Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo elegante na vivo avaliação da vacina respostas imunes de eficácia e de acolhimento. Este protocolo pode ser adaptado para modelos de vacina que estudar virais, bacterianas ou parasitárias patógenos.
Abstract
As vacinas são uma maravilha deth do século 20 médica. Eles reduziram drasticamente a morbidade e a mortalidade causada por doenças infecciosas e contribuíram para um aumento marcante na expectativa de vida ao redor do globo. No entanto, determinar a eficácia da vacina continua a ser um desafio. Emergentes a evidência sugerem que a atual vacina acelular (aPV) para Bordetella pertussis (b. pertussis) induz imunidade suboptimal. Portanto, um grande desafio é projetar uma vacina de próxima geração que induz a imunidade protetora, sem os efeitos colaterais de uma vacina de células inteiras (wPV). Aqui descrevemos um protocolo que usamos para testar a eficácia de um adjuvante promissora, a novela que distorce as respostas imunes de um fenótipo Th1/Th17 protetora e promove um melhor apuramento de um desafio de b. pertussis do tracto respiratório murino. Este artigo descreve o protocolo para a imunização de rato, inoculação bacteriana, tecido colheita e análise de respostas imunes. Usando esse método, dentro de nosso modelo, nós com sucesso ter elucidado mecanismos cruciais, provocados por uma vacina pertussis acelular promissor de última geração. Esse método pode ser aplicado para qualquer modelo de doença infecciosa, a fim de determinar a eficácia da vacina.
Introduction
As vacinas representam uma das maiores conquistas da saúde pública do século XX, no entanto, nós ainda não entendemos completamente os mecanismos pelos quais vacinas bem sucedidas estimulam a imunidade protetora. A identificação de assinaturas moleculares (EG., marcadores de ativação celular, expansão dos subtipos celulares e os padrões de expressão gênica) induzido após vacinação fornece uma infinidade de informações para prever e gerando uma eficaz resposta imune. A complexidade das respostas do hospedeiro-patógeno não pode ser adequadamente replicada usando em vitro celular cultura sistemas1. Na vivo vacina modelos são projetados para avaliar concomitantemente vários tipos de células imunes dentro do host. Isso fornece uma vantagem quando caracterizando processamento de antígeno de vacina e apresentação, secreção de citocinas diferencial e expansão de células do sistema imunológico. O protocolo descrito aqui fornece um método detalhado para determinar a eficácia da vacina através da avaliação das respostas imune locais e sistêmicas e quantificação da carga de agentes patogénicos em tecidos de interesse. O exemplo fornecido aqui testa a eficácia de uma vacina experimental para o patógeno Bordetella pertussis (b. pertussis).
B. pertussis é uma bactéria Gram-negativa, que é o agente etiológico da doença respiratória tosse convulsa (coqueluche)2,3. Contato direto com indivíduos infectados (sintomáticos ou assintomáticos) leva à transmissão, colonização e doença. Apesar da vacina global significativa cobertura4, coqueluche é considerada uma doença ressurgente em muitas nações ao redor do mundo e é das principais causas de infância evitáveis mortes5,6,7, 8. em 2015, b. pertussis e coqueluche foram incluídas no Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID) emergentes lista de patógeno/doenças infecciosas, enfatizando a necessidade de desenvolvimento de uma vacina melhor que confere vida longa imunidade protetora.
Atualmente, uma área ativa de investigação para controlar o ressurgimento da coqueluche é o desenvolvimento de uma vacina pertussis acelular de próxima geração (aPV) com uma combinação ideal de romance adjuvantes e antígenos para imitar a resposta imune eliciada a célula inteira coqueluche vacina (wPV)9. Usando o protocolo descrito, nos informou recentemente que a modificação de um atual aprovado pela FDA aPV pela adição de um adjuvante de romance, fator de colonização de Bordetella A (BcfA), resultou em uma redução mais eficiente da b. pertussis carga bacteriana de rato pulmões10,11. Esta proteção aumentada foi acompanhada pela inclinação de uma alum-induzida resposta imune de Th1/Th2 na mais protetor de perfil imune Th1/Th1710. Este protocolo é detalhada e abrangente, permitindo que o investigador para obter máximas informações por meio de avaliação simultânea de host e respostas imunes a uma variedade de agentes patogénicos.
O protocolo descrito aqui segue o calendário de vacinas representativa, mostrado na Figura 1, para garantir respostas imunes de anfitrião ideal.
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Protocol
Todos os experimentos com animais vivos foram realizados seguindo um protocolo aprovado pelo The IACUC de Universidade de estado de Ohio, em conformidade com as diretrizes IACUC. Camundongos C57Bl/6 foram usados em todas as imunizações e infecções. Ratos machos e fêmeas são usados em cada grupo de acordo com as diretrizes do NIH. O número de animais de cada grupo foi determinado pelos cálculos de energia com base nas diferenças previstas no resultado entre grupos experimentais. Por exemplo, 8 ratos por grupo irão produzir 80% de energia em α = 0,05 (2 lados) para uma amostra de 2 t- teste para detectar diferenças no resultado do interesse de 1,33 desvios padrão (SDs).
1. imunização de camundongos
- Preparar uma mistura de mestre vacina em um tampão fisiológico estéril como soro fisiológico ou DPS.
Nota: O volume total da mistura deve incluir 10% mais do que necessário para a imunização de todo o grupo. Concentrações da composição da vacina são detalhadas abaixo nas etapas 1.1.1 e 1.1.2. Transporte os itens para o viveiro no gelo.- Para estudos de b. pertussis , incluem os seguintes grupos de vacina: aPV e a aPV + BcfA. Além disso, use alume, antígenos de vacinas sozinhos (FHA e Prn) e ingênuo (não-imunizadas) ratos como grupos de controle.
Nota: aPV é 1/5th a dose humana de um aPV aprovado pela FDA, que é composta de toxoide tetânico, difteria reduzida tetânico, toxoides coqueluche (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) e pertactin (Prn) adsorvidas a sais de alumínio. Uma dose humana de atual coqueluche aPV é 0,5 mL, portanto, 1/5th de uma dose é de 0,1 mL. Volumes para aPV + BcfA são 0,1 mL da aPV (1/5th a dose humana) + 0,046 mL de BcfA (30 µ g) por rato. O volume máximo que pode com segurança ser entregue a um músculo é de 0,1 mL. Porque o aPV + BcfA volume de vacina é superior a 0,1 mL, a vacina deve ser entregue em ambos os ombros, divididos em partes iguais, mais ou menos para ser administrada com segurança. - Para preparar uma vacina experimental, para uma dose combine 1 µ g de FHA e 0,5 µ g do Prn com 50 µ g de gel de hidróxido de alumínio em PBS estéril. Permitir que a aPV experimental a mistura em um rolo de laboratório durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT). Em seguida, girar o tubo a 18.000 x g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o conteúdo em 1 mL de PBS estéril.
- Para estudos de b. pertussis , incluem os seguintes grupos de vacina: aPV e a aPV + BcfA. Além disso, use alume, antígenos de vacinas sozinhos (FHA e Prn) e ingênuo (não-imunizadas) ratos como grupos de controle.
- O viveiro, defina a máquina de anestesia (Figura 2).
Nota: Certifique-se existem níveis adequados de oxigênio e isoflurano em seus respectivos tanques antes da utilização. Pesar o cilindro ao tesouro de isoflurano e substituir quando seu peso aumenta em 50 g. - Limpam-se o gabinete de segurança biológica (CSB) e coloque a câmara de indução limpo dentro do BSC. Conecte as linhas de anestesia e ao tesouro da máquina de anestesia para a câmara de indução. Abra o oxigênio tanque através do regulador para garantir o oxigênio está fluindo e defina o nível de 1,5 a 2 L/min.
- Coloque os ratos de idade desejada (6-12 semanas) na câmara de indução. Ligue o isoflurano para 2,5-3% para anestesiar levemente os ratos. Monitore os animais até que eles não estão se movendo na câmara e sua respiração diminuiu.
- Teste o nível de indução, dedo do pé-beliscar, observando para qualquer movimento reflexivo. Se não houver nenhum, então, os ratos estão prontos para injetar.
Nota: Neste experimento, a gaiola inteira de animais foram anestesiados de uma só vez. Um pode escolher para anestesiar animais individualmente para injeção ou para injetar os animais sem anestesia. Um desses métodos é apropriado. - Enquanto isso, prepare-se 1 mL seringas de insulina (28 1/2) com 0,1 mL de vacina cada. Quando os animais são totalmente induzidos, remover um animal da câmara e colocar o mouse ventralmente sobre uma almofada de toalha ou banco.
- Administre a vacina por via intramuscular. Com a seringa em um ângulo de 45° e com o bisel voltado para cima, insira a seringa ~ 5 mm o deltoide do mouse e injete a vacina.
Nota: O hind trimestre/flanco pode ser utilizado como um local de injeção, em vez do deltoide. - Após a injeção, manter a agulha inserida no músculo para s ~ 5-10. Uma vez que o volume é entregue, gire a seringa em 180° para que o bisel enfrenta fora para criar um selo e evitar a fuga da vacina. Em seguida, puxe lentamente a agulha fora do local da injeção.
- Retorne o rato da gaiola. Repita o procedimento com todos os animais no grupo designado.
- Desligue o isoflurano e purgar a câmara de indução com oxigênio antes de anestesiar a gaiola próxima dos ratos.
- Monitore os animais até que todos eles são alerta e em movimento na gaiola. Retorne a gaiola para o local de habitação.
- Monitor animais cada 12 h pós vacinação, acima de 48 h, para os sintomas clínicos de morbidade como revestimento áspero/despenteado, lenta marcha ou respiração ofegante. Se os sintomas persistirem, conferir com o veterinário institucional e remover os ratos do estudo, se necessário.
- Quatro semanas após a imunização inicial, impulsionar os ratos por anestesiar e administrar injeções intramusculares para o deltoide direito do mouse com a mesma formulação de vacina que foi dada anteriormente.
- Novamente, monitore o animal para quaisquer sintomas clínicas. Animais de casa um adicional de 2 semanas e então prosseguir com a infecção.
2. crescimento de cepas de b. pertussis e preparação do inóculo de infecção
- De estoques congelados [criopreservadas a-80 ° C em 15% de glicerol, congelado de crescimento planctônico em Stainer-Scholte (SS) mídia12], raia por b. pertussis em placas com13 agar Bordet-Gengou (BG) suplementado com 10% desfibrinado ovelha sangue e 100 estreptomicina µ g/mL (10% BG + Sm) para a seleção. Incube a placa a 37 ° C por 4 dias.
- Escolha ~ 8-10 colônias individuais de uma estirpe da placa e inocular 3 mL de mídia SS suplementada com 22,8 mM L-cisteína, sulfato ferroso de 3.6 mM, niacina 3,3 mM, 48,8 mM glutationa, ácido ascórbico de 227 mM, heptakis de 1 mg/mL e 100 estreptomicina µ g/mL. Cresce a cultura a 37 ° C em um tambor de cilindro em 60 rpm para 16-24 h.
- No dia seguinte, diluir a 1: 300, 1:120, 1:600 de cultura primária, 1: 60, 01:30 e 01:15 em 3 mL de mídia completada de SS. Incube a cultura a 37 ° C no cilindro do rolo em 60 rpm para 16-24 h.
- Realizar medições de densidade óptica em 600 nm (OD600) para as culturas bacterianas. Usando cubetas de espectrofotômetro, dilua as culturas 01:10 adicionando 0,1 mL das culturas líquidas de 0,9 mL de PBS estéril.
- Selecione uma cultura com OD600≈ 0.8-1.2. Calcule o volume necessário para obter 1 OD (Figura 3). Spin para baixo o volume em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL a 6000 x g por 5 min a 25 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender células bacterianas em 1 mL de PBS estéril para obter uma densidade de 1 OD/mL [1-3 x 109 formadoras de unidades (CFU) /mL].
- Para preparar um inóculo de ~ 5 x 105 de 1,5 x 106 CFUs/rato em 40-50 µ l, vórtice e serialmente, diluir a solução bacteriana (da etapa 2.5) 100-fold em 1 mL de PBS estéril para alcançar ~ 1-3 x 107 CFUs/mL(Figura 4). Transporte de inóculo para o viveiro no gelo.
3. murino de infecção Intranasal modelo
- No viveiro, defina condições de oxigênio e anestesia conforme descrito nas etapas 1.3 e 1.4. Conforme descrito na etapa 1.5, coloque os ratos na câmara para anestesiar. Monitore os animais até a anestesia faz efeito.
- Quando os ratos são anestesiados, remova um animal de cada vez da câmara de indução. Pega o mouse pela nuca do tórax dorsal, por trás dos ombros e pescoço. Posicione a verticalidade do mouse para acessar o nariz.
- Usando uma ponta de pipeta 200 µ l, lentamente aplica 40-50 µ l de inóculo bacteriano para as narinas do mouse (20-25 µ l em cada nare). Segure o mouse até o inóculo inteiro tem sido inalado pelo animal. Se algumas das bolhas inóculo para fora, recolher as bolhas e re-instilar às narinas. Entrega uma quantidade igual de PBS estéril para um grupo de ratos como controlo negativo.
- Como feito em etapas 1.10-1.12, devolver os animais inoculados para sua jaula e monitorar os animais até que eles estejam alerta e em movimento. Retorna a gaiola para seu espaço de habitação original na prateleira. Lave a câmara de indução com oxigênio para remover o isoflurano residual antes de anestesiar o próximo conjunto de animais. Monitore os animais para a pós-infecção 48 h.
- No laboratório, diluições de série da placa do inóculo, em PBS estéril, para verificar as reais CFUs entregue aos ratos. Placa de 0,1 mL das diluições em 10% BG + pratos Sm(Figura 4). Coloque as placas na incubadora a 37 ° C e crescer para 4 dias. Contar e calcular os CFUs de inóculo entregado para o mouse (Figura 4B).
4. a colheita de tecidos animais após a infecção
- Prepare-se para dissecção de rato e colheita de tecidos.
- Esterilize todos os equipamentos (grosseira e fina tesoura, tesoura curva, pinça fina, macacos da pelota e espalhadores de triângulo) necessários para o processamento de tecidos em uma autoclave. Sele as ferramentas em malotes da esterilização. Embrulhe os vidro homogenizacao Homogeneizadores em folha e adicionar a fita de autoclave, para indicar a esterilidade.
- Prepare-se dias de placas de 1 ou 2 ágar antes da colheita de tecidos para garantir que as placas são solidificados antes de usar. Para b. pertussis, use 10% BG + pratos SM Label para o septo nasal, traqueia e pulmão para cada mouse com as diluições desejadas, determinados empiricamente para cada experimento.
- Preenchimento e rótulo tubos de diluição de UFC. Adicione 0,9 mL de PBS estéril para tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL com base no número de órgãos para o processo e diluições por órgão.
- Preenchimento e rótulo de tubos para coleta de tecido:
- Septo nasal e traqueia: encher um tubo de microcentrifuga estéril 1,5 mL com 0,3 mL de caseína estéril de 1% em PBS (Ca2 + e Mg2 +-livre). Loja a 4 ° C.
- Pulmões: adicionar 2 mL de caseína estéril de 1% em PBS para um tubo cônico estéril 15 mL e em 4 ° C. Colher os pulmões para histologia, adicionar 2 mL de formol tamponado neutro a 10% (NBF) e armazenar em RT
- Baço: Adicionar 3 mL de RPMI + 5% FBS para um tubo cônico de 15 mL. Loja a 4 ° C.
- Sangue: rótulo dois conjuntos de tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL, um para sangue total e outro para soro.
- Etanol a 70% fresco deve estar preparado para encher copos e garrafas para dissecação de spray.
- Todos os materiais para o viveiro em um carrinho de transporte no dia da colheita. Limpe o BSC e montar a máquina de anestesia como nos passos 1.3 e 1.4.
- Coloque os ratos para ser dissecado na câmara de indução e, com o fluxo de oxigênio, ligue o isoflurano para 5% e esperar até que os animais estejam inconscientes. Remover os ratos um de cada vez e cervically, deslocar o animal como um método secundário para garantir a morte. Após deslocamento cervical, eutanásia deve ser confirmada pela ausência de uma frequência respiratória e/ou ausência do reflexo de retirada (teste do beliscão do dedo do pé).
- Posicione o mouse, lado ventral virada para cima, a bordo de dissecação e prenda os braços e pernas abertas. Pulverizador para baixo do corpo do mouse com etanol a 70%.
- Usando fórceps, fecho a pele abaixo do abdômen, no centro da pelve. Usando a tesoura afiada, fazer um corte vertical até a mandíbula. Em seguida, dissecar a pele longe da parede peritoneal, empurrando as duas camadas separadas, usando pequenos movimentos com a tesoura fechada. Coloque a pele para os lados da carcaça para criar um campo desobstruído para a colheita de órgãos estéril.
- Segure o peritônio intacto abaixo da caixa torácica em ou em torno do fígado e abri-lo se movendo em direção a caixa torácica. Expor o trato digestivo inferior e mover os dois pontos para a esquerda, revelando o baço. Usando pinça curva, segure o baço e dissecar longe do tecido conjuntivo com uma tesoura. Lugar do baço em um tubo cônico de 15 mL contendo 3 mL de RPMI + 5% FBS e coloque o tubo no gelo.
- Use fórceps para estabilizar a caixa torácica no processo xifoide e abrir o diafragma. Pulmões deveriam desinflar e caem em direção a coluna. Abri a caixa torácica de ambos os lados para remover a placa do peito.
- Isolar e remover o lobo superior do pulmão direito14, cortando as artérias pulmonares e veias. Coloque o lóbulo em um tubo cônico de 15 mL, contendo 10% NBF e coloque o tubo no RT pelo menos 24 h para reparar o tecido. Isole os lóbulos restantes do pulmão direito e o pulmão esquerdo. Coloque os lobos em um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de 1% de caseína em PBS e colocá-lo no gelo.
- Depois de cortar as veias pulmonares e artérias para dissecar para fora dos pulmões, permitir que a cavidade torácica encher com sangue, como o mouse exsanguinates. Usando um pipetman 1ml com ponta, coletar o sangue e transferir para o tubo de microcentrifuga pre-etiquetados 1,5 mL. Coloca o tubo no gelo.
- Em seguida, do pescoço, remova o tecido mole (glândulas parótidas, sublinguais e submandibulares e gânglios linfáticos) que cobre a traqueia. Abra e retire as membranas protetoras em torno da traqueia. Delicadamente, usando uma tesoura e pinça fina, separe a traqueia esôfago e qualquer outro do tecido conjuntivo da parte superior das clavículas para baixo da mandíbula.
- Usando fórceps, segure a traqueia e cortar a traqueia na parte superior da clavícula. Puxe-a traqueia para maximizar a elasticidade e cortar a traqueia na parte inferior da mandíbula bem acima da laringe, isolando o máximo possível (~ 1 cm). Coloque o órgão em um tubo de microcentrifuga pre-etiquetados 1,5 mL com 0,3 mL de 1% de caseína em PBS e colocá-lo no gelo.
- Desafixar o mouse e colocá-lo ventralmente, com o mouse, enfrentando o pesquisador para acesso claro para o nariz. Pulverizar a cabeça do rato com etanol a 70% e, usando as mãos, segure o mouse diretamente atrás do crânio.
- Com uma tesoura, corte a carne macia do focinho, a partir do fundo do nariz e se movendo para cima. Além disso, remova o pelo, pele e bigodes em torno do nariz. Em seguida, com pinças e tesouras curvas, introduza as pontas da tesoura nares com as curvas, apontou para o exterior e abrir a passagem nasal para os olhos, criando uma formação do tipo V.
- Usando a pinça fina, colete o septo nasal e tecidos moles dentro da formação criado. Coloque o tecido em um tubo de microcentrifuga pre-etiquetados 1,5 mL com 0,3 mL de 1% de caseína em PBS e colocá-lo no gelo.
- Elimine a carcaça em um saco de risco biológico. Antes de dissecar o próximo animal, lavar as ferramentas com água desionizada e coloque num copo cheio de etanol a 70%. Remover as ferramentas, sacuda o excesso etanol e então prosseguir com a próxima dissecação
- Disse cada rato seguindo passos 4.3-4.14.
- Processe os tecidos conforme descrito abaixo.
5. processamento de baço
- Para dissociar baços, coloque um filtro de célula de 70 µm em um prato de cultura de tecidos de 60 mm. Despeje o baço e meios de comunicação que acompanha o filtro, usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL. Amasse cuidadosamente o órgão até que ele é completamente dissociado e filtrado através de filtro de célula.
- Lave o filtro com 3 mL de RPMI + 5% FBS para o prato de cultura de tecidos. Recolher a suspensão de eritrócitos e colocá-lo em seu tubo original de 15 mL. Centrifuga os tubos a 450 x g por 5 min a 4 ° C para as células de Pelotas.
- Aspirar ou decante o sobrenadante e lisar os glóbulos vermelhos por resuspending a pelota em 2 mL de tampão de potássio (ACK) cloreto de amônio (cloreto de amônio de 150 mM, 10 mM, bicarbonato de potássio, EDTA de sódio 0,1 mM). Incube durante 3 min no RT (25 ° C).
- Encher os tubos até 8 mL com RPMI + 5% FBS e centrifugar tubos a 450 x g por 5 min a 4° C. Aspirar ou decante o sobrenadante. Resuspenda as pelotas de célula em 5 mL de RPMI + 5% FBS e contagem os splenocytes usando um hemocytometer e um microscópio.
- Calcule o volume de células necessárias para estimular a 2,5 x 106 células por poço. Em uma placa de 48, as sementes das células em 0,5 mL de meios de comunicação de células T (RPMI 1640 + 10% FBS, 10 µ g/mL gentamicina e 50 µM β-Mercaptoetanol) por poço.
- Com base no cálculo acima, colocar o volume necessário de suspensão de células em um tubo fresco e pelota-células a 450 x g por 5 min a 4 ° C.
- Resuspenda o pellet no volume necessário de mídia de células T. Para um modelo de infecção de b. pertussis , testar a resposta de citocinas antígeno-específicos aos antígenos da vacina: pertactin (Prn) e adesão de hemaglutinina filamentosa (FHA). Portanto, 3 tratamentos são necessários: 1) sem estimulação (NS, como controle negativo), Prn) 2 e 3) FHA. Para o ensaio, 7,5 x 106 células em 1,5 mL de mídia de células T é necessário (2,5 x 106 células por 0,5 mL).
- Alíquota 0,5 mL de suspensão de célula em uma placa de 48.
- Para estimular as células, misture antígenos em 2 vezes a concentração desejada na mídia de células T. Concentrações finais do Prn e FHA = 1 µ g/mL e 0,5 µ g/mL, respectivamente. Portanto, misture 2 µ g/mL Prn ou 1 µ g/mL FHA em 0,5 mL. Então, alíquota 0,5 mL do meio de estimulação em cada designado, diluindo o tratamento de antígeno para 1x, em um volume final de 1 mL em cada poço.
- Incube as placas a 37 ° C em 5% CO2. Colete sobrenadantes no dia 7 e alíquota 0,5 mL dos sobrenadantes em tubos microcentrifuga pre-etiquetados. Armazene as amostras em um-20 ° C até que esteja pronto para testar o antígeno-específicas citocinas por ELISA (Figura 6).
6. processamento de pulmões
- Transferi os pulmões (em 2 mL de 1% de caseína em PBS) para um estéril, homogenizador de homogenizacao de 15 mL. Pilão de uso para homogeneizar o tecido. Dissocia até permanecem sem grandes partículas de tecido. Coloque a suspensão homogeneizada volta no tubo de 15 mL original.
- Remover um 0,3 mL alíquota para chapeamento CFUs e centrifugar o homogenate a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Coletar e alíquota o sobrenadante em alíquotas de 0,5 mL em pre-etiquetada microcentrifuga tubos. Armazene as amostras em um-20 ° C até a análise de citocinas por ELISA.
- Prepare diluições escolhidas serialmente diluindo 0,1 mL da suspensão de pulmão homogeneizado em tubos de diluição (0,9 mL de PBS estéril). Placa de 0,1 mL das diluições empiricamente escolhidas para pre-etiquetados BG 10% + Sm placas e propagação usando propagador do triângulo estéril.
- Incube as placas a 37 ° C, em ar ambiente por 4 dias.
- Contar e calcular CFUs/pulmão (Figura 6). Brevemente, multiplica números CFU recuperados pelo factor de diluição da placa, em seguida, também pelo volume total, em que o órgão foi processado. Os cálculos do UFC então são transformados em valores de Log10 para cada animal e graficamente.
- Placas com colônias de 30-300 são contadas facilmente e com precisão. Placas com menos de 6 colônias não devem ser usadas para cálculos, desde que um número tão baixo de colônia apresenta erro15. Para obter um limite inferior de detecção, o volume total, em que um órgão foi homogeneizado é dividido pelo volume usado de detectar em uma placa do homogeneizado não diluído (ex., volume total de 2 mL dividido por 0,1 mL de homogeneizado não diluído é igual a do limite inferior de 20 CFUs detectáveis).
7. processamento do septo Nasal e traqueia
- Homogeneizar o tecido no 0,3 mL de 1% PBS/caseína com sedimento judiava Homogeneizadores motor sem fios. Homogeneizar o tecido para 0,5-1 min até que o tecido é em grande medida dissociado. Bactéria deve ser derramada em suspensão.
- Prepare-se 10 escolhido x diluições por diluição serial de 0,1 mL da suspensão homogeneizada em tubos de diluições contendo 0,9 mL de PBS estéril. Ponto 0,1 mL de cada diluição para pre-rotulado BG 10% + Sm placas e espalhar a suspensão usando um propagador do triângulo que foi esterilizado por uma lavagem de 70% de etanol e chama.
- Incube as placas a 37 ° C, em ar ambiente por 4 dias.
- Contar e calcular CFUs/órgão como na etapa 6.5 (Figura 6). Para obter um limite inferior de detecção, o volume total, em que um órgão foi homogeneizado é dividido pelo volume utilizado para ponto em uma placa do homogeneizado não diluído (ex., volume total de 0,3 mL dividido por 0,1 mL de iguais não diluídos o limite de 3 detecto uma CFUs ble).
8. processamento de sangue
- Centrifuga os tubos contendo sangue isolado a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C para granular células vermelhas do sangue.
- Com cuidado, tire o soro sobrenadante e pipetar para um tubo de microcentrifuga soro previamente rotulado. Armazenar os tubos em-20 ° C até que esteja pronto para uma análise mais aprofundada a jusante (i. e., ELISA de Ig total e específica).
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Representative Results
O modelo descrito mostra um método para avaliar a eficiência de vacina e respostas imunes durante as interações patógeno-hospedeiro. A Figura 1 mostra o calendário de vacinas representante usado para imunizar e infectar camundongos e colheita de tecidos para análise. A Figura 2 demonstra a configuração do sistema de anestesia empregado para induzir os ratos, permitindo que os investigadores entregar imunizações e inóculo bacteriano. A Figura 3 mostra o exemplo OD600 medições e cálculos para alcançar uma 1 suspensão bacteriana de OD para preparar 100 vezes diluído inóculo bacteriano para ser entregue aos ratos. A Figura 4 mostra a preparação do inóculo utilizada para a infecção, o esquema de chapeamento de diluições em série e os cálculos do exemplo usados para enumerar CFUs entregue aos ratos com base no chapeamento de diluições em série. A Figura 5 mostra respostas antígeno-específicas recordação eliciadas após sete dias de estimulação com o antígeno da vacina FHA. Imunize células de baço do grupo vacina de combinação, Alum/FHA/BcfA, produzidos relato e IL-17, enquanto significativamente ácido IL-5. Este efeito promove uma polarização Th1/Th17 da resposta imune durante a infecção de b. pertussis . Níveis de citocinas foram produzidos pela incubação de células de baço imunizado com mídia sozinha, indicando que as citocinas detectadas eram respostas de recordação para a imunização (dados não mostrados). Figura 6 mostra um exemplo de enumeração de UFC de bactérias recuperado de tecidos das vias respiratórias de um rato imunizado, usando diluições em série de b. pertussis homogenates tecido banhado em 10% BG + Sm placas. Contagens de crus foram multiplicadas pelo volume de fator e total a diluição do tecido lisado e os dados eram log transformado. CFUs de animais imunizados são então comparados com animais não imunizados (ingênuo) para determinar o efeito protector da vacina.
Figura 1 : Calendário de vacinas representativa. Ratos são imunizados no dia 0 e em seguida impulsionou ~ 4 semanas mais tarde (d28) com o apropriado aPV. Infecção dos camundongos com b. pertussis ocorre ~ 2 semanas (d42) após aumento de ratos. Após a infecção dos animais são mortos em vários inoculação pós (d43-56) de dias. Tecido e sangue são coletadas para análise a jusante (EG., UFC enumeração, citocinas e anticorpos ELISA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: instalação de máquina de anestesia. É mostrado um vaporizador anestésico com sistema de câmara e ao tesouro de indução anexado (dentro do gabinete de segurança biológica). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Preparação de 1 suspensão bacteriana600 de OD. Foram obtidos valores de600 OD diluídos primária b. pertussis culturas. Uma cultura em fase de registro foi usada para calcular o volume necessário para obter uma cultura na cultura de600 1 OD para infecção. Brevemente, uma OD600 de 1 foi dividido pelo OD calculado600 da cultura desejada para obter um volume igual a 1 OD deve ser usado para infecção. Brevemente, um OD600 de 1 foi dividido pelo OD600 calculado da cultura desejada para obter um volume igual a 1 OD deve ser usado para infecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Cálculo de inoculação intranasal entregue. (A) esquema de diluição serial do inóculo de infecção que é diluída a 10-4, 10-5e 10-6. Estas diluições são banhadas em 10% BG + Sm, incubadas durante 4 dias a 37 ° C e então contadas. (B) contagens de 10-4, 10-5e 10-6 diluições são usadas para calcular CFUs practicar entregues. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Produção de citocinas pelas células do baço imunizados com Alum/FHA FHA, BcfA/FHA e Alum/BcfA/FHA. Células dissociadas foram cultivadas com FHA por 7 dias. Sobrenadantes foram testadas por sanduíche ELISA para (A) IFN-γ, IL-17 (B) e (C) IL-5. Barras de erros são expressos como desvio-padrão da média de cada grupo, n = 5 por grupo. p < 0,001. A figura é uma adaptação de uma anterior publicação10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : B. pertussis CFUs e cálculos de tecido colhido de ratos. (A) b. pertussis CFUs do tecido do mouse homogeneizada. diluições em série 0,1 mL incubadas a 37 ° C durante 4 dias. (B) cálculos baseados CFUs obtidos de traqueia homogeneizada. CFUs foram multiplicadas pela respectiva diluição e em seguida multiplicados por 10 para alcançar CFUs por mL. A fim de obter CFU por órgão, os CFUs por mL foram multiplicados pelo volume total em que o órgão era homogeneizado (0,3 mL). Os CFUs por órgão foram então log transformado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo completo descrito aqui para estudar a imunidade induzida pela vacina contra a infecção de b. pertussis também permitirá a avaliação das respostas de anfitrião a uma variedade de outros patógenos. O protocolo descreve os métodos para entregar imunizações, determinar a seguinte eficácia de vacina patógeno desafio e dissecação paralela da função imune. Na adaptação do protocolo a fim de estudar outros patógenos, vários parâmetros precisaria ser modificado. Estes incluem, mas não estão limitados a, o modo de anestesia do animal, composição de vacina, dose e via de administração. Além disso, a dose e via de administração do patógeno desafiado de interesse, tecido selecionado para a colheita e a jusante avaliação das respostas imunes são fatores que podem ser modificados para a patógeno/doença de interesse.
O modelo do rato da infecção por b. pertussis é amplamente utilizado e é um excelente modelo para a patogênese e Vacinologia estudos16,17,18,19,20. Murino modelos apresentam muitas semelhanças com a infecção humana, incluindo: i) bactérias são limitadas ao trato respiratório e multiplicam rapidamente, ii) jovens animais exposição relativamente graves infecções, iii) boa correspondência entre as vacinas que protegem filhos contra coqueluche e aqueles que proteger camundongos contra a infecção e iv) b. pertussis-células T e anticorpos específicos mediam imunidade protetora natural e induzida pela vacina21,22, 23 , 24. portanto, o modelo murino permite o estudo dos efeitos da imunização na desminagem bacteriana25. Outra vantagem de usar ratos para infecções de b. pertussis modelo é a disponibilidade de nocaute geneticamente modificado e animais transgénicos para o estudo críticos jogadores em respostas de imune induzida pela vacina19,26.
A maioria das vacinas é administrada por via parentérica, especificamente através da rota intramuscular (i.m.). Esta rota é preferida porque ele provoca imunidade sistêmica com mínimo local reactogenicity27,28,29. Alternativas para injeções intramusculares incluem subcutânea (s.c.) ou intraperitoneal (i.p.) de entrega, que também induzem respostas sistêmicas. Rotas subcutâneas também são atraentes, como há uma grande população de residente células apresentadoras de (APC) dentro da derme com acesso vascular e linfático30. No entanto, intradérmica entrega não tem sido explorada para a vacina contra coqueluche. Entrega intraperitoneal de aPV experimental gera imunidade similar a imunização intramuscular31 e é uma rota de injeção confiável para estudos murino, embora pouco prático para uso clínico.
Este protocolo utiliza a rota de imunização de i.m., que fornece proteção nos pulmões, mas não a nasofaringe32. Estudos recentes têm mostrado que uma vacina intranasal (óssea) promove uma resposta imune local, mucosa que protege a parte superior e inferior no trato respiratório, particularmente no nariz, que serve como um reservatório de bactérias que podem ser transmitidas posteriormente para outros hospeda o33. Além disso, a imunização óssea foi mostrada para gerar memória residente de tecido que não é gerada por imunização sistêmica33,34. Portanto, a escolha da via de administração de vacina depende muito do tipo de vacina e a resposta imunológica necessária para proteger contra a doença.
A via intranasal de entrega bacteriana descrita neste protocolo é um método amplamente utilizado para patógenos respiratórios que com segurança e consistentemente proporciona um inóculo bacteriano diretamente no tracto respiratório de ratos anestesiados. Nosso protocolo usa uma dose de alto volume (40-50 µ l) que é inalada a nasofaringe e viaja para o trato respiratório inferior. Um inóculo de baixo volume (10-20 µ l) que coloniza nasofaringe, mas colonização dos pulmões será mínimo35. No entanto, a inalação de b. pertussis-contendo gotículas de ar é considerado o modo natural de infecção de indivíduos e de transmissão. Esta via de administração tem sido utilizada em vários modelos animais36,37. Para atingir níveis de infecção para direcionar a inoculação óssea comparáveis, consideravelmente mais elevadas concentrações de inóculo bacteriano (109-1011 CFUs/mL) e tempo de entrega são necessários38.
Para estabelecer a colonização do trato respiratório de rato, este protocolo utiliza bactérias frescas, cultivadas em cultura líquida para garantir que os utilizados para inoculação de bactérias estão na fase virulenta e estiver replicando na fase de registro. Experimentadores também podem usar um inóculo de estoques pré-titulada, congelados. Isto permite um conhecimento sobre os CFUs sendo administrado para o mouse. No entanto, as bactérias nestes inoculo podem ser na fase não-virulenta, que pode reduzir a eficiência do trato respiratório colonização39. Após a infecção, o inóculo é banhado a fim de determinar o bacteriano CFUs entregues ao rato. Os investigadores também podem optar por placa inóculo antes da infecção na vivo para assegurar a viabilidade das bactérias e confirmar a dose do inóculo.
Após a infecção, CFUs bacterianas são enumeradas pelo tecido isolado de ratos sacrificados em um Commit predeterminado de homogeneização. Uma desvantagem deste método é a sua incapacidade para rastrear cineticamente patógeno CFUs para um conjunto especificado de ratos. Pesquisadores devem usar vários grupos de animais sacrificados em diferentes momentos para examinar a restrição bacteriana induzida pela vacina. O número de ratos em cada experimento irá variar dependendo do número de momentos para examinar e o tamanho do efeito desejado. Isto pode apresentar maior variação biológica. Integração de um gene repórter bioluminescente ou fluorescente no patógeno de interesse permitirá monitoramento invasivo do crescimento e disseminação no vivo durante todo o curso da infecção35. Esse método reduz a variação biológica e minimiza o número necessário de animais experimentais, uma vez que dados longitudinais são obtidos a partir do mesmo grupo de animais.
O protocolo de dissociação e homogeneização do tecido empregado aqui para os tecidos do trato respiratório também é aplicável para a enumeração de colônia de outros tecidos sólidos tais como fígado, rim, intestino ou bexiga para interrogar os sítios de infecção e disseminação de patógenos de interesse.
Juntamente com a enumeração de UFC, este protocolo permite a caracterização das respostas imunes provocada pela infecção natural e a imunização. Especificamente, quantificação de citocinas produzidas sistemicamente e permitir localmente para a determinação dos perfis de imunes eficazes resultante da imunização. Citocinas são imunomoduladores que promovem o influxo celular de tecidos afetados e ativação da imunidade celular, bem como fornecem ajuda para a geração de respostas humoral10,40,41. Usando este protocolo, citocinas produzidas em vários compartimentos de tecido, como o pulmão e o baço, são detectadas. Embora não mostrado aqui, o protocolo de estimulação é igualmente aplicável para avaliação das respostas nos linfonodos de drenagem.
ELISA análise permite a deteção e a quantificação de citocinas em sobrenadantes de mídia ou suspensões mistas (i. e., homogenates ou soro), gerando informações a nível de população e caracterizando o antígeno-específicas cytokine respostas de um cultura de células mistas em momentos designados. Em contraste, métodos como ELISPOT ou citometria de fluxo permite a avaliação do número de células que produzem uma substância e o nível de expressão por célula42,43. Embora não descrito aqui, esses métodos são também aplicáveis à detecção de pilhas de B antígeno-específicas. A combinação da CFU enumeração e testes imunológicos fornecem um quadro completo da resposta à imunização.
Outras análises que podem ser executadas usando esse protocolo de infecção incluem epigenéticas ou análise de transcriptomic quando o DNA e RNA é obtido a partir de tecidos de interesse44. Assim, com a reflexão sobre a composição apropriada da vacina, imunização e rota de entrega do patógeno, este protocolo é versátil em sua implementação e facilmente adaptados para vários modelos de infecção. Essas técnicas também são aplicáveis às doenças não-infecciosas (i.e., cancro, esclerose múltipla, asma, doenças auto-imunes), onde as vacinas são utilizadas como uma modalidade terapêutica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por fundos de 1R01AI125560-01 e start-up da The Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2L induction chamber | Vet Equip | 941444 | |
| Fluriso | Vet One | V1 501017 | any brand is appropriate |
| Bordet Gengou Agar Base | BD bioscience | 248200 | |
| Casein | Sigma | C-7078 | |
| Casamino acids | VWR | J851-500G | Strainer Scholte (SS) media components |
| L-Glutamic acid | Research Products Int | G36020-500 | |
| L-Proline | Research Products Int | P50200-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-10 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Fisher | M2670-500G | |
| Calcium Chloride | Fisher | C75-500 | |
| Tris base | Fisher | BP153-1 | |
| L-cysteine HCl | Fisher | BP376-100 | SS media suplements |
| Ferrous Sulfate heptahydrate | Sigma | F-7002 | |
| Niacin | Research Products Int | N20080-100 | |
| Glutathione | Research Products Int | G22010-25 | |
| Ascorbic acid | Research Products Int | A50040-500 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | any US source, non-heat inactivated |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15710064 | |
| B-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| 15mL dounce tissue grinder | Wheaton | 357544 | any similar brand is appropriate |
| Cordless Hand Homogenizer | Kontes/Sigma | Z359971-1EA | any similar brand is appropriate |
| Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders | any brand is appropriate | ||
| 3mL syringes | BD bioscience | 309657 | |
| 15mL conical tubes | Fisher | 339651 | |
| 1.5mL microfuge tubes | Denville | C2170 | |
| 70um cell strainers | Fisher | 22363548 | |
| 60mm plates | ThermoFisher Scientific | 130181 | |
| 48-well tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 08-772-1C | |
| 1mL insulin syringe 28G1/2 | Fisher Scientific/Excel Int. | 14-841-31 | |
| Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-21 | |
| Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-77 | |
| Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-172-09 |
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