и BACH2 TFs являются хранителями клетки B личность2,3. Индукции IRF4, PRDM1 кодировки BLIMP1 и XBP1 PC TF будет потушить B клетки генов и побудить скоординированного антитела секретирующих клеток транскрипционный анализ программы3,4,5. Эти скоординированные транскрипционный анализ изменения связаны с активацией транскрипции генов Ig вместе с переход от мембраны Присоединенная форма выделяется форму иммуноглобулин тяжелые цепи2,3, 4. B PC дифференциации связан с индукции генов, участвующих в эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи функции сочетанной с активацией ответ (УНР) разворачивались белка известен играть ключевую роль в ПК путем размещения синтез выделяется иммуноглобулины6,7. TF XBP1 играет важную роль в этой клеточной адаптации8,9,10.

B клетки и ПК являются ключевыми игроками гуморального иммунитета. Понимание биологических процессов, управления, производства и выживания нормальных клеток плазмы имеет решающее значение в терапевтических вмешательств, которые нужны для обеспечения эффективного иммунного ответа и предотвратить аутоиммунных заболеваний или иммунодефицит. PC являются редкими клетки с ранних стадиях дифференцировки происходящих в анатомических местах, которые препятствуют полной биологических характеристик, особенно в человека. С помощью системы многоступенчатого культуры, мы сообщали в пробирке B PC дифференциация модели. Эта модель воспроизводит последовательных ячеек дифференцировки и созревания, происходящих в различных органах в vivo11,12,13. В качестве первого шага клетки памяти B сначала активируются для четырех дней CD40 лиганд, oligodeoxynucleotides и цитокина комбинации и дифференцироваться в preplasmablasts (PrePBs). В качестве второго шага preplasmablasts вынуждены дифференцироваться в plasmablasts (PBs) путем удаления CD40L и oligodeoxynucleotides стимуляции и изменения цитокинов комбинации. В качестве третьего шага plasmablasts вынуждены дифференцироваться в начале ПК, изменив цитокина сочетание11,12. Четвертый шаг был введен получить полностью зрелые ПК путем культивирования этих ранних ПК с костного стромальные клетки кондиционером среднего или выбранные факторы роста13. Эти пожилые ПК могут выжить несколько месяцев в пробирке и выделяют большое количество иммуноглобулина (рис. 1). Интересно, что наши экстракорпоральное моделью резюмирует скоординированных transcriptional изменений и фенотип различных B PC этапов, которые могут быть обнаружены в естественных условиях11,12,13,14 ,15. Компьютеры являются редкие клетки и наша модель в пробирке дифференциация позволяет изучить человека B PC дифференциации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол придерживается руководящих принципов, в соответствии с Хельсинкской декларации и соглашения центра больницы университета Монпелье биологических ресурсов.

1. в Vitro нормальной клетки плазмы дифференциация модели

Примечание: Компьютеры создаются через четыре этапа культуры11,12,13.

  1. B клетки усилители и дифференциация
    1. Используйте периферийные клетки крови от здоровых добровольцев для памяти клетки B очистки.
    2. Разбавьте 7,5 мл крови с 24,5 мл RPMI 1640 среды.
    3. Добавьте 12,5 мл градиент плотности комнатной температуры (например, Ficoll) в стерильных 50 мл Конические трубки. Аккуратно наложение градиента плотности с 32 мл разбавленной крови. Минимуму смешивания двух этапов.
    4. Центрифуга 20 мин на 500 x g с тормозом выкл. Сбор получения от интерфейса градиента разбавленной плазмы/плотность и место клетки в стерильных 50 мл трубки и завершить до 45 мл с Хэнка сбалансированного солевого раствора.
    5. Центрифуга клетки для 5 мин на 500 x g. Тщательно удалить супернатант и держать гранулы.
    6. В 500 x gдобавьте 45 мл сыворотки RPMI1640/10% плода теленка (FCS) и центрифуги 5 мин. Тщательно удалить супернатант и держать гранулы. Добавьте 30 мл PBS/2% FCS.
    7. Удаление CD2 + клеток с помощью анти CD2 магнитные бусы. Добавьте 4 Бусины для одной целевой ячейки. Инкубируйте 30 мин при 4 ° C.
      1. Отдельные шарик прыгните клетки от свободных клеток с помощью магнита для клетки разделения приложения. Собирать свободные клетки и клетки лепешка с анти CD19 APC и анти CD27 PE антитела Инкубируйте 15 минут при температуре 4 ° C (2 мкл антител для 106 клеток).
      2. Мыть два раза в PBS/10% козьего сыворотки.
      3. Удаление загрязняющих события на FSC и SSC участках. Участок фуфайки на FSC-A против FSC-H и SSC-A против SSC-H участков для удаления мусора и выбрать общий лейкоцитарный населения. Выбор ячейки памяти B CD19/CD27 и CD19+CD27+.
      4. Очищайте многобайтовой кодировки с помощью сортировщика ячейки с 95% чистоты.
    8. Выполните все культуры с использованием IMDM и 10% FCS, дополнена 50 мг/мл трансферрина и 5 мг/мл человеческого инсулина человека.
    9. Пластина очищенного MBCs в шести ну культуры пластин (1,5 x 105 MBCs/мл в 5 мл/хорошо), 4 дней, с Ил-2 (20 ед/мл), Ил-10 (50 нг/мл) и IL-15 (10 нг/мл).
      1. Добавить, гистидин тегами рекомбинантного человеческого растворимого CD40L фосфоротиоат CpG ODN 2006 (sCD40L; 50 нг/мл) и анти polyhistidine МАБ (5 мг/мл) для активации MBCs (рис. 1). Активация sCD40L или ODN только с же цитокина коктейль урожайности ниже амплификации12. Комбинация активации сигналов описанных здесь этилированного максимальное количество активации лимфоцитов и PrePBs11,12 (рис. 1).
      2. Для профилирования выражение генов, очистит CD38 /CD20 PrePBs, в день 4, используя сортировщик клеток (рис. 2).
  2. Поколения Plasmablastic клетки
    1. На 4 день подсчитать количество ячеек.
    2. Плита клетки в 12-ну культуры пластин на 2,5 x 105/мл в 2 мл/хорошо.
    3. Вызвать дифференциации, удаление CpG олигонуклеотиды и sCD40L и добавлением новой питательной среды с новой цитокина коктейль, включая Ил-2 (20 ед/мл), Ил-6 (50 нг/мл), Ил-10 (50 нг/мл) и Ил-15 (10 нг/мл) (рис. 1). Культура клетки для 3 дней (от дня 4 до 7 день) при 37 ° C.
    4. Для профилирования выражение генов, очистит CD38+/CD20 PBs, день 7, с помощью сортировщика клеток (рис. 2).
  3. Ранние поколения клетки плазмы
    1. На 7 день подсчитать количество ячеек.
    2. Плиты клетки в 12-ну культуры пластин на 5 x 105/мл в 2 мл/хорошо.
    3. Дифференцировать PB в начале ПК с использованием свежей питательной среды с ИЛ-6 (50 нг/мл), IL-15 (10 нг/мл) и ИФН α (500 ед/мл) в течение 3 дней при 37 ° C. Для профилирования выражение генов, очистит CD20/CD38+/CD138+ начале ПК, на день 10, используя сортировщик клеток (рис. 2).
  4. Поколение долгоживущих клеток плазмы
    1. Дифференцировать ранних ПК в долгой историей ПК путем изменения условий культуры.
    2. Культура клетки в 12-ну культуры пластин на 5 x 105/мл в 2 мл/хорошо или в 24-ну культуры пластин в 1 мл/хорошо при 37 ° C, с помощью ИЛ-6 и стромальных клеток кондиционером среднего и апреле (200 нг/мл).
    3. Получите стромальные клетки кондиционером среднего путем культивирования стромальных клеток на 5 дней с питательной среды. Фильтр супернатанта культуры стромальных клеток (0,2 мкм) и заморозить.
    4. Добавьте 50% стромальных клеток кондиционером СМИ PC культур с обновления каждую неделю. Сгенерированный PCs long-lived можно сохранить для13месяцев. Долгосрочной перспективе выживание ПК могут быть получены с ИЛ-6 и апреле только как сообщалось13.
    5. Мера Ig секрета из проточной цитометрии сортировка шт.
    6. Культура ПК на 106 клеток/мл за 24 часа и урожай культуры супернатант. Измерьте IgG и IgA, используя человека иммуноферментного анализа (ИФА) наборы11,12,13. Средний секрецию IgG, варьировались от 10 ПГ/Мобильный/день в день 10-17 pg/клеток/день на день 6013.

2. молекулярные Атлас b к дифференциации ПК

Примечание: Мы создали удобный и открытого доступа Биоинформатика инструменты для извлечения и визуализировать наиболее известных информацию от Affymetrix GEP данные, относящиеся к PC дифференцировки (GenomicScape)15. GEP публично доступны из базы данных ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), включая очищенный MBCs, PrePBs, PBs и Пэк: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 и E-MEXP-3034 и BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape является webtool свободно доступны.

  1. Выбор B ПК набор данных
    1. B выберите набор данных ПК в меню Просмотреть данные в GenomicScape открытого доступа bioinformatic инструмент (http://www.genomicscape.com) под названием человека лимфоцитов в плазматические клетки. Визуализация профиль выражение гена уникальных гена или список генов доступен, с помощью средства Отчетов выражения-ИССЛЕДОВАНИџ в Инструменты анализа имеющихся на домашней странице.
  2. Под наблюдением анализ и анализ главных компонент (PCA)
    1. Выберите инструменты анализа | webSAM для загрузки средство SAM.
    2. Выберите набор данных, человека лимфоцитов в плазматические клетки и выберите группы образцов для сравнения.
    3. Используйте различные фильтры для применить параметры фильтрации интерес.
    4. Чтобы сравнить профили выражение гена с Сэм инструмент, измените параметры фильтрации, включая изменение раза, количество перестановок, ложные обнаружения скорость и тип сравнения. GenomicScape будет вычислять анализ и предоставлять гены, дифференциально выразил между выбранным группам.
    5. Запустите анализ главных компонентов, выбрав в меню Инструменты анализа Анализ основных компонентов .
    6. Выберите набор данных человека лимфоцитов в плазматические клетки и групп интересов.
    7. Вставьте список генов интерес или выберите генов по дисперсии. Чтобы вставить список генов, выберите анализировать список генов/ncRNAs, нажмите здесь... Genomicscape будет вычислять СПС, которые могут быть визуализированы и загружены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Общая процедура экстракорпорального нормальный PC дифференциации представлена на рисунке 1. С использованием протокола, представленные здесь, мы могли бы генерировать достаточное количество клеток, которые не могут быть получены с ex vivo человека образцы. Хотя исследована роль сложной сети транскрипционных факторов, участвующих в PC дифференциации, механизмы, регулирующие Ключевые PC дифференциация транскрипции сети остаются плохо известных. Клеточной дифференциации главным образом обусловлен эпигеномные и transcriptional изменений. Используя наши экстракорпоральное моделью и B для PC GEP Атлас, мы исследовали изменения выражения эпигенетических факторов в нормальных клеток плазмы.

Эпигеномные фактор выражение в нормальных клеток плазмы
Мы определили как эпигенетических факторов, относящихся к следующим семьям: ДНК methyltransferases (DNMT), метил CpG связывающий домен (MBD) белков, гистона acetyltransferases (шляпы), комплексы гистонов (HDAC), гистона methyltransferases (HMT) и гистона demethylases (HDM), как описано для рака клеток16 (ДополнительнаяТаблица 1). Мы исследовали эпигенетических факторов дифференциально выразил во время дифференциация ПК, используя наши в пробирке модель, очищенный Зрелые костного ПК (BMPCs) и доступны с помощью «B для PC Атлас» GenomicScape webtool (рис. 2). С помощью анализа Сэм мульти класса, мы нашли 71 генов значительно дифференциально между MBCs, PrePBs, PBs, раннего ПК и BMPCs с частотой ложных обнаружения < 5% (рис. 3A&3B и ДополнительнаяТаблица 2). MBC стадия характеризуется гиперэкспрессия 23 эпигеномные игрок генов, в том числе 39,13% гистона acetyltransferases (шляпы), 30,43% гистона methyltransferases (HMTs), 21.74% гистона demethylases (HDMTs), 4,35% бромистого связывания белков и 4.35% гда (рис. 4). 14 эпигеномные игроков были оверэкспрессировали специально на PrePBs этапе, включая 50% HMTs, 14,28% DNMTs, 21.43% гда, 7.14% HDMTs и 7.14% шляпы (рис. 3). PBs этап характеризуется гиперэкспрессия 5 эпигеномные игроков с 2 HDMTS, 2 HMTs и 1 DNMT. 4 эпигеномные игроков оверэкспрессировали в начале шт (1 HDAC, 1 шляпа, 1 HMT и 1 метил белок). В BMPCs 10 эпигенетических факторов были специально гиперэкспрессия, включая 50% HMT (ДополнительнаяТаблица 2).

Наиболее важные изменения в выражении эпигенетических факторов возникают во время MBCs PrePBs переход с Даунрегуляция 23 MBCs генов и upregulation 14 PrePBs эпигеномные генов (рис. 4). MBCs значительно оверэкспрессировали шляпы, участвующих в Посттрансляционная модификации гистонами. Ацетилирование гистона влияет на структуру хроматина приводит к decondensation хроматина и увеличивая транскрипцию генов, которые подавляются эпигеномно хроматина уплотнения. MBCs PrePBs переход связана также с значительным Даунрегуляция шляпы, крупный сдвиг в HMTs выражение и обогащения в гда и DNMTs экспрессии генов. Интересно, что PrePB стадия характеризуется также гиперэкспрессия MMSET HMT. MMSET/WHSC1/NSD2 — это набор домен, содержащий гистона лизин метилтрансфераза, который может гистонов H3 ди - и trimethylate в лизине 36. MMSET участвует в взаимные t(4;14)(p16;q32) транслокации в подгруппе множественной миеломы, которая связана с плохим прогнозом. Было сообщено, что MMSET участвует в репарации ДНК, регулирующих индукции H4K20 метилирование на гистонами вокруг разрывы двойной нити ДНК, которая, в свою очередь, облегчает 53BP1 набора17. PrePBs высоко множатся по сравнению с многобайтовой кодировки с 50% клеток в S фазе11 , предполагая, что на PrePBs этапе могут быть связаны с высокой репликативной стресса. Сверхэкспрессия MMSET могут участвовать в предотвращении репликации стресс индуцированного повреждения ДНК в PrePBs.

PB и начале ПК представил аналогичный эпигеномные фактор выражение профилей (рис. 2). BMPCs характеризуются конкретные гиперэкспрессия HMT и HDAC, которые связаны с Ig секрецию стресс адаптации, включая EHMT2 и HDAC6. Зрелые BMPCs имеют характерную для synthetize и выделяют большое количество антител. Этот высокий синтез иммуноглобулинов ассоциируется с смятых белка индуцированной стрессом и развития эндоплазменный ретикулум (ER) ответ для размещения этого производства. Наши результаты показывают изменения выражения гена основных эпигенетических факторов, которые могут играть важную роль во время Б дифференциации PC через эпигенетические опосредованной перепрограммирования события.

Figure 1
Рисунок 1 : Модель дифференциации In vitro клетки плазмы. Модель PC дифференциация воспроизводятся различные этапы человеческого поколения ЭВМ. В качестве первого шага клетки памяти B сначала активируются для четырех дней CD40 лиганд, oligodeoxynucleotides и цитокина комбинации и дифференцироваться в preplasmablasts. В качестве второго шага preplasmablasts вынуждены дифференцироваться в plasmablasts путем удаления CD40L и oligodeoxynucleotides стимуляции и изменения цитокинов комбинации. В качестве третьего шага plasmablasts вынуждены дифференцироваться в начале клетки плазмы, изменив цитокина сочетание11,12. Четвертый шаг был введен для получения полностью зрелые клетки плазмы путем культивирования этих ранних клеток плазмы с стромальных клеток костного мозга или SC кондиционером среднего и апреле за два месяца13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Модель дифференциация человека ПК, подчеркнув CD20, CD38 и CD138 выражение в предварительно plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) и плазматических клеток (шт.), которые позволяют очистки с использованием клеток сортировщик и профилирование выражение гена Affymetrix. GenomicScape webtool позволяет визуализировать выражение профиль одного или нескольких генов интерес в B для PC дифференциация набор данных и анализировать дифференциально выраженной генов между субпопуляциями ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Анализ многолетних класса Сэм. Сигналы 71 эпигенетических факторов, значительно дифференциально выразил во время Б PC дифференциации (Сэм анализ; FDR < 0,05) в ячейки памяти B (MBCs, n = 5), preplasmablasts (PrePBs, n = 5), plasmablasts (PB, n = 5), ранние плазматические клетки (ранних ПК, n = 5) и нормального костного плазматические клетки (BMPCs, n = 5) отображаются от низкого (синий) до высокого (глубокий красный) выражение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 4
Рисунок 4 : Процент эпигеномные генов, принадлежащих к DNMTs, метил CpG связывающий домен (MethylBP) белки, гистона acetyltransferases (шляпы), комплексы гистонов (HDAC), гистона methyltransferases (HMT) и гистона demethylases категорий значительно оверэкспрессировали в многобайтовой кодировке или PrePBBs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительная таблица 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В человека PC являются редкими клетки с этапами дифференцировки происходящих в анатомических местах, которые препятствуют полной биологической характеристике. Мы разработали в пробирке B PC дифференциация модель с использованием культуры многоступенчатой системы, где различные комбинации активации молекулы и цитокины впоследствии применяются для того, чтобы воспроизвести последовательный клеточная дифференцировка, происходящих в различных органов/тканей в vivo11,12,13.

Другие эффективные в пробирке B ПК дифференциации моделей были сообщил18,19. Модель, разработанная Le Gallou et al. PC дифференциации изучить зависимого B Т-клеток с использованием методологии двухэтапный культуры, начиная от CD19+/CD27 наивный B клеток. Cocco et al. сообщили в пробирке модель для создания долгоживущих ПК, начиная от общей клетки B19. Наша стратегия имитирует активации и дифференциации, происходящих в зародышевого центра с CD40 и Толл подобные рецепторы активации, подражая справки и антиген активации Т-клеток в сочетании с цитокинами, производимые дендритные клетки, макрофаги и T вспомогательный . Активация с sCD40L и CpG ODN уступает поколения PrePBs, которые были определены в лимфатические узлы, миндалин и костного мозга человека11,20. Этот переходный этап характеризуется отсутствием CD20, CD38 и CD138 маркеры и ИССЛЕДОВАНИџ B и PC TFs, но на более низком уровне по сравнению с B-клетками, PBs, или PC11. Этот переходный этап представляет особый интерес, поскольку это связано сопротивление ингибитором протеасом в20,больных множественной миеломой21. Даже если ПК может быть создан без Ил-1518,19, IL-15 Кроме того, предусмотрено, в наших руках, оптимизированные результаты в поколение CD20CD38++ клеток на 4 день11,12. Добавление ил-Век бы особый интерес, поскольку Ил-21 дифференцировку PC через BLIMP индукции при посредничестве STAT3 активации как сообщалось ранее,19,22. Как сообщает Cocco et al. комплекс культуры условия содержащих Ил-21, ИФН α, IL6 и стромальных клеток кондиционером средних поддержки поколения long-lived PCs. Мы сообщили, что долгосрочное выживание ПК может быть поддерживается, в пробирке, используя ИЛ-6, апреле и стромальных клеток кондиционером среднего или только двух факторов роста. Стромальные клетки производят основные факторы роста PC, особенно ИЛ-6 и galectin13,19,23,24,25 и поддержания взаимодействия между гемопоэтических клетки и26шт. Кроме того Апрель является одним из основных факторов роста в ПК выживания, производимые гемопоэтических клеток27,28. Чтобы избежать разнородности, относящиеся к различным источникам стромальных клеток, ресто-6 стромальные клетки, разработанных и предоставленных Карин Tarte лаборатории, были использованы между 8 и 1513,29. Resto-6 клеток выразить CD90, CD73 и CD105 маркеры стромальных клеток и эффективно поддерживать рост нормальных и злокачественных клеток B29.

Однако Умеренная неоднородность может наблюдаться в процент активированных лимфоцитов, PrePBs, PBs и ПК в зависимости от здоровых доноров крови для памяти клетки B очистки11,12,13. Сгенерированный долгоживущих ПК не Велоспорт ПК, выживших и производя иммуноглобулинов для более чем трех месяцев в пробирке, как их в естественных условиях коллегой13. Long-lived PCs Экспресс высоко CD138 и ген выражение профили связанные с в естественных условиях шт13. Кроме того более высокий коэффициент сращивания для unspliced XBP1 вместе с выше выражение IRF4 и PRDM1 ПК транскрипционных факторов характеризуются долгоживущих ПК, полученные в vitro по сравнению с раннего ПК получил в 10 день13.

Считается эпигеномные и transcriptional изменений контроль клеточного переходы во время разработки. Однако терминал дифференцировки лимфоцитов в плазматические клетки является уникальный процесс, которого эпигеномные изменения остаются практически неизвестны. Согласно этому мы недавно проанализированы miRnome нормальный PC дифференциации и определены Роман ключевых адаптивной, регулирующие сетей значение для обычных ПК дифференциация14. Мы показали, что несколько интерферирующим могут также участвовать в регулировании выражения ключа транскрипционных факторов во время PCD, включая IRF4, PRDM1, ELL2 и ARID3A14. В соответствии с этим мы расширили здесь характеристика эпигеномные связанных генов профилей во время Б дифференциации ПК, используя GenomicScape платформа открытого доступа. Этот подход позволил нам выявить chromatin изменения генов фермента, конкретно выражена в различных стадиях дифференцировки PC. MBCs значительно оверэкспрессировали шляпы, известно, вызывают nuleosomal Ремоделирование, предоставляющий сайтов связывания транскрипции. Гистона post-transcriptional изменений, в том числе ацетилирование гистона были зарегистрированы в регионе промоутер крупные клетки B TFs, включая PAX5, CIITA, SPIB и BCL6,3031. Кроме того протеомного анализа показали, что CREBBP и EP300 (оверэкспрессировали в многобайтовой кодировке) взаимодействуют с BCL6 и может играть определенную роль в регуляцию BCL632. PAX5, также было показано для регулирования экспрессии генов цели путем завербовывать chromatin remodeling и гистонов, изменяя белки33. Pax5 было показано побудить H3K4 метилирования и H3K9 ацетилирования на промоутеров их активированные целевых генов33.

Эпигеномные фактором GEP изменения были выявлены в ходе MBCs PrePBs переход с основных Даунрегуляция шляпы, наряду с увеличением HMTs выражение и обогащения гда и DNMTs экспрессии генов. Переходный этап PrePB является весьма пролиферирующих клеток населения11. Согласно этому, несколько эпигенетических факторов, известных заниматься распространением ячейки, включая DNMT134, EZH235,36,,3738 и MMSET39,40 были определены и могут быть вовлечены в ячейке активации и распространения индукции на этапе PrePB.

В конце стадии B PC дифференциации BMPCs оверэкспрессировали эпигенетических факторов, включая EHMT2 и HDAC6, известный в ER реакции на стресс. ER и аппарат Гольджи играют важную роль в ПК для размещения синтеза выделяется Ig. В клетках рака мочевого пузыря EHMT2 ингибирования стимулирует ER стресс и индуцирует апоптоз41. HDAC6 принадлежит к семейству 2Б класс гда. Он известен играть определенную роль в белок гомеостаза и УНР42,43 и HDAC6 ингибиторы тестируются в клинических испытаниях для злокачественных ПК множественной миеломы. Наши данные подчеркивают, что эпигенетических факторов может играть роль в гомеостаза долгоживущих Ig секреции шт.

С помощью лентивирусные векторы и/или специальные ингибиторы, это может быть интересно расследовать роль этих биологических пути и chromatin изменения ферментов в chromatin remodeling, PC дифференциация и функций, как описано ранее в нашей группе 44.

Знания, полученные от этого исследования может информируется и инструктируется на диагностических и терапевтических стратегий для PC расстройств, таких, как в случае множественной миеломы, рак без окончательного лечения лучше прогноз и совершенствование терапевтических стратегий крайне необходимы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантов от французского ИНКОВ (Институт национального du рака) институт (PLBIO15-256), НРУ (галстук-скип) и НИУ ИТМО рака (мм & TT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
  3. Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
  4. Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
  5. Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
  6. Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
  7. Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
  8. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  9. Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
  10. Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
  11. Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
  12. Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
  13. Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
  14. Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
  15. Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
  16. Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
  17. Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
  18. Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
  19. Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
  20. Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
  21. Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
  22. Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
  23. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
  24. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
  25. Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
  26. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
  27. Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
  28. Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
  29. Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
  30. Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
  31. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
  32. Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
  33. McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
  34. Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
  35. Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
  36. Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
  37. Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
  38. Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
  39. Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
  40. Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
  41. Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
  42. Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
  43. Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
  44. Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 143,
В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jourdan, M., de Boussac, H.,More

Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter