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Immunology and Infection

宿主病原学反应及疫苗效果评价

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58930
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

Summary

在这里, 我们提出了一个优雅的协议, 在体内评估疫苗的有效性和宿主免疫反应。该协议可适用于研究病毒、细菌或寄生虫病原体的疫苗模型。

Abstract

疫苗是20世纪医学奇迹 。它们大大降低了传染病造成的发病率和死亡率, 并促使全球预期寿命显著延长。尽管如此, 确定疫苗的疗效仍然是一个挑战。新出现的证据表明, 目前的无细胞疫苗 (apv) 为百日咳杆菌 (百日咳 b.) 诱导次优免疫。因此, 一个主要的挑战是设计下一代疫苗, 在不产生全细胞疫苗 (wpv) 不利副作用的情况下诱导保护性免疫。在这里, 我们描述了一个协议, 我们用来测试一个有前途的, 新颖的佐剂的疗效, 扭曲免疫反应的保护性 thenth17 表型, 并促进更好地清除 b .百日咳挑战从小鼠呼吸道。本文介绍了小鼠免疫、细菌接种、组织采集和免疫反应分析的方案。利用这种方法, 在我们的模型中, 我们成功地阐明了一种有希望的下一代无细胞百日咳疫苗所引发的关键机制。该方法可应用于任何传染病模型, 以确定疫苗疗效。

Introduction

疫苗是20世纪最伟大的公共卫生成就之一, 但我们仍然没有完全理解成功疫苗刺激保护性免疫的机制。疫苗接种后诱导的分子特征 (如细胞激活标记、细胞亚型的扩展和基因表达模式) 的鉴定为预测和生成有效的信息提供了大量信息。免疫反应。在体外细胞培养系统1中无法充分复制宿主病原体反应的复杂性。体内疫苗模型旨在同时评估宿主内的多种免疫细胞类型。这提供了一个优势, 当描述疫苗抗原处理和呈现, 差异细胞因子分泌, 和扩大免疫细胞的特点。这里描述的协议提供了一个详细的方法来确定疫苗的疗效, 通过评估系统和局部免疫反应和量化病原体负担的有关组织。这里提供的例子测试了百日咳博德氏杆菌 (百日咳 b. b.)实验疫苗的有效性。

百日咳是一种革兰氏阴性细菌, 是呼吸道疾病百日咳 (百日咳)2,3的病因。与受感染的人密切接触 (有症状或无症状) 会导致传播、定植和疾病。尽管全球疫苗覆盖率很高, 但百日咳在世界许多国家被认为是一种重新出现的疾病, 是可预防的儿童死亡的主要原因 5,6,7,8. 2015年,百日咳和百日咳被列入国家过敏和传染病研究所 (niaid) 新出现的传染性病原病/疾病清单, 强调需要开发一种更好的疫苗, 使其长寿保护免疫。

目前, 控制百日咳复发的一个活跃的研究领域是开发下一代无细胞百日咳疫苗 (apv), 该疫苗具有新型佐剂和抗原的最佳组合, 以模拟全细胞产生的免疫反应百日咳疫苗 (wpv)9。使用所描述的协议, 我们最近报告说, 通过添加一种新型佐剂 bordetella 殖民因子 a (bcfa), 对目前 fda 批准的 apv 进行了修改, 从而更有效地减少了百日咳细菌的负荷。鼠肺10,11。这种增加的保护伴随着对更具保护性的 ththth这家免疫剖面10的铝诱导的 ththuth2 免疫反应的倾斜。该议定书是详细和全面的, 使调查员能够通过同时评估宿主和免疫对各种病原体的反应, 获得最大限度的信息。

这里描述的协议遵循具有代表性的疫苗计划, 如图 1所示, 以确保最佳的宿主免疫反应。

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Protocol

所有活体动物实验都是根据俄亥俄州立大学 iacuc 根据 iacuc 的指导方针批准的协议进行的。c57bl6 小鼠被用于所有免疫接种和感染。根据国家卫生研究院的指导, 每组都使用雄性和雌性小鼠。根据实验组结果的预测差异, 通过功率计算确定了每组动物的数量。例如, 每组8只小鼠在α= 0.05 (双面) 时产生80% 的功率,进行2样本 t-测试, 以检测1.33 标准差 (sds) 的兴趣结果的差异。

1. 小鼠免疫接种

  1. 在无菌生理缓冲液 (如盐水或 dps) 中混合制备主疫苗。
    注: 混合中的总体积应包括比整个组免疫所需的量多10%。下面1.1.1 和1.1.2 步骤详细介绍了疫苗成分的浓度。把物品放在冰上运送到 vivarium。
    1. 对于百日咳研究, 包括以下疫苗组: a v p 和 a v p + bc法。此外, 单独使用明胶、疫苗抗原 (fha 和 prn) 和天真 (非免疫) 小鼠作为对照组。
      注: 人的剂量是 fda 批准的抗艾病毒的人的剂量, 它由破伤风类毒素、减少的白喉类毒素、百日咳类毒素 (pt)、丝状血凝素 (fha) 和吸附在铝盐中的 pertussis (prn) 组成. 目前百日咳的一个人剂量为0.5 毫升, 因此, 剂量为0.1 毫升.agpv + bcfa 的体积为 0.1 ml 的 apv (占人类剂量 ) + 0.046 ml 的 bcfa (30 微克)。可以安全地传递到一个肌肉的最大体积为0.1 毫升。由于 apv + bcf 疫苗体积大于0.1 毫升, 疫苗必须放在两个肩膀上, 大致平均相等, 才能安全地接种。
    2. 准备实验疫苗, 用于在无菌 pbs 中将1微克的 fha 和0.5 微克的 prn 与50微克的氢氧化铝凝胶结合。允许实验器在室温 (rt) 下在实验室滚子上混合15分钟。之后, 在4°c 下, 以 18, 000 x g 旋转管5分钟。去除上清液, 重新悬浮无菌 pbs 1 毫升中的含量。
  2. 在 vivarium 中, 设置麻醉机 (图 2)。
    注: 使用前确保各自储罐中有足够的氧气和异氟醚。称重异氟烷清除剂罐, 当其重量增加50克时更换。
  3. 彻底清洁生物安全柜 (bsc), 并将清洁的感应室放置在 bsc 内。将麻醉和清除线从麻醉机连接到诱导室。通过调节器打开氧气罐, 确保氧气流动, 并将液位设置为 1.5-2 l/min。
  4. 将所需年龄 (6-12) 的小鼠放入诱导室。将异氟醚开启 2.5-3%, 以便对小鼠进行轻微麻醉。监视动物, 直到它们不在室内移动, 它们的呼吸已经放缓。
  5. 通过脚趾捏测试诱导水平, 观察任何反身运动。如果没有, 那么老鼠就可以注射了。
    注: 在这个实验中, 整个笼子的动物被麻醉一次。人们可以选择单独麻醉动物注射, 也可以在没有麻醉的情况下注射动物。这两种方法中的任何一种都是适当的。
  6. 同时, 制备1毫升胰岛素注射器 (28g半), 每支疫苗0.1 毫升。当动物完全诱导时, 将一只动物从房间中取出, 并将老鼠侧卧在毛巾或长凳上。
  7. 肌肉注射疫苗。将注射器与45°角的针头朝上, 将注射器 ~ 5 毫米插入小鼠的三角肌中, 然后注射疫苗。
    注: 后四分翼可用作注射部位, 而不是三角肌。
  8. 注射后, 保持针插入肌肉约5-10。卷送出后, 将注射器旋转 180°, 使斜面面朝外, 以创建密封, 并防止疫苗泄漏。然后, 慢慢地将针头拉出注射部位。
  9. 将鼠标返回到笼子中。对指定组中的所有动物重复此过程。
  10. 关闭异氟烷, 在麻醉下一个小鼠笼之前, 先用氧气冲洗感应室。
  11. 监视动物, 直到它们都处于警觉状态并在笼子里移动。将保持架返回到外壳位置。
  12. 接种后每12小时监测一次动物, 最长 48小时, 以确定发病的临床症状, 如粗糙/松松厚的外套、缓慢的步态或呼吸困难。如果症状持续, 请咨询机构兽医, 并在需要时将小鼠从研究中取出。
  13. 在最初免疫四周后, 用与以前相同的疫苗配方麻醉和注射到小鼠的右三角肌来促进小鼠。
  14. 再次, 监测动物的任何临床症状。将动物额外放在家里 2周, 然后进行感染。

2.百日咳菌株的生长及感染感染的制备

  1. [冷冻库存 [冷冻保存在-80°c 的15% 甘油, 冷冻从浮游生长在 stainer-scholte (ss) 介质 12], 条纹出 b·百日咳在 bordet-gengou (bg) 琼脂13板补充10% 除颤的绵羊的供选择的血液和100μgml 链霉素 (10% bg + nm)。在37°c 下将板材孵化4天。
  2. 从板中选取 ~ 8-10 个菌株, 并接种3毫升 ss 介质, 辅以 22.8 mm l-半胱氨酸, 3.6 mm 亚铁硫酸盐、3.3 mm 烟酸、48.8 mm 谷胱甘肽、227 mm 抗坏血酸、1 mgml hiptakis 和100μgml 链霉素。在37°c 的滚轮温度下, 在60点转每分钟的温度下, 在16-24小时内培养培养。
  3. 第二天, 将初级文化 1: 600、1: 300、1: 120、1:60、1:600 和 1:15 稀释为3毫升的补充 ss 介质。在37°c 的滚筒上培养, 每分钟60转一次, 16-24小时。
  4. 在600纳米 (od600) 处对细菌培养物进行光学密度测量。利用分光光度计试剂盒, 将液体培养物的 0.1 ml 加入不育 pbs 0.9 ml, 稀释培养物 1:10。
  5. 选择 od600 约 0.8-1.2 的区域性。计算获取 1个 od 所需的卷 (图 3)。在25°c 的情况下, 以 6000 x g 的速度在 1.5 ml 微离心管中旋转5分钟。在无菌 pbs 的1毫升中吸入上清液并重新悬浮细菌细胞颗粒, 以获得 1 odl [1-3x 10 9个菌落形成单元 (cfu)/ml] 的密度。
  6. 制备了 ~ 5 x 10 5 至 1.5 x 10 x10 6 cfusp 鼠在40-50μl 中的接种物, 并在无菌 pbs 的1毫升中连续稀释细菌溶液 (从步骤 2.5) 100倍, 以达到 ~ 1-3x 10 7 cf/usl (图 4a)。将接种疫苗输送到冰上的病毒。

3. 小鼠鼻内感染模型

  1. 在 vivarium 中, 按照步骤1.3 和1.4 中的描述设置氧气和麻醉条件。如步骤1.5 所述, 将小鼠放入室内麻醉。监测动物, 直到麻醉生效。
  2. 当老鼠被麻醉时, 一次从诱导室取出一只动物。在肩部刀片和颈部后面, 用胸背的磨砂把老鼠捡起来。将鼠标垂直放置以访问鼻子。
  3. 使用200μl 移液器尖端, 慢慢地将细菌接种剂的40-50μl 应用于小鼠的鼻孔 (每个鼻孔为 20-25μl)。按住鼠标, 直到整个接种已被动物吸入。如果一些接种的人冒出来, 收集气泡, 然后重新进入鼻孔。给一组小鼠提供等量的无菌 pbs 作为阴性对照。
  4. 正如在步骤 1.10-1.10 中所做的, 将接种过的动物送回笼子, 并监测动物, 直到它们处于戒备状态并移动。将保持架返回到机架上的原始外壳空间。在麻醉下一组动物之前, 用氧气冲洗感应室, 以去除残留的异氟醚。在感染后48小时内对动物进行监控。
  5. 在实验室中, 板系列稀释接种器, 在无菌 pbs 中, 验证实际交付小鼠的 cfu。10% bg + nm 板上的稀释板0.1 毫升 (图 4a)。将板材放入37°c 孵化器中生长4天。计算和计算从接种送到小鼠的 cfu (图 4b)。

4. 感染后动物组织的采集

  1. 为小鼠解剖和组织收获做好准备。
    1. 消毒在高压灭菌器中处理组织所需的所有工具 (粗和细剪刀、弯曲剪刀、细钳、弹丸刺和三角形喷水机)。将工具密封在灭菌袋中。用铝箔包裹玻璃弹跳均质机, 并添加高压灭菌带, 以表明无菌。
    2. 在组织收获前1天或2天准备琼脂板, 以确保在使用前将琼脂板固化。对于百日咳,使用 10% bg + sm. 标签板的鼻中隔, 气管, 和肺的每只老鼠所需的稀释, 经验确定的每个实验。
    3. 填充和标签 cfu 稀释管。根据每个器官处理和稀释的器官数量, 在无菌1.5 毫升微离心管中添加 0.9 ml 的无菌 pbs。
    4. 用于组织收集的填充和标签管:
      1. 鼻中隔和气管: 在 pbs (ca2 +和 mg 2+无) 中, 用0.3 毫升的无菌1% 酪蛋白填充无菌 1.5 ml 微离心管。存放在4°c。
      2. 肺: 在 pbs 中加入2毫升无菌1% 酪蛋白, 加入无菌15毫升锥形管, 并在4°c 下储存。为了采集肺进行组织学检查, 加入2毫升10% 中性缓冲福尔拉林 (nbf), 并存放在 rt。
      3. 脾脏: 在15毫升的锥形管中加入3毫升的 rpmi + 5% fbs。存放在4°c。
      4. 血液: 标记两套无菌 1.5 ml 微离心管, 一款为全血, 一套用于血清。
    5. 应准备新鲜的70% 乙醇, 以填充烧杯和喷雾瓶进行解剖。
  2. 在收获的日子里, 用手推车将所有材料运送到 vivarium。按照步骤1.3 和1.4 中的步骤清洁 bsc 并设置麻醉机。
  3. 将小鼠放置在诱导室中, 在氧气流动的情况下, 将异氟烷打开至 5%, 直到动物失去意识。一次摘除一只老鼠, 并将动物的子宫颈脱位作为确保死亡的次要方法。宫颈脱位后, 安乐死应通过没有呼吸率和/或没有戒断反射 (脚趾捏试验) 来确认。
  4. 将鼠标, 腹侧朝上, 放在解剖板上, 将胳膊和腿固定开。用70% 的乙醇把老鼠的身体喷下来。
  5. 使用钳子, 将腹部下方的皮肤固定在骨盆的中心。用锋利的剪刀, 把垂直的伤口切割成下颌骨。然后, 用将两层分开, 用小动作, 用剪刀闭合, 将皮肤从腹膜壁上解剖。将皮肤放在尸体的两侧, 形成一个不受阻碍的领域, 用于无菌器官的收获。
  6. 抓住肝脏或周围肋骨下完整的腹膜, 并将其向肋骨笼切开。暴露下消化道, 将结肠向左移动, 露出脾脏。使用弯曲的钳子, 抓住脾脏, 用剪刀解剖结缔组织。将脾脏放置在含有3毫升 rpmi + 5% fbs 的15毫升锥形管中, 并将导管放在冰上。
  7. 使用钳子在香素过程中稳定肋骨笼, 并切开隔膜。肺应该收缩, 向脊椎坠落。切开两侧的肋骨笼, 取出胸板。
  8. 隔离和切除右肺14的上叶, 切断肺动脉和静脉。将叶瓣放置在含有 10% nbf 的 15 ml 锥形管中, 并将管放置在 rt 中至少24小时以固定组织。隔离右肺和左肺的剩余裂片。将裂片放置在含有2毫升酪蛋白的15毫升锥形圆锥管中, 并将其放置在冰上。
  9. 切断肺静脉和动脉解剖肺部后, 让胸腔充满血液, 因为小鼠渗出。使用带尖端的1毫升移液器, 收集血液并将其转移到预先标记的 1.5 ml 微离心管。把管子放在冰上。
  10. 然后, 从颈部取出覆盖气管的软组织 (腮腺、舌下和上颌下腺体及淋巴结)。打开并取出气管周围的保护膜。有趣的是, 使用精细的钳子和剪刀, 将气管从食道和任何其他结缔组织从锁骨顶部到下颌骨底部。
  11. 使用钳子, 抓住气管, 并切断锁骨顶部的气管。将气管向下拉, 以最大限度地提高弹性, 并将下颌骨底部的气管切开, 尽可能地隔离 (~ 1 厘米)。将器官放置在 pbs 中含有 0.3 ml 1% 酪蛋白的 1.5 ml 微离心管中, 并将其放置在冰上。
  12. 解开老鼠的别针, 将其放在腹侧, 老鼠面对研究人员, 以便清楚地接触到鼻子。用70% 的乙醇喷洒鼠标头部, 用双手抓住鼠标直接在头骨后面。
  13. 用剪刀剪掉鼻子的软肉, 从鼻子底部开始向上移动。此外, 取下鼻子周围的皮毛、皮肤和胡须。然后, 用钳子和弯曲的剪刀, 将剪刀的尖端插入与曲线指向外的鼻孔, 并将鼻腔通道向眼睛切开, 形成 v 形的形成。
  14. 使用精细的钳子, 收集鼻中隔和软组织内的创造的形成。将组织放置在 pbs 中含有 0.3 ml 1% 酪蛋白的 1.5 ml 微离心管中, 并将其放置在冰上。
  15. 将尸体放入生物危害袋中。在解剖下一个动物之前, 用去离子水冲洗工具, 然后放在装满70% 乙醇的烧杯中。取下工具, 甩掉多余的乙醇, 然后进行下一次解剖
  16. 按照步骤 4.3-4.14 对每只老鼠进行解剖。
  17. 处理组织, 如下所述。

5. 脾脏的加工

  1. 要分离脾脏, 请在60毫米组织培养皿中放置一个70μm 的细胞过滤器。使用3毫升注射器的柱塞将脾脏和伴随的介质倒进过滤器。小心地捣碎器官, 直到它完全分离, 并通过细胞过滤器过滤。
  2. 用 rpmi + 5% fbs 的3毫升将过滤器冲洗到组织培养盘中。收集细胞悬浮液, 并将其放置在原来的15毫升管。在4°c 条件下, 以 450 x g 离心管 5分钟, 使电池颗粒化。
  3. 通过在氯化铵钾 (ack) 缓冲液 (150 mm 氯化铵、10 mm 碳酸氢铵、0.1 mm edta 钠) 中重新悬浮颗粒, 对上清液进行吸水或脱脂, 从而使红血球裂解。在 rt (25°c) 下孵化3分钟。
  4. 用 rpmi + 5% fbs 和离心管填充高达8毫升的管, 在4°C 时为5分钟。吸或装饰上清液。在 rpmi + 5% fbs 5 毫升中重新移植细胞颗粒, 并用血细胞计和显微镜计数脾细胞。
  5. 计算每口刺激 2.5 x10 6 细胞所需的细胞体积。在48孔板中, 将细胞种子在 0.5 ml 的 t 细胞介质中 (rpmi 1640 + 10% fbs、10μgml 庆大霉素和50μm β-甲基硫醇)。
  6. 根据上述计算, 将细胞悬浮液所需的体积放入 450 x g 的新鲜管和颗粒细胞中, 在4°c 下5分钟。
  7. 在所需的 t 细胞介质中重新填充颗粒。对于b. 百日咳感染模型, 测试抗原特异性细胞因子对疫苗抗原的反应: pertactin (prn) 和丝状血凝素粘附 (fha)。因此, 需要3个治疗方法: 1) 无刺激 (ns, 作为负控制), 2) prn, 3) fha。在检测中, 需要在 1.5 ml 的 t 细胞介质中使用 7.5 x 10 6 个细胞 (每 0.5 ml 2.5x 10 6个细胞)。
  8. 将细胞悬浮液的0.5 毫升注入48孔板。
  9. 为了刺激细胞, 在 t 细胞培养基中混合抗原, 浓度是所需浓度的2倍。prn 和 fha 的最终浓度分别为1μgml 和0.5μgml。因此, 在 0.5 ml 中混合 2μgml prn 或 1μgml fha。然后, 将刺激介质的脂肪 0.5 ml 引入每个指定的井中, 将抗原治疗稀释到 1x, 最终体积为1毫升。
  10. 在 5% co2中的37°c 下培育板材。在第7天收集上清液, 并将0.5 毫升的上清液收集到预先标记的微离心管中。将样品储存在-20°c, 直到准备使用 elisa 测试抗原特异性细胞因子 (图 6)。

6. 肺的加工

  1. 将肺部 (pbs 中1% 酪蛋白的2毫升) 转移到无菌的15毫升的均质机中。使用牙尖使组织均匀化。分离, 直到没有大颗粒的组织仍然存在。将均质悬浮液放回原来的15毫升管中。
  2. 取出0.3 毫升的材料用于电镀 cfu, 并在4°c 下将均质离心机在 450 x g 处进行5分钟。将 0.5 ml 等价物中的上清液收集和分离到预先标记的微离心管中。将样品存放在-20°c, 直到 elisa 分析细胞因子。
  3. 在稀释管中连续稀释0.1 毫升的均质肺悬浮液 (不育 pbs 0.9 毫升), 制备所选稀释剂。板材0.1 毫升的经验选择稀释到预先标记的 10% bg + sm 板, 并使用无菌三角形摊铺机传播。
  4. 在37°c 的室内空气中将盘子生下4天。
  5. 计数和计算 cfus/lung (图 6)。简单地说, 将回收的 cfu 数字乘以板的稀释系数, 然后乘以处理器官的总体积。然后将 cfu 计算转换为每个动物的日志10 值和图形。
    1. 有30-300 个菌落的板材可以很容易、准确地计数。不应使用少于6个菌落的板材进行计算, 因为这种低菌落数会引入错误15。为了获得较低的检测极限, 器官同质化的总体积除以用于从未稀释的均质体中发现板的体积 (例如, 2 毫升的总体积除以0.1 毫升的未稀释均质体等于下限。可检测到 20个 cfu)。

7. 鼻甲和气管的处理

  1. 用颗粒皮针无绳电机均质机对 1% pbscain 0.3 ml 中的组织进行均质。将组织同质为 0.5-1分钟, 直到组织基本分离。细菌应该被抛入悬浮液中。
  2. 在含有0.9 毫升无菌 pbs 的稀释管中, 采用0.1ml 的连续稀释剂, 制备所选10倍稀释剂。点 0.1 ml 的每个稀释预先标记为 10% bg + sm 板, 并使用已被70% 乙醇清洗和火焰消毒的三角形摊铺机铺开悬浮液。
  3. 在37°c 的室内空气中将盘子生下4天。
  4. 如步骤 6.5 (图 6) 所示, 对 cfus/器官进行计数和计算。为了获得较低的检测极限, 器官同质化的总体积除以未稀释的均质体在盘子上点点的体积 (例如, 0.3 ml 的总体积除以 0.1 ml 的未稀释的 0.1 ml 的总体积等于 3个 cfu 检测的下限)布尔)。

8. 血液处理

  1. 在4°c 下, 以 18, 000 x g 的速度离心含有分离全血的管 30分钟, 以培养红细胞。
  2. 小心地将血清上清液和移液器取出到预先标记的血清微离心管中。将管材存放在-20°c, 直到可进行进一步的下游分析 (即总和特定的 ig elisa)。

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Representative Results

所描述的模型显示了一种评估疫苗效率和宿主-病原体相互作用过程中免疫反应的方法。图 1描述了用于免疫和感染小鼠和采集组织进行分析的代表性疫苗计划。图 2显示了用于诱导小鼠的麻醉系统的设置, 使研究人员能够进行免疫接种和细菌接种。图 3显示了 od600的示例测量和计算, 以实现 1 od 细菌悬浮液, 准备将100倍稀释的细菌接种送到小鼠。图 4描述了用于感染的接种制剂、串行稀释剂的电镀方案, 以及用于列举基于电镀连续稀释剂提供给小鼠的 cfu 的示例计算。图 5显示了疫苗抗原 fha 经过7天刺激后引发的抗原特异性召回反应。从联合疫苗组, aluc/fha/bcfa 中免疫脾脏细胞, 产生 ifnγ和 il-17, 同时显著降低 IL-17。这种效应促进百日咳感染期间免疫反应的 thent一点点。仅通过培养基对免疫脾脏细胞进行培养, 产生了细胞因子的背景水平, 这表明检测到的细胞因子是对免疫的回忆反应 (数据未显示)。图 6举例说, cfu 列举了从免疫小鼠呼吸道组织中回收的细菌, 使用在 10% bg + nm 板上镀金的 b .百日咳组织均质体的连续稀释。将原料数乘以稀释因子和组织裂解液的总体积, 并对数据进行日志转化。然后将免疫动物的 cfu 与非免疫 (天真) 动物进行比较, 以确定疫苗的保护作用。

Figure 1
图 1: 有代表性的疫苗时间表.小鼠在第0天接受免疫接种, 然后在 ~ 4周后 (d28) 用适当的抗病毒增强。百日咳小鼠在促进小鼠后, 感染百日咳~ 2周 (d42)。感染后, 动物在接种后的不同日子 (d43-56) 被杀死。收集组织和血液进行下游分析 (例如, cfu 计数、细胞因子和抗体 elisa)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:麻醉机设置.显示是一种麻醉蒸发器, 带有连接的感应室和清除剂系统 (在生物安全柜内)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 制备 1od 600细菌悬浮液.从稀释的原生百日咳培养物中得到了 od600值。在日志阶段使用了一种培养体来计算获得 1 od600培养的感染所需的数量。简单地说, od600中的1除以所需培养物的计算 od600 , 以获得用于感染的体积等于 1 od。简单地说, 一个 od600 的1除以所需培养的计算的 od600, 以获得一个体积等于 1 od 用于感染。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 计算所提供的鼻内接种.(a) 稀释至10-4、10-5 和 10-6的感染接种物连续稀释示意图.这些稀释剂在 10% bg + nm 上镀锌, 在37°c 下孵育 4天, 然后计算。(b) 然后使用 10-4、10-5 和10-6 稀释量来计算经内交付的 cfu。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 用 fha、alam/fha、bcfa/fha 和 alame/bcfha 对脾脏细胞进行细胞因子的生产.用 fha 培养分离细胞7天。用三明治 elisa 对 (a) ifn-γ、(b) il-17 和 (c) il-5 进行了测试。误差条表示为每个组的平均值的标准偏差, n = 每个组5个。p < 0.001。该图改编自以前的一份出版物10。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 百日咳 cfu 和从小鼠收获的组织的计算.(a)来自均质小鼠组织的百日咳 cfu。在37°c 下孵育 4天, 采用 0.1 ml 系列稀释剂。(b) 根据从均质气管中获得的 cfu 进行计算。cfu 乘以各自的稀释, 然后乘以 10, 以实现每个 ml 的 cfu。为了获得每个器官的 cfu, 将每个 ml 的 cfu 乘以器官同质化的总量 (0.3 ml)。然后对每个器官的 cfu 进行日志转换。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

这里描述的研究疫苗诱导的百日咳感染免疫的综合方案也将允许评估宿主对各种其他病原体的反应。该协议讨论了提供免疫接种的方法, 确定疫苗在病原体挑战后的疗效, 以及免疫功能的平行解剖。为了研究其他病原体, 在调整该议定书时, 需要修改几个参数。这些措施包括但不限于动物麻醉的方式、疫苗组成、剂量和给药途径。此外, 受质疑的病原体的剂量和给药途径、收获所选组织和免疫反应的下游评估是可能被修改为感兴趣的病原体疾病的因素。

百日咳 b 感染小鼠模型得到了广泛的应用, 是 16、17、18、19、20的病机和疫苗学研究的良好模型。小鼠模型与人类感染有许多相似之处, 包括: (一) 细菌仅限于呼吸道并迅速繁殖, (二) 幼小动物表现出相对严重的感染, (三) 保护疫苗的疫苗之间的良好对应关系儿童抗百日咳和那些保护小鼠免受感染, 和 iv) b .百日咳特异性 t 细胞和抗体介导自然和疫苗诱导的保护性免疫 21,22,23,24. 因此, 小鼠模型允许研究免疫对细菌清除的影响25。使用小鼠模拟百日咳感染的另一个优点是有转基因敲除和转基因动物来研究疫苗诱导的免疫反应19,26中的关键参与者。

大多数免疫接种是在肠外进行的, 特别是通过肌肉注射 (i. m.) 途径进行的。这条路线是首选, 因为它产生全身免疫与最小的局部反应性 27,28, 29.肌肉注射的替代方法包括皮下注射 (. c) 或腹腔内注射 (即), 这也会引起全身反应。皮下途径也很有吸引力, 因为真皮内有大量的常驻抗原呈现细胞 (apc), 可以进入血管和淋巴系统30。然而, 目前还没有探索百日咳疫苗的皮内传递。腹腔内注射的实验性人状瘤病毒产生类似的免疫肌肉内免疫 31 , 是一种可靠的注射途径 , 用于小鼠研究 , 尽管在临床上不实用。

该协议采用了 i. m. 免疫路线, 它在肺部提供保护, 但不提供鼻咽 32.最近的研究表明, 鼻内疫苗促进局部的黏膜免疫反应, 保护上呼吸道和下呼吸道, 特别是鼻子, 它是细菌的宿主, 随后可能会传播给其他呼吸道主机33。此外, i. 免疫已被证明产生组织居民记忆, 而不是由系统免疫产生 33,34。因此, 疫苗给药途径的选择在很大程度上取决于预防疾病所需的疫苗类型和免疫反应。

本协议中描述的鼻内细菌输送途径是一种广泛使用的呼吸道病原体方法, 它安全、一致地将细菌接种直接输送到麻醉小鼠的呼吸道。我们的协议使用大容量剂量 (40-50μl), 吸入鼻咽, 并进入下呼吸道。小体积接种 (10-20μl) 会对鼻咽进行殖民, 但肺的定植将最小为35。然而, 吸入含有百日咳的 b.空气液滴被认为是个人感染和传播的自然模式。这一管理路线已被用于各种动物模型36,37。为了达到与直接接种的感染水平相当, 需要相当高的细菌接种浓度 (10-10-1011 cfus/ ml) 和分娩时间38。

为了建立小鼠呼吸道的定植, 该协议使用新鲜细菌, 在液体培养中生长, 以确保用于接种的细菌处于毒性阶段, 并在原木阶段复制。实验者还可以使用预先滴定的冷冻库存中的接种器。这样就可以了解正在向鼠标管理的 cfu。然而, 这些接种中的细菌可能处于非毒性阶段, 这可能会降低呼吸道定植的效率 39.感染后, 将接种液镀膜, 以确定传递给小鼠的细菌 cfu。调查人员还可以选择在体内感染前对接种疫苗进行平板, 以确保细菌的活力, 并确认接种剂量。

感染后, 细菌 cfu 通过在预定时间点对牺牲小鼠的分离组织进行均质化进行列举。这种方法的一个缺点是它无法对一组特定的小鼠的病原体 cfu 进行动力学跟踪。研究人员必须使用在不同时间点牺牲的多组动物来检查疫苗引起的细菌限制。每个实验中的鼠标数量将根据要检查的时间点数量和所需的效果大小而有所不同。这可能会带来更多的生物变异。将生物发光或荧光报告基因整合到感兴趣的病原体中, 将允许在整个感染过程中对生长和传播进行非侵入性监测 35。这种方法减少了生物变异, 最大限度地减少了实验动物所需的数量, 因为纵向数据是从同一组动物中获得的。

这里用于呼吸道组织的组织分离和同质化协议也适用于其他固体组织的菌落计数, 如肝脏、肾脏、肠道和膀胱, 以询问感染部位和有意义的病原体的传播。

除了 cfu 枚举外, 该协议还能对免疫和自然感染引起的免疫反应进行定性。具体而言, 对系统和局部产生的细胞因子进行量化, 可以确定免疫接种产生的有效免疫特征。细胞因子是促进细胞涌入受影响组织和激活细胞免疫的免疫调节剂, 同时也有助于生成腐殖质反应10,40,41。使用该方案, 在各种组织隔间 (如肺和脾脏) 中产生的细胞因子被检测出来。虽然没有显示在这里, 刺激协议也适用于评估反应在排水淋巴结。

elisa 分析允许检测和定量媒体上的细胞因子 (即均质或血清), 产生人口水平的信息, 并描述抗原特异性细胞因子的反应。在指定的时间点混合细胞培养。相反, 像 elispot 或流式细胞仪这样的方法可以评估产生分析物的细胞数量和每个细胞42,43的表达水平。虽然这里没有描述, 但这些方法也适用于抗原特异性 b 细胞的检测。cfu 计数和免疫检测的结合提供了免疫反应的完整情况。

使用此感染协议可能进行的其他分析包括从感兴趣的组织获得 dna 和 rna 时的表观遗传或转录分析 44.因此, 考虑到适当的疫苗成分、免疫接种和病原体输送途径, 该协议在实施方面用途广泛, 易于适用于各种感染模式。这些技术也适用于非传染性疾病 (即癌症、多发性硬化症、哮喘、自身免疫性疾病), 在这些疾病中, 疫苗被用作一种治疗方式。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了俄亥俄州立大学10112556-01 兰特和启动资金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2L induction chamber Vet Equip 941444
Fluriso Vet One V1 501017 any brand is appropriate
Bordet Gengou Agar Base BD bioscience 248200
Casein Sigma C-7078
Casamino acids VWR J851-500G Strainer Scholte (SS) media components
L-Glutamic acid Research Products Int G36020-500
L-Proline Research Products Int P50200-500
Sodium Chloride Fisher BP358-10
Potassium Phosphate monobasic Fisher BP362-1
Potassium Chloride Fisher P217-500
Magnesium Chloride hexahydrate Fisher M2670-500G
Calcium Chloride Fisher C75-500
Tris base Fisher BP153-1
L-cysteine HCl Fisher BP376-100 SS media suplements
Ferrous Sulfate heptahydrate Sigma F-7002
Niacin Research Products Int N20080-100
Glutathione Research Products Int G22010-25
Ascorbic acid Research Products Int A50040-500
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 11875093
FBS Sigma F2442-500mL  any US source, non-heat inactivated
gentamicin ThermoFisher Scientific 15710064
B-mercaptoethanol Fisher  BP176-100
15mL dounce tissue grinder Wheaton 357544 any similar brand is appropriate
Cordless Hand Homogenizer Kontes/Sigma  Z359971-1EA any similar brand is appropriate
Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders any brand is appropriate
3mL syringes BD bioscience 309657
15mL conical tubes Fisher  339651
1.5mL microfuge tubes Denville C2170
70um cell strainers Fisher  22363548
60mm plates ThermoFisher Scientific 130181
48-well tissue culture plates ThermoFisher Scientific 08-772-1C
1mL insulin syringe 28G1/2 Fisher Scientific/Excel Int. 14-841-31
Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-173-21
Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-173-77
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-172-09

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References

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178 (2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469 (1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264 (2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359 (2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009 (2018).

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免疫学与感染 第144期 疫苗、免疫、小鼠模型、 百日咳博德氏杆菌、细胞因子、cfu、肠外给药、传染病
宿主病原学反应及疫苗效果评价
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Caution, K., Yount, K., Deora, R., Dubey, P. Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice. J. Vis. Exp. (144), e58930, doi:10.3791/58930 (2019).

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